Name: a flexible chamber for time-lapse live-cell imaging with stimulated raman scattering microscopy
Uploaded: 2022-08-31T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Flexible Chamber for Time-Lapse Live-Cell Imaging with Stimulated Raman Scattering Microscopy at JoVE.com

نود أن نشكر فريق التصميم الجامعي لعام 2019 (سوك تشول يون ، وإيان فوكستون ، ولويس مازا ، وجيمس والش) في جامعة بينغهامتون على تصميم وتصنيع واختبار صندوق حاوية المجهر. نشكر سكوت هانكوك وأولغا بتروفا وفابيولا مورينو أوليفاس في جامعة بينغهامتون على المناقشات المفيدة. تم دعم هذا البحث من قبل المعاهد الوطنية للصحة تحت رقم الجائزة R15GM140444.

1. بناء العلبة البيئية المجهر
ملاحظة: يتم استخدام هذه العلبة البيئية للمجهر الكبير للتحكم في درجة حرارة جسم المجهر وبيئة التصوير المراد تثبيتها عند 37 درجة مئوية (الشكل 1 أ).
<ol><li>حدد مواقع أقدام إطار مجهر SRS والمرحلة الآلية باستخدام قلم تحديد على الطاولة البص?...

<ol>
	<li>Mertz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Introduction to Optical Microscopy. , (2019).</li><li>Ettinger, A., Wittmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+live+cell+imaging.">Fluorescence live cell imaging.</a> Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).</li><li>Park, Y., Depeursinge, C., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+phase+imaging+in+biomedicine.">Quantitative phase imaging in biomedicine.</a> Nature Photonics. 12 (10), 578-589 (2018).</li><li>Hu, C. D., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+multiple+protein+interactions+in+living+cells+using+multicolor+fluorescence+complementation+analysis.">Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis.</a> Nature Biotechnology. 21 (5), 539-545 (2003).</li><li>lamo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+dye+labeling+changes+the+biodistribution+of+tumor-targeted+nanoparticles.">Fluorescent dye labeling changes the biodistribution of tumor-targeted nanoparticles.</a> Pharmaceutics. 12 (11), 1004 (2020).</li><li>Cheng, J. X., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrational+spectroscopic+imaging+of+living+systems:+An+emerging+platform+for+biology+and+medicine.">Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine.</a> Science. 350 (6264), aaa870 (2015).</li><li>Lu, F. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+DNA+imaging+in+vivo+with+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).</li><li>Hill, A. H., Fu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+imaging+using+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Cellular imaging using stimulated Raman scattering microscopy.</a> Analytical Chemistry. 91 (15), 9333-9342 (2019).</li><li>Bu&#273;a, R., Vuku&#353;i&#263;, K., Toli&#263;, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Cell Biology. (139), 81-101 (2017).</li><li>Chiarelli, T. J., Grieshaber, N. A., Grieshaber, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+forward+genetic+approach+to+identify+and+isolate+developmental+mutants+in+Chlamydia+trachomatis.">Live-cell forward genetic approach to identify and isolate developmental mutants in Chlamydia trachomatis.</a> Journal of Visualized Experiments. (160), e61365 (2020).</li><li>Lemon, W. C., McDole, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+in+the+era+of+too+many+microscopes.">Live-cell imaging in the era of too many microscopes.</a> Current Opinion in Cell Biology. 66, 34-42 (2020).</li><li>Birk, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+oral+biofilms+by+nisin+delivery+in+adhesive+microdevices.">Management of oral biofilms by nisin delivery in adhesive microdevices.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 167, 83-88 (2021).</li><li>Watanabe, I., Okada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+temperature+on+growth+rate+of+cultured+mammalian+cells+(L5178Y).">Effects of temperature on growth rate of cultured mammalian cells (L5178Y).</a> Journal of Cell Biology. 32 (2), 309-323 (1967).</li><li>Lac, A., Lam, A. L., Heit, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fluorescent Microscopy. , 57-73 (2022).</li><li>Grossman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Machinable+glass-ceramics+based+on+tetrasilicic+mica.">Machinable glass-ceramics based on tetrasilicic mica.</a> Journal of the American Ceramic Society. 55 (9), 446-449 (1972).</li><li>Yuan, Y., Shah, N., Almohaisin, M. I., Saha, S., Lu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+fatty+acid-induced+lipotoxicity+and+its+therapeutic+potential+in+glioblastoma+using+stimulated+Raman+microscopy.">Assessing fatty acid-induced lipotoxicity and its therapeutic potential in glioblastoma using stimulated Raman microscopy.</a> Scientific Reports. 11 (1), 1-14 (2021).</li><li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScanImage:+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes.">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomedical Engineering Online. 2 (1), 1-9 (2003).</li><li>Sun, M. W., Yuan, Y. H., Lu, F. K., Di Pasqua, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physicochemical+factors+that+influence+the+biocompatibility+of+cationic+liposomes+and+their+ability+to+deliver+DNA+to+the+nuclei+of+ovarian+cancer+SK-OV-3+cells.">Physicochemical factors that influence the biocompatibility of cationic liposomes and their ability to deliver DNA to the nuclei of ovarian cancer SK-OV-3 cells.