Name: establishing 3d endometrial organoids from the mouse uterus
Uploaded: 2023-01-06T13:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus at JoVE.com

אנו מודים לד"ר סטפני פנגס ולד"ר מרטין מ. מצוק (M.M.M.) על הקריאה הביקורתית והעריכה של כתב היד שלנו. המחקרים נתמכו על ידי המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם ע"ש יוניס קנדי שרייבר R00-HD096057 (D.M.), R01-HD105800 (D.M.), R01-HD032067 (M.M.M.) ו-R01-HD110038 (M.M.M.), ועל ידי מענק התמיכה של מרכז הסרטן NCI- P30 (NCI-CA125123). דיאנה מונסיוויס, Ph.D. מחזיקה בפרס הריון מהדור הבא מקרן בורוז וולקום.

טיפול בעכבר ומחקרים ניסיוניים בוצעו תחת פרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של מכללת ביילור לרפואה והנחיות שנקבעו על ידי מדריך NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.
1. בידוד אפיתל הרחם מעכברים בשיטות אנזימטיות ומכניות
הערה: ?...

במאמר זה נתאר שיטות ליצירת אורגנואידים אפיתליאליים של רירית הרחם מרירית הרחם של עכברים ואת הפרוטוקולים המשמשים באופן שגרתי לניתוח שלהם במורד הזרם. אורגנואידים רירית הרחם הם כלי רב עוצמה לחקר המנגנונים השולטים במחלות הקשורות לרירית הרחם, כגון אנדומטריוזיס, סרטן רירית הרחם וכשל בהשתלה. מח...

