Name: a flexible chamber for time-lapse live-cell imaging with stimulated raman scattering microscopy
Uploaded: 2022-08-31T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Flexible Chamber for Time-Lapse Live-Cell Imaging with Stimulated Raman Scattering Microscopy at JoVE.com

Vi vil gerne takke 2019 Undergraduate Senior Design Team (Suk Chul Yoon, Ian Foxton, Louis Mazza og James Walsh) ved Binghamton University for design, fremstilling og test af mikroskopets kabinetboks. Vi takker Scott Hancock, Olga Petrova og Fabiola Moreno Olivas på Binghamton University for nyttige diskussioner. Denne forskning blev støttet af National Institutes of Health under tildelingsnummer R15GM140444.

1. Byg mikroskopets miljøkabinet
BEMÆRK: Dette store mikroskopmiljøkabinet bruges til at kontrollere temperaturen i mikroskoplegemet og billeddannelsesmiljøet, der skal stabiliseres ved 37 ° C (figur 1A).
<ol><li>Marker placeringen af fødderne på SRS-mikroskoprammen og det motoriserede trin ved hjælp af en markørpen på det optiske bord. Monter to irismembraner foran mikroskopets galvanometerscanner, og juster for at få pumpen og Stokes-laserstrålerne...

<ol>
	<li>Mertz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Introduction to Optical Microscopy. , (2019).</li><li>Ettinger, A., Wittmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+live+cell+imaging.">Fluorescence live cell imaging.</a> Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).</li><li>Park, Y., Depeursinge, C., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+phase+imaging+in+biomedicine.">Quantitative phase imaging in biomedicine.</a> Nature Photonics. 12 (10), 578-589 (2018).</li><li>Hu, C. D., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+multiple+protein+interactions+in+living+cells+using+multicolor+fluorescence+complementation+analysis.">Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis.</a> Nature Biotechnology. 21 (5), 539-545 (2003).</li><li>lamo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+dye+labeling+changes+the+biodistribution+of+tumor-targeted+nanoparticles.">Fluorescent dye labeling changes the biodistribution of tumor-targeted nanoparticles.</a> Pharmaceutics. 12 (11), 1004 (2020).</li><li>Cheng, J. X., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrational+spectroscopic+imaging+of+living+systems:+An+emerging+platform+for+biology+and+medicine.">Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine.</a> Science. 350 (6264), aaa870 (2015).</li><li>Lu, F. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+DNA+imaging+in+vivo+with+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).</li><li>Hill, A. H., Fu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+imaging+using+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Cellular imaging using stimulated Raman scattering microscopy.</a> Analytical Chemistry. 91 (15), 9333-9342 (2019).</li><li>Bu&#273;a, R., Vuku&#353;i&#263;, K., Toli&#263;, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Cell Biology. (139), 81-101 (2017).</li><li>Chiarelli, T. J., Grieshaber, N. A., Grieshaber, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+forward+genetic+approach+to+identify+and+isolate+developmental+mutants+in+Chlamydia+trachomatis.">Live-cell forward genetic approach to identify and isolate developmental mutants in Chlamydia trachomatis.</a> Journal of Visualized Experiments. (160), e61365 (2020).</li><li>Lemon, W. C., McDole, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+in+the+era+of+too+many+microscopes.">Live-cell imaging in the era of too many microscopes.</a> Current Opinion in Cell Biology. 66, 34-42 (2020).</li><li>Birk, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+oral+biofilms+by+nisin+delivery+in+adhesive+microdevices.">Management of oral biofilms by nisin delivery in adhesive microdevices.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 167, 83-88 (2021).</li><li>Watanabe, I., Okada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+temperature+on+growth+rate+of+cultured+mammalian+cells+(L5178Y).">Effects of temperature on growth rate of cultured mammalian cells (L5178Y).</a> Journal of Cell Biology. 32 (2), 309-323 (1967).</li><li>Lac, A., Lam, A. L., Heit, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fluorescent Microscopy. , 57-73 (2022).