</a> Materials. 14 (2), 416 (2021).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Ozeki, Y., Itoh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulated+Raman+scattering+microscopy+for+live-cell+imaging+with+high+contrast+and+high+sensitivity.">Stimulated Raman scattering microscopy for live-cell imaging with high contrast and high sensitivity.</a> Laser Physics. 20 (5), 1114-1118 (2010).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+live-cell+imaging+of+nucleic+acids+using+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Label-free live-cell imaging of nucleic acids using stimulated Raman scattering microscopy.</a> ChemPhysChem. 13 (4), 1054-1059 (2012).</li><li>Stiebing, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+Raman+and+SRS+imaging+of+living+human+macrophages+reveals+cell-to-cell+heterogeneity+and+dynamics+of+lipid+uptake.">Real-time Raman and SRS imaging of living human macrophages reveals cell-to-cell heterogeneity and dynamics of lipid uptake.</a> Journal of Biophotonics. 10 (9), 1217-1226 (2017).</li><li>Miao, K., Wei, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+and+quantification+of+PolyQ+aggregates+by+stimulated+Raman+scattering+of+selective+deuterium+labeling.">Live-cell imaging and quantification of PolyQ aggregates by stimulated Raman scattering of selective deuterium labeling.</a> ACS Central Science. 6 (4), 478-486 (2020).</li><li>Brzozowski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulated+Raman+scattering+microscopy+in+chemistry+and+life+science+-Development,+innovation,+perspectives.">Stimulated Raman scattering microscopy in chemistry and life science -Development, innovation, perspectives.</a> Biotechnology Advances. 60, 108003 (2022).</li><li>Hislop, E. W., Tipping, W. J., Faulds, K., Graham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+imaging+of+lipid+droplets+in+prostate+cells+using+stimulated+Raman+scattering+microscopy+and+multivariate+analysis.">Label-free imaging of lipid droplets in prostate cells using stimulated Raman scattering microscopy and multivariate analysis.</a> Analytical Chemistry. 94 (25), 8899-8908 (2022).</li><li>Chen, T., Yavuz, A., Wang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+lipid+droplet+biology+with+coherent+Raman+scattering+microscopy.">Dissecting lipid droplet biology with coherent Raman scattering microscopy.</a> Journal of Cell Science. 135 (5), jcs252353 (2022).</li><li>Cao, C., Zhou, D., Chen, T., Streets, A. M., Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-Free+digital+quantification+of+lipid+droplets+in+single+cells+by+stimulated+Raman+microscopy+on+a+microfluidic+platform.">Label-Free digital quantification of lipid droplets in single cells by stimulated Raman microscopy on a microfluidic platform.</a> Analytical Chemistry. 88 (9), 4931-4939 (2016).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulated+Raman+scattering+flow+cytometry+for+label-free+single-particle+analysis.">Stimulated Raman scattering flow cytometry for label-free single-particle analysis.</a> Optica. 4 (1), 103-109 (2017).</li><li>Suzuki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+chemical+imaging+flow+cytometry+by+high-speed+multicolor+stimulated+Raman+scattering.">Label-free chemical imaging flow cytometry by high-speed multicolor stimulated Raman scattering.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (32), 15842-15848 (2019).</li><li>Gala de Pablo, J., Lindley, M., Hiramatsu, K., Goda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+Raman+flow+cytometry+and+beyond.">High-throughput Raman flow cytometry and beyond.</a> Accounts of Chemical Research. 54 (9), 2132-2143 (2021).</li><li>Cole, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging:+the+cell's+perspective.">Live-cell imaging: the cell's perspective.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. 8 (5), 452-459 (2014).</li><li>Kreft, M., Stenovec, M., Zorec, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focus-drift+correction+in+time-lapse+confocal+imaging.">Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1048 (1), 321-330 (2005).</li><li>Firestone, L., Cook, K., Culp, K., Talsania, N., Preston Jr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+autofocus+methods+for+automated+microscopy.">Comparison of autofocus methods for automated microscopy.</a> Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 12 (3), 195-206 (1991).</li><li>Van Helvert, S., Storm, C., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanoreciprocity+in+cell+migration.">Mechanoreciprocity in cell migration.</a> Nature Cell Biology. 20 (1), 8-20 (2018).</li><li>Zong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmon-enhanced+stimulated+Raman+scattering+microscopy+with+single-molecule+detection+sensitivity.">Plasmon-enhanced stimulated Raman scattering microscopy with single-molecule detection sensitivity.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).</li><li>Wei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-multiplex+vibrational+imaging.">Super-multiplex vibrational imaging.</a> Nature. 544 (7651), 465-470 (2017).</li></ol>