רירית הרחם - רקמת הרירית הפנימית של חלל הרחם - היא רקמה ייחודית ודינמית מאוד הממלאת תפקידים קריטיים בבריאות הרבייה של האישה. במהלך חיי הרבייה, רירית הרחם טומנת בחובה פוטנציאל לעבור מאות מחזורים של התפשטות, התמיינות ופירוק, המתואמים על ידי הפעולה המרוכזת של הורמוני השחלות - אסטרוגן ופרוגסטרון. מחקרים על עכברים מהונדסים גנטית חשפו מנגנונים ביולוגיים בסיסיים העומדים בבסיס תגובת רירית הרחם להורמונים ובקרה על השתלת עוברים, דצידואליזציה של תאים סטרומליים והריון1. עם זאת, מחקרים במבחנה היו מוגבלים בשל קשיים בשמירה על רקמות רירית הרחם העיקריות של עכברים שלא עברו טרנספורמציה בתרביות תאים דו-ממדיות מסורתיות 2,3. ההתקדמות האחרונה בתרבית של רקמות רירית הרחם כמערכות איברים תלת-ממדיות, או אורגנואידים, מהווה הזדמנות חדשה לחקור מסלולים ביולוגיים השולטים בהתחדשות והתמיינות תאי רירית הרחם. מערכות אורגנואידיות של רירית הרחם של עכברים ובני אדם פותחו מאפיתל רירית הרחם טהור עטוף במטריצות שונות4,5, בעוד רירית הרחם האנושית תורבית כתרביות אפיתל/סטרומליות ללא פיגומים6,7, ולאחרונה כמכלולי אפיתל/סטרומלים ללא קולגן8 . פוטנציאל הצמיחה וההתחדשות של תרביות אפיתל אורגנואידיות נתמך על ידי קוקטייל מוגדר של גורמי גדילה ומעכבי מולקולות קטנות שנקבעו אמפירית כדי למקסם את הצמיחה וההתחדשות של האורגנואידים 4,5,9. יתר על כן, היכולת להקפיא ולהפשיר אורגנואידים של רירית הרחם מאפשרת בנקאות ארוכת טווח של אורגנואידים רירית הרחם מעכברים ובני אדם למחקרים עתידיים.
עכברים מהונדסים גנטית חשפו את מסלולי האיתות המורכבים השולטים בתחילת ההריון ובדצידוליזציה, ושימשו כמודלים של אובדן הריון, סרטן רירית הרחם ואנדומטריוזיס. מחקרים גנטיים אלה הושגו במידה רבה עם מחיקה ספציפית לתאים של אללים מסוג loxP ("floxed") באמצעות רקומבינאזות cre הפעילים במיוחד ברקמות הרבייה הנשיות. מודלים אלה של עכברים כוללים את קולטן הפרוגסטרון-cre10 הנמצא בשימוש נרחב, בעל פעילות רקומבינאז חזקה ברקמות אפיתל רירית הרחם והסטרומלית, לקטופרין i-cre, הגורם לרקומבינציית אפיתל רירית הרחם בעכברים בוגרים 11, או Wnt7a-cre, המעורר מחיקה ספציפית לאפיתל ברקמות שמקורן במולריאן12 . גידול רקמות רירית הרחם ממודלים של עכברים מהונדסים גנטית כאורגנואידים תלת-ממדיים סיפק הזדמנות מצוינת לחקור את הביולוגיה של רירית הרחם ולהקל על זיהוי גורמי גדילה ומסלולי איתות השולטים בחידוש תאי רירית הרחם ובהתמיינות13,14. שיטות לבידוד ותרבית של רקמת רירית הרחם של העכבר מתוארות בספרות ומדווחות על שימוש באסטרטגיות אנזימטיות שונות לבידוד אפיתל הרחם להתרבות הבאה של אורגנואידים אפיתל רירית הרחם4. בעוד שספרות קודמת מספקת מסגרת קריטית לפרוטוקולים של תרביות אפיתל רירית הרחם 4,5,6, מאמר זה מספק שיטה ברורה ומקיפה ליצירה, שמירה, עיבוד וניתוח של אורגנואידים אלה. סטנדרטיזציה של טכניקות אלה חשובה להאצת ההתקדמות בתחום הביולוגיה של הרבייה של נשים. כאן אנו מדווחים על מתודולוגיה מפורטת לטיהור אנזימטי ומכני של רקמת אפיתל רירית הרחם של עכבר עבור התרבית הבאה של אורגנואידים רירית הרחם בפיגום מטריצת ג'ל. אנו מתארים גם את המתודולוגיות לניתוחים היסטולוגיים ומולקולריים במורד הזרם של אורגנואידים אפיתליאליים של רירית הרחם של עכבר עטוף במטריצת ג'ל.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Organoid Media Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin from Bovine Pancreas</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1426-1G</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12634010</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17502048</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27&#8482; Supplement (50X), minus vitamin A</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12587010</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>100 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td>1.25 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030024</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N0636-100G</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALK-4, -5, -7 inhibitor, A83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td>500 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-10C</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human Rspondin-1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-38</td>
			<td>500 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human FGF-10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human HGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-39</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WNT3a</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>5036-WN</td>
			<td>200 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other supplies and reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0130-1G</td>
			<td>5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>DN25-100MG</td>
			<td>2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190-250</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14170112</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#160;Polystyrene Microplates (24-Well)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#08-772-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#160;Polystyrene Microplates (12-Well)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#0877229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell Strainers, 40 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#08-771-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA MiniPrep (50 &#181;g)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>11-331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, HEPES, no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11039021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Charcoal stripped</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F6765-500ML</td>
			<td>2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Estratiol (E2)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E1024-1G</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 16% in aqueous solution, EM Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>15710</td>
			<td>4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia Cassette 1 Slotted Tissue Cassettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1000961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia Stainless-Steel Embedding Base Molds</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>64-010-15&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 proof (100%)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-032-601&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoclear</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-899-90147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-277-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia Nylon Biopsy Bags</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>6774010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoGel Specimen Processing Gel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83009-992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin solution Premium</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95057-844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y (yellowish) solution Premium</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95057-848</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS Buffer, 20X, pH 7.4</td>
			<td>GenDEPORT</td>
			<td>T8054</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBST (10X), pH 7.4</td>
			<td>GenDEPORT</td>
			<td>T8056</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0759-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate tribasic dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S4641-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2153-100G</td>
			<td>3%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Solution (1 mg/mL)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62248</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Nail Polish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1849418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22037246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Micro Cover Glasses</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript VILO Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11755050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green PCR Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4364346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krt8 Antibody (TROMA-I)&#160;</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>TROMA-I&#160;</td>
			<td>1:50 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin Antobody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>5741S</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary 
			Antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-21209</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbin IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary 
			Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-21206</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEISS Stemi 508 Stereo Microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEISS Axio Vert.A1 Inverted Routine Microscope with digital camera</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Sequence</td>
			<td>Forward (5&#39;-3&#39;)</td>
			<td>Reverse (5&#39;-3&#39;)</td>
			<td>_</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipocalin 2 (Lcn2)</td>
			<td>GCAGGTGGTACGTTGTGGG</td>
			<td>CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactoferrin (Ltf)</td>
			<td>TGAGGCCCTTGGACTCTGT</td>
			<td>ACCCACTTTTCTCATCTCGTTC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone (Pgr)</td>
			<td>CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC</td>
			<td>TAACTTCAGACATCATTTCCGG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase (Gapdh)</td>
			<td>CAATGTGTCCGTCGTGGATCT</td>
			<td>GCCTGCTTCACCACCTTCTT</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing 3d endometrial organoids from the mouse uterus

רקמת רירית הרחם מסדרת את החלל הפנימי של הרחם ונמצאת תחת שליטה מחזורית של אסטרוגן ופרוגסטרון. זוהי רקמה המורכבת מאפיתל לומינלי ובלוטתי, תא סטרומלי, רשת כלי דם ואוכלוסיית תאי חיסון מורכבת. מודלים של עכברים היו כלי רב עוצמה לחקר רירית הרחם, וחשפו מנגנונים קריטיים השולטים בהשתלה, בהשליה ובסרטן. הפיתוח האחרון של תרביות אורגנואידיות רירית הרחם התלת-ממדיות מציג מודל חדשני לניתוח מסלולי האיתות העומדים בבסיס הביולוגיה של רירית הרחם. ביסוס אורגנואידים של רירית הרחם ממודלים של עכברים מהונדסים גנטית, ניתוח התמלילים שלהם והדמיה של המורפולוגיה שלהם ברזולוציה של תא בודד הם כלים חיוניים לחקר מחלות רירית הרחם. מאמר זה מתווה שיטות לביסוס תרביות תלת-ממדיות של אפיתל רירית הרחם מעכברים ומתאר טכניקות לכימות ביטוי גנים ולניתוח ההיסטולוגיה של האורגנואידים. המטרה היא לספק משאב שניתן להשתמש בו כדי לבסס, לתרבת ולחקור את ביטוי הגנים והמאפיינים המורפולוגיים של אורגנואידים אפיתליאליים רירית הרחם.

תמונות ניגודיות פאזה של אורגנואידים רירית הרחם של עכבר יצרנו אורגנואידים מאפיתל רירית הרחם של עכבר WT, כפי שמתואר בפרוטוקול המצורף (ראו תרשים באיור 1). בעקבות דיסוציאציה אנזימטית של אפיתל רירית הרחם של העכבר, יריעות האפיתל הופרדו מכנית מהתאים הסטרומליים של הרחם ו...

Watch this Scientific Journal Video about Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus at JoVE.com

Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיות לביסוס אורגנואידים אפיתליאליים של רירית הרחם של עכברים לביטוי גנים וניתוחים היסטולוגיים.

הקמת אורגנואידים 3D רירית הרחם מרחם העכבר

Endometrial tissue lines the inner cavity of the uterus and is under the cyclical control of estrogen and progesterone. It is a tissue that is composed of ...