يعد الفحص المجهري SRS ذو الخلايا الحية ذات الفاصل الزمني تقنية تصوير بديلة لتتبع الجزيئات بطريقة خالية من الملصقات. بالمقارنة مع وضع العلامات الفلورية ، فإن تصوير SRS خال من التبييض الضوئي ، مما يتيح مراقبة الجزيئات على المدى الطويل. ومع ذلك ، حتى الآن ، فإن نظام التصوير بالخلايا الحية على مج...

يستخدم الفحص المجهري الضوئي لمراقبة الهياكل المجهرية للعينات. التصوير البصري سريع وأقل توغلا وأقل تدميرا من التقنيات الأخرى1. تم تطوير تصوير الخلايا الحية باستخدام المجهر الضوئي لالتقاط ديناميكيات الخلايا الحية المستزرعة على مدى فترةطويلة 2. توفر الأنواع المختلفة من التباينات الضوئية معلومات مميزة عن العينات البيولوجية. على سبيل المثال ، يظهر الفحص المجهري للطور البصري الاختلاف الدقيق في مؤشرات الانكسار عبر العينة3. يستخدم الفحص المجهري الفلوري على نطاق واسع لتصوير جزيئات حيوية أو عضيات خلوية محددة. ومع ذلك ، فإن أطياف الإثارة والانبعاث ذات النطاق العريض للتألق عادة ما تؤدي إلى تداخل طيفي عند إجراء تصوير متعدد الألوان4. جزيئات الفلورسنت حساسة للضوء ويمكن تبييضها بعد التعرض للضوء الدوري طويل الأمد. بالإضافة إلى ذلك ، قد يؤدي وضع العلامات الفلورية إلى تغيير التوزيع الحيوي للجزيئات في الخلايا5. الفحص المجهري SRS هو تقنية تصوير كيميائي خالية من الملصقات6. يعتمد تباين SRS على الانتقال الاهتزازي لروابط كيميائية محددة. غالبا ما يظهر التردد الاهتزازي لرابطة كيميائية عرض نطاق طيفي ضيق ، مما يجعل من الممكن تصوير نطاقات رامان متعددة في نفس العينات7. يعد الفحص المجهري SRS أداة فريدة لتصوير الخلايا الحية ، حيث يوفر تباينات كيميائية متعددة بطريقة خالية من الملصقات8.
بينما تم استخدام تصوير SRS للخلايا غير الملوثة في العديد من الدراسات ، لم يتم اعتماد تصوير SRS طويل المدى للخلايا الحية على نطاق واسع. أحد الأسباب هو أنه لا يمكن استخدام الغرف التجارية المفتوحة مباشرة لتصوير SRS بسبب سمكها الكبير9،10،11،12. تم تصميم هذه الغرف ذات الغطاء الزجاجي في الغالب للتصوير الساطع أو التصوير الفلوري باستخدام هدف NA مرتفع واحد مع مخطط الكشف الخلفي. ومع ذلك ، يفضل تصوير SRS الكشف المرسل باستخدام كل من هدف NA العالي ومكثف NA العالي ، والذي يترك فجوة قصيرة جدا (عادة بضعة ملليمترات) بين الهدف والمكثف. للتغلب على هذه المشكلة ، قمنا بتصميم غرفة مرنة باستخدام مادة ناعمة لتمكين تصوير SRS بفاصل زمني للخلايا الحية باستخدام إطار مجهر مستقيم. في هذا التصميم ، تم وضع هدف غمس الماء في الغرفة الناعمة ويمكن أن يتحرك بحرية في ثلاثة أبعاد لأغراض التركيز والتصوير.
درجة الحرارة المثلى لزراعة معظم خلايا الثدييات هي 37 درجة مئوية ، في حين أن درجة حرارة الغرفة دائما أقل بمقدار 10 درجات من ذلك. درجة الحرارة أعلى أو أقل من 37 درجة مئوية لها تأثير كبير على معدل نمو الخلايا13. لذلك ، يلزم التحكم في درجة حرارة بيئة زراعة الخلايا في نظام تصوير الخلايا الحية. من المعروف أن عدم استقرار درجة الحرارة سيؤدي إلى مشاكل في إلغاء التركيز أثناء التصوير طويل المدى14. لتحقيق بيئة مستقرة تبلغ 37 درجة مئوية ، قمنا ببناء غرفة حاوية كبيرة لتغطية إطار المجهر بالكامل ، بما في ذلك طبقة عازلة للحرارة أسفل المجهر (الشكل 1). داخل غرفة التحكم في درجة الحرارة الكبيرة ، تساعد الغرفة المرنة الصغيرة في الحفاظ بدقة على الرطوبة الفسيولوجية ودرجة الحموضة عبر تدفق الهواء المنظم المكمل ب 5٪ CO 2 (الشكل 2). تم قياس درجة حرارة ورطوبة الغرف للتأكد من أن تصميم الغرفة المزدوجة يوفر حالة زراعة الخلايا المثلى لنمو الخلايا تحت تصوير SRS الدوري طويل المدى (الشكل 3). ثم أظهرنا تطبيق النظام لتصوير الفاصل الزمني وتتبع قطرات الدهون (LDs) في الخلايا السرطانية SKOV3 (الشكل 4 والشكل 5 والشكل 6).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A lab-built SRS microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://rdcu.be/cP6ve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HF2LI 50 MHz lock-in amplifer</td>
			<td>Zurich Instruments</td>
			<td>HF2LI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris diaphragm</td>
			<td>Thorlabs Inc</td>
			<td>SM1D12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinematic mirror mount</td>
			<td>Thorlabs Inc</td>
			<td>KM100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope frame</td>
			<td>Nikon Inc</td>
			<td>FN-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized microscopy stage</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>Z-Deck</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil-immersion condenser (C-AA Achromat/Aplanat, NA 1.4)</td>
			<td>Nikon Inc</td>
			<td>MBL71405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-immersion objective (CFI75 Apo 25XC W 1300)</td>
			<td>Nikon Inc</td>
			<td>MRD77225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials and parts for the microscope enclosure (31&#39;&#39; x 29&#39;&#39; x 28&#39;&#39; L x W x H)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airtherm heater module</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>AIRTHERM-SAT-1W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airtherm heater controller, CO2 and humidity monitor</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>AIRTHERM-SMT-1W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air/CO2 mixer module</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>ECU-HOC-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible duct hose (2-1/2&#39;&#39; ID, 2-3/4&#39;&#39; OD)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>56675K71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-temperature glass-mica ceramic, easy-to-machine (6&#39;&#39; x 6&#39;&#39;, 1/4&#39;&#39; thickness)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8489K62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate sheets (thickness 0.25&#39;&#39;)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8574K286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone rubber sheets (36&#39;&#39; x 36&#39;&#39;, thickness 1/8&#39;&#39;)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5827T43</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials and parts for the Flexible chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>31745K11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-purity inline filter, 1/4 NPT</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>6645T18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hole saw (cutting diameter 1-7/8 inch)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>4066A34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hole saw (cutting diameter 50 mm)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>4556A19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-temperature silicone rubber tubing, soft, 2 mm ID, 5 mm OD</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5054K313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline filter (1/4 NPT, 40 micron)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>98385K843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipurpose 6061 Aluminum round tube (1/8&#39;&#39; wall thickness, 4&#39;&#39; OD)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9056K42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipurpose 6061 Aluminum round tube (3/4&#39;&#39; wall thickness, 3-3/4&#39;&#39; OD)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9056K47</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipurpose 6061 Aluminum bar (12&#39;&#39; x 12&#39;&#39;, thickness 1/4&#39;&#39;)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8975K142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipurpose 6061 Aluminum bar (8&#39;&#39; x 8&#39;&#39;, thickness 3/8&#39;&#39;)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9246K21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective nosepiece (single)</td>
			<td>Nikon Inc</td>
			<td>FN-MN-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample holder (modified)</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>HZ202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-thin natural rubber film (thickness 0.01&#39;&#39;)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8611K13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum-sealable glass jar</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>3231T44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ (Fiji)</td>
			<td></td>
			<td>imagej.net</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScanImage</td>
			<td>Vidrio Technologies, LLC</td>
			<td></td>
			<td>SRS imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials for live-cell imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass bottom sterile culture dishes (Dia.x H, 50 x 7 mm)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>70674-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM cell culture medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoSensor fluorescent dye DND-189</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L7535 (Invitrogen)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>364525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SKOV3 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-77</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a flexible chamber for time-lapse live-cell imaging with stimulated raman scattering microscopy