פרוטוקול זה משמעותי מכיוון שהוא מראה מתודולוגיה שלב אחר שלב לבידוד אפיתל הרחם הטהור ביותר מרחם העכבר לתרבית של אורגנואידים רירית הרחם. שיטה זו משתמשת ביעילות בדיסוציאציה אנזימטית ומכנית כדי לבודד אפיתל הרחם. הטכניקות יועלו כדי לבסס, לטפל ולנתח אורגנואידים אפיתל רירית הרחם שמקורם באפיתל המבודד.יש להתחיל בהפשרת מטריצת הג'ל על הקרח למשך כשעה עד שעתיים לפני השימוש. לאחר מכן נתחו את העכבר המומת על ידי ביצוע חתך בקו האמצע על הבטן באמצעות מספריים, וקילוף עדין של העור לאחור כדי לחשוף את שכבת הצפק שמתחת. אתר את קרני הרחם על ידי הזזה עדינה של כריות שומן הבטן הצידה והחזק את קרני הרחם בצומת צוואר הרחם לפני חיתוך אותם לאורך השומן המזנטרי.לאחר כריתה של רחם העכבר, להסיר ביסודיות רקמת שומן מן קרן הרחם עם מספריים קטנים. לאחר הסיום, חותכים כל קרן רחם לשברים קטנים, שכל אחד מהם מודד כארבעה עד חמישה מילימטרים. מניחים את כל שברי הרחם מרחם אחד לבאר אחת מתוך צלחת 24 באר המכילה 0.5 מיליליטר של 1% טריפסין.לאחר מכן דגרו את צלחת 24 הבאר באינקובטור תרבית רקמה לח של 37 מעלות צלזיוס למשך כשעה להפרדה אנזימטית של אפיתל רירית הרחם מהסטרומה שמתחת. לאחר הדגירה, מעבירים את שברי הרחם לצלחת תרבית רקמה של 35 מילימטר המכילה מיליליטר אחד של תמיסת אגירת פוספט של דולבקו או DPBS. לאחר מכן, הפרד את אפיתל הרחם מצינור הרחם תחת מיקרוסקופ דיסקציה על ידי החזקת קצה אחד של שבר הרחם עם המלקחיים והפעלת קצה הפיפטה בעדינות לאורך השבר, סחיטת האפיתל מהקצה השני של צינור הרחם.לאחר מכן התבונן ביריעות האפיתל המופרדות מקטע הרחם תחת מיקרוסקופ הנתיחה. לאחר מכן, בעדינות להעביר את כל יריעות אפיתל לתוך אותו צינור 1.5 מיליליטר באמצעות פיפטה מיליליטר אחד. ו גלולה את יריעות אפיתל מנותקות על ידי צנטריפוגה ב 375 x גרם במשך חמש דקות.הסר בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור התא והשהה את כדור התא ב-0.5 מיליליטר של 2.5 מיליגרם למיליליטר קולגן ועוד שני מיליגרם למיליליטר של תמיסת DNA. פיפטה למעלה ולמטה כ-10 פעמים או עד להשגת השעיה של תא בודד. לאחר מכן, הוסיפו 0.5 מיליליטר של DMEM F/12 בתוספת 10% סרום בקר עוברי או FBS בתוספת אנטיביוטיקה וצנטריפוגה של התאים במשך חמש דקות ב-375 x גרם.הסר את הסופר-נטנט, השהה את התאים במיליליטר אחד DMEM/F12 בתוספת 10% FBS בתוספת אנטיביוטיקה וצנטריפוגה של התאים. מניחים את מטריצת הג'ל על קרח עד שהיא מוכנה. לאחר מכן, הסר את הסופרנטנט מתאי הצנטריפוגה והשעה מחדש את גלולת התא תוך שימוש בנפח של פי 20 מנפח מטריצת הג'ל מבלי להציג את הבועות.אפשרו לתרחיף תא המטריצה של הג'ל לשקוע בטמפרטורת החדר למשך כ-10 דקות. ברגע שתרחיף תא מטריצת הג'ל הופך לג'ל מוצק למחצה, השתמש במיקרופיפט P200 עם קצה רחב של 200 מיקרוליטר ושאף בעדינות 25 מיקרוליטר של תרחיף תא מטריצת הג'ל. יש לחלק שלוש כיפות נפרדות של 25 מיקרוליטר לכל באר של צלחת 12 באר ולאפשר למטריצת הג'ל לרפא במשך 15 דקות ואינקובטור תרבית רקמה לחות של 37 מעלות צלזיוס.לאחר שמטריצת הג'ל נרפאת, הוסיפו 750 מיקרוליטרים של מדיום אורגנואידי לכל באר המכילה כיפת מטריצת ג'ל, ואינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממה של תרבית רקמה לחה. תמונות ניגודיות פאזה של אורגנואידים של רירית הרחם של עכברים הראו כי הפרדת התאים האפיתל והסטרומליים הניבה דגימות עם לא יותר מ-10% עד 15% זיהום של סוג התא הנגדי. תאי אפיתל רירית הרחם הורכבו לאורגנואידים תוך שלושה עד ארבעה ימים.האורגנואידים הקבועים של פורמלין פרפין משובצים בחתך הודגמו על ידי כתמי המטוקסילין ואאוזין, שהציגו את השכבה היחידה של אפיתל ומרכזים חלולים, הלומן של האורגנואידים. הדמיית המיקרוסקופ הפלואורסצנטי הראתה כי כל התאים באורגנואידים היו ציטוקרטין 8-חיובי והכילו DAPI, מה שמצביע על כך שקיבוע, הטבעה ועיבוד של האורגנואידים רירית הרחם תואמים לאימונוסטינינג מבוסס נוגדנים. ה-PCR הכמותי בזמן אמת הראה כי הגירוי עם 10 אסטרדיול ננומולרי הגביר את הביטוי של ליפוקלין 2, לקטופרין וקולטן פרוגסטרון באורגנואידים האפיתליים, מה שמצביע על כך שניתן להשתמש בהצלחה באורגנואידים אפיתליאליים של רירית הרחם כדי למדוד את השינויים בביטוי הגנים בתגובה לאסטרדיול.חשוב לוודא כי הפרדה ברורה של אפיתל רירית הרחם מתקבלת במהלך שלב הדיסוציאציה המכנית. יש להיות מסוגלים להתבונן באפיתל היוצא מצינור הרחם. שיטות אחרות כוללות הקמת אורגנואידים אפיתל על ידי אנקפסולציה לתוך מטריצת ג'ל.אם תרצה, ניתן לעכל עוד יותר את התא הסטרומלי כדי ליצור תרביות שיתוף סטרומליות אפיתל תלת-ממדיות. השיטה יכולה לעזור לענות על שאלות על האותות השולטים בחידוש רירית הרחם. זה יכול לעזור לטפל במחלות אצל נשים, כגון אנדומטריוזיס, אובדן הריון וסרטן.