الفحص المجهري لتشتت رامان المحفز (SRS) هو تقنية تصوير كيميائي خالية من الملصقات. تم عرض تصوير الخلايا الحية باستخدام SRS للعديد من التطبيقات البيولوجية والطبية الحيوية. ومع ذلك ، لم يتم اعتماد تصوير SRS طويل المدى للخلايا الحية على نطاق واسع. غالبا ما يستخدم الفحص المجهري SRS هدف الغمر في الماء بفتحة عددية عالية (NA) ومكثف غمر زيت NA عالي لتحقيق تصوير عالي الدقة. في هذه الحالة ، تكون الفجوة بين الهدف والمكثف بضعة ملليمترات فقط. لذلك ، لا يمكن استخدام معظم الغرف البيئية التجارية على سطح المسرح لتصوير SRS بسبب سمكها الكبير مع غطاء زجاجي صلب. تصف هذه الورقة تصميم وتصنيع غرفة مرنة يمكن استخدامها لتصوير الخلايا الحية بفاصل زمني مع اكتشاف إشارة SRS المرسلة على إطار مجهر مستقيم. يتم تحقيق مرونة الغرفة باستخدام مادة ناعمة - فيلم مطاطي طبيعي رقيق. يمكن إضافة العلبة الجديدة وتصميم الغرفة بسهولة إلى إعداد تصوير SRS الحالي. تظهر الاختبارات والنتائج الأولية أن نظام الغرفة المرنة يتيح تصوير SRS مستقرا وطويل الأجل بفاصل زمني للخلايا الحية ، والذي يمكن استخدامه في تطبيقات التصوير الحيوي المختلفة في المستقبل.

قمنا بتصنيع وتجميع نظام الغرفة المرنة لتصوير SRS بفاصل زمني (الشكل 1 والشكل 2) ، ثم قمنا بتقييم أداء النظام. وصلت درجة الحرارة داخل العلبة البيئية للمجهر إلى 37 درجة مئوية المتوقعة في غضون 1 ساعة ، والتي لم تؤثر بشكل كبير على درجة حرارة الغرفة (الشكل 3 ...

Watch this Scientific Journal Video about A Flexible Chamber for Time-Lapse Live-Cell Imaging with Stimulated Raman Scattering Microscopy at JoVE.com

A Flexible Chamber for Time-Lapse Live-Cell Imaging with Stimulated Raman Scattering Microscopy

نبلغ عن غرفة بيئية مرنة على قمة المسرح لتصوير الفاصل الزمني للخلايا الحية باستخدام مجهر تشتت رامان المحفز المستقيم مع اكتشاف الإشارات المرسلة. تم تصوير قطرات الدهون في خلايا SKOV3 المعالجة بحمض الأوليك لمدة تصل إلى 24 ساعة مع فاصل زمني مدته 3 دقائق.

غرفة مرنة لتصوير الخلايا الحية بفاصل زمني مع مجهر تشتت رامان المحفز

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology. Live-cell imaging with SRS has been demonstrated for many ...