Research

JoVE Journal

Biology

Intravitreous Injection for Establishing Ocular Diseases Model

הזרקת Intravitreous להקמת Ocular דגם מחלות

Intravitreous injection is a widely used technique in visual sciences research. It can be used to establish animal models with ocular diseases or as ...

Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents

הקמת ראשיים פיברובלסטים תרבויות למבוגרים מאת מכרסמים

The importance of using primary cells, rather than cancer cell lines, for biological studies is becoming widely recognized.  Primary cells are preferred ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

דור של עכברים שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרים

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

בידוד RNA מן העכבר לבלב: רקמות ribonuclease עשיר

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

תא הטרנס-הפנימית המוני הזרקה של תאי גזע עובריים מוביל שיעור גבוה יותר של Chimerism

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Ex Vivo Method for Assessing the Mouse Reproductive Tract Spontaneous Motility and a MATLAB-based Uterus Motion Tracking Algorithm for Data Analysis

שיטה Vivo Ex להערכת בדרכי הרבייה של העכבר לתנועתיות ספונטנית מעקב הרחם MATLAB מבוסס על התנועה אלגוריתם לניתוח נתונים

Dysmenorrhea, or painful cramping, is the most common symptom associated with menses in females and its severity can hinder women&#39;s everyday lives. ...

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

פולחן תלת מימדי של אורגנוידים מאפיתל וילי במעיים העוברים דיפרנציה

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

Establishing Stable Binary Cultures of Symbiotic Saccharibacteria from the Oral Cavity

הקמת תרבויות בינאריות יציבות של סקרייבקטריה סימביוטית מחלל הפה

Many bacterial species cannot be cultured in the laboratory using standard methods, posing a significant barrier to studying the majority of microbial ...

Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining of Four Endometrial Immune Cell Types in Recurrent Miscarriage

כתמים אימונוהיסטוכימיים פלואורסצנטיים מרובים של ארבעה סוגי תאי מערכת החיסון רירית הרחם בהפלה חוזרת ונשנית

Immunohistochemistry is the most commonly used method for the identification and visualization of tissue antigens in biological research and clinical ...

Establishing Human Lung Organoids and Proximal Differentiation to Generate Mature Airway Organoids

ביסוס אורגנואידים של ריאות אנושיות והתמיינות פרוקסימלית ליצירת אורגנואידים בוגרים של דרכי הנשימה

The lack of a robust in vitro model of the human respiratory epithelium hinders the understanding of the biology and pathology of the respiratory system. ...