تتيح تقنية الغرفة البيئية المرنة الفاصل الزمني مثل تصوير SRS مع اكتشاف الإشارات المرسلة على إطار مجهر التشغيل. استخدم المجهر SRS هدفا عالي الفتحة العددية ومكثفا عالي النهاية ، تاركا فجوة بضعة ملليمترات فقط حيث لا يمكن للغرفة التقليدية أن تتلاءم. غرفة مرنة تحل هذه المشكلة.يمكن للباحثين الذين يستخدمون الفحص المجهري SRS اعتماد هذه التقنية بسهولة. يمكن أيضا استخدام الغرفة المرنة على مجهر تشريح أو معقم للحفاظ على العينة في ظل الظروف الفسيولوجية المثلى. للبدء ، حدد مواقع أقدام إطار مجهر SRS والمرحلة الآلية باستخدام قلم تحديد على الطاولة البصرية.بعد إزالة إطار المجهر والمرحلة من الطاولة البصرية ، ضع ورقة مطاط السيليكون على الطاولة. قطع مطاط السيليكون على طول العلامات باستخدام سكين. قم بإزالة القطع المطاطية الصغيرة ، وضع صفائح سيراميك الميكا المربعة في نفس الأماكن.ثم حرك إطار المجهر والمسرح مرة أخرى إلى الطاولة البصرية وقم بمحاذاة القدمين بعناية على صفائح سيراميك الميكا على طول خطوط العلامة. بعد إعادة تنظيم المسار البصري SRS ، قم بتجميع العلبة البيئية أعلى أساس العزل الحراري لتغطية إطار المجهر بالكامل ، باستخدام خمس قطع من ألواح البولي كربونات الكبيرة. أغلق حواف وواجهات الصندوق باستخدام شريط رقائق الألومنيوم.قم بتوصيل خرطوم مجرى الهواء المرن بمنافذ المدخل والمخرج لصندوق العلبة للسماح بتدفق الهواء الدافئ المتداول الذي يتم ضخه والتحكم فيه بواسطة وحدة السخان. قم بتركيب قطعة الألمنيوم الأسطوانية المجوفة المشكلة 1 على قطعة مقدمة الهدف باستخدام ثلاثة براغي مجموعة. بعد ذلك ، قم بتركيب قطعة الألمنيوم الأسطوانية المجوفة المشكلة 2 على حامل العينة باستخدام أربعة مسامير.قم بتركيب حامل العينة بقطعة الألومنيوم 2 على المسرح الميكانيكي وقم بتركيبه باستخدام البراغي. ضع غلاف الفيلم المطاطي الطبيعي بين قطعتي الألمنيوم المشكل آليا وقم بتركيبه باستخدام الأربطة المطاطية في كل طرف. قم بتوصيل أسطوانة CO2 المضغوطة بوحدة خلط الغاز باستخدام الأنابيب والموصلات المناسبة.اضبط ضغط إدخال CO2 على 20 إلى 25 رطل / بوصة مربعة. استخدم مستشعر CO2 المدمج ووحدة التحكم لضمان قدرة وحدة خلاط الهواء على تنظيم وخلط 5٪ CO2 في تدفق الهواء. استخدم المرشحات المضمنة لتنظيف تدفق الهواء.باستخدام الأنابيب والموصلات المناسبة ، قم بتوجيه الهواء المختلط إلى زجاجة الماء المعقمة مسبقا الموضوعة على لوح التسخين ثم قم بتوجيه الهواء المرطب إلى الغرفة المرنة. اضبط لوح التسخين على 37 درجة مئوية. قم بفقاعة تدفق الهواء في الماء الدافئ لزيادة رطوبة تدفق الهواء.افصل قطعة الألومنيوم 2 عن حامل العينة عن طريق إزالة البراغي. امسح جميع أجزاء الحجرة المرنة بنسبة 70٪ من الإيثانول ، بما في ذلك قطعة الأنف وحامل العينة وهدف غمس الماء. قم بإزالة التلوث من نظام العلبة بالكامل باستخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية الموضوع في العلبة لمدة 20 إلى 30 دقيقة.ثم قم بتحميل طبق ثقافة الخلية. قم بإزالة غطاء الطبق وشل حركته باستخدام المشابك. خفض الهدف في وسائط زراعة الخلايا للتركيز الخشن.اخفض قطعة الألومنيوم 2 لإحاطة الحجرة المرنة وتركيبها على حامل العينة باستخدام البراغي. ثم أدخل المستشعر. اضبط إمداد الهواء بنسبة 5٪ CO2 و 19٪ O2 لزراعة الخلايا الطبيعية بمعدل تدفق هواء يبلغ 200 سم مكعب في الدقيقة ودرجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية.اضبط الطول الموجي لليزر على 805 نانومتر لاستهداف إزاحة رامان العكسية 2،854 سم ، والتي تعزى إلى اهتزاز الروابط الكيميائية CH2. استخدم طاقة ليزر منخفضة لتقليل تلف الصور للخلايا. اضبط الهدف وركز عليه لتحقيق تصوير SRS جيد للخلايا باستخدام زر التركيز الموجود على لوحة التحكم الرئيسية للبرنامج.لإجراء التركيز البؤري السريع ، اضبط رقم البكسل على 512 × 512 بكسل مع وقت سكون بكسل يبلغ 4.8 ميكروثانية على لوحة التكوين. بعد تحقيق تركيز جيد ، اضبط دقة التصوير على 2048 × 2048 بكسل لمجال رؤية 175 ميكرومتر مربع للحصول على صور عالية الجودة. تحقق من وظيفة الحفظ في لوحة التحكم الرئيسية وتحقق من قناة SRS في لوحة القنوات.اضبط الفاصل الزمني بين إطارين ليكون 180 ثانية على قناة عناصر التحكم الرئيسية. اضبط رقم الاستحواذ على 480 للتصوير بفاصل زمني على مدار 24 ساعة. ابدأ الحصول على التصوير الآلي باستخدام وظيفة الحلقة في لوحة التحكم الرئيسية.تم تقييم أداء نظام الغرفة المرنة لتصوير SRS بفاصل زمني. وصلت درجة الحرارة داخل العلبة البيئية للمجهر إلى 37 درجة مئوية المتوقعة ولم تؤثر بشكل كبير على درجة حرارة الغرفة. وصلت درجة الحرارة في الغرفة المرنة إلى 37 درجة مئوية في 1.5 ساعة وتم الحفاظ عليها بثبات لمدة 24 ساعة على الأقل.وصلت الرطوبة النسبية في الغرفة المرنة إلى 85٪ في ساعة واحدة ويمكن الحفاظ عليها لمدة 24 ساعة على الأقل. أظهر تصوير SRS بفاصل زمني لخلايا SKOV3 الحية الحركة السريعة والنشطة لقطرات الدهون داخل الخلايا بدقة زمنية مدتها ثلاث دقائق. بحلول نهاية جلسة التصوير التي استمرت 24 ساعة ، كانت الخلايا لا تزال تظهر مورفولوجيا وكثافة طبيعية ، مما يشير إلى أن الخلايا كانت سليمة.بعد ذلك ، تم تصوير خلايا SKOV3 المعالجة بحمض الأوليك وتم تتبع تراكم قطرات الدهون على مدار 10 ساعات. تم تحديد كميات قطرات الدهون باستخدام نسبة قطرات الدهون إلى مساحة جسم الخلية وكثافة SRS الكلية لقطرات الدهون. تشير النتائج إلى أن كمية قطرات الدهون استمرت في الزيادة على مدار 10 ساعات.كما تم عرض تصوير SRS الأمامي المتزامن لقطرات الدهون والتصوير الفلوري للخلف الفوتون للجسيمات الحالة الموسومة بصبغة مضان DND-189. لوحظت درجة منخفضة جدا من التمركز المشترك لقطرات الدهون والليزوزومات. عند محاولة هذا البروتوكول ، ضع في اعتبارك أن الانجراف البؤري يمثل مشكلة شائعة في تصوير الخلايا الحية.قد تكون هناك حاجة إلى إعادة التركيز بعد حوالي ساعتين من التصوير بفاصل زمني. بعد تطويره ، تم استخدام تصوير SRS بفاصل زمني لدراسات مختلفة لتتبع الجزيئات الخالية من الملصقات أو الجزيئات المصنفة بنص رامان في الخلايا الحية.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

تحضير العينة ، والتصوير ، وتحليل بروتوكولات لالميكروسكوب الضوئي سكين الحافة

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

الوقت الفاصل بين التصوير الإسفار من نمو الجذور Arabidopsis مع التلاعب السريع للبيئة الجذر باستخدام RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

إنشاء تدرجات لاصق وقابل للذوبان للهجرة الخليوي مع التصوير مضان المجهري

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Sample Drift Correction Following 4D Confocal Time-lapse Imaging

عينة تصحيح الانجراف بعد 4D متحد البؤر التصوير الوقت الفاصل

The generation of four-dimensional (4D) confocal datasets; consisting of 3D image sequences over time; provides an excellent methodology to capture ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

من السريع إلى التصوير الإسفار الجزيئية قانون إنتشار على أغشية الخلايا الحية في المجهر التجاري

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

مضان تبريد لالقريبة من الأشعة تحت الحمراء Fluorophore-مغلفة Liposomal كأداة لل<em&gt; في فيفو</em&gt; التصوير الضوئي

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

يعيش التصوير خلية خلال الإمتداد الميكانيكية

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

الزخرفة مطروح السريع لطبقات الخلايا الحية مع التحقيق ميكروفلويديك

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

تصور تشكيل الالتصاق في الخلايا من خلال متقدم الغزل مجهرية Fluorescence انعكاس الداخلية القرص--المجموع

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

القياس المستمر للضوضاء البيولوجية في الإشريكية القولونية باستخدام المجهر الفاصل الزمني

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process ...