</li><li>Grossman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Machinable+glass-ceramics+based+on+tetrasilicic+mica.">Machinable glass-ceramics based on tetrasilicic mica.</a> Journal of the American Ceramic Society. 55 (9), 446-449 (1972).</li><li>Yuan, Y., Shah, N., Almohaisin, M. I., Saha, S., Lu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+fatty+acid-induced+lipotoxicity+and+its+therapeutic+potential+in+glioblastoma+using+stimulated+Raman+microscopy.">Assessing fatty acid-induced lipotoxicity and its therapeutic potential in glioblastoma using stimulated Raman microscopy.</a> Scientific Reports. 11 (1), 1-14 (2021).</li><li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScanImage:+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes.">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomedical Engineering Online. 2 (1), 1-9 (2003).</li><li>Sun, M. W., Yuan, Y. H., Lu, F. K., Di Pasqua, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physicochemical+factors+that+influence+the+biocompatibility+of+cationic+liposomes+and+their+ability+to+deliver+DNA+to+the+nuclei+of+ovarian+cancer+SK-OV-3+cells.">Physicochemical factors that influence the biocompatibility of cationic liposomes and their ability to deliver DNA to the nuclei of ovarian cancer SK-OV-3 cells.</a> Materials. 14 (2), 416 (2021).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Ozeki, Y., Itoh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulated+Raman+scattering+microscopy+for+live-cell+imaging+with+high+contrast+and+high+sensitivity.">Stimulated Raman scattering microscopy for live-cell imaging with high contrast and high sensitivity.</a> Laser Physics. 20 (5), 1114-1118 (2010).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+live-cell+imaging+of+nucleic+acids+using+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Label-free live-cell imaging of nucleic acids using stimulated Raman scattering microscopy.</a> ChemPhysChem. 13 (4), 1054-1059 (2012).</li><li>Stiebing, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+Raman+and+SRS+imaging+of+living+human+macrophages+reveals+cell-to-cell+heterogeneity+and+dynamics+of+lipid+uptake.">Real-time Raman and SRS imaging of living human macrophages reveals cell-to-cell heterogeneity and dynamics of lipid uptake.</a> Journal of Biophotonics. 10 (9), 1217-1226 (2017).</li><li>Miao, K., Wei, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+and+quantification+of+PolyQ+aggregates+by+stimulated+Raman+scattering+of+selective+deuterium+labeling.">Live-cell imaging and quantification of PolyQ aggregates by stimulated Raman scattering of selective deuterium labeling.</a> ACS Central Science. 6 (4), 478-486 (2020).</li><li>Brzozowski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulated+Raman+scattering+microscopy+in+chemistry+and+life+science+-Development,+innovation,+perspectives.">Stimulated Raman scattering microscopy in chemistry and life science -Development, innovation, perspectives.</a> Biotechnology Advances. 60, 108003 (2022).</li><li>Hislop, E. W., Tipping, W. J., Faulds, K., Graham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+imaging+of+lipid+droplets+in+prostate+cells+using+stimulated+Raman+scattering+microscopy+and+multivariate+analysis.">Label-free imaging of lipid droplets in prostate cells using stimulated Raman scattering microscopy and multivariate analysis.</a> Analytical Chemistry. 94 (25), 8899-8908 (2022).</li><li>Chen, T., Yavuz, A., Wang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+lipid+droplet+biology+with+coherent+Raman+scattering+microscopy.">Dissecting lipid droplet biology with coherent Raman scattering microscopy.</a> Journal of Cell Science. 135 (5), jcs252353 (2022).</li><li>Cao, C., Zhou, D., Chen, T., Streets, A. M., Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-Free+digital+quantification+of+lipid+droplets+in+single+cells+by+stimulated+Raman+microscopy+on+a+microfluidic+platform.">Label-Free digital quantification of lipid droplets in single cells by stimulated Raman microscopy on a microfluidic platform.</a> Analytical Chemistry. 88 (9), 4931-4939 (2016).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulated+Raman+scattering+flow+cytometry+for+label-free+single-particle+analysis.">Stimulated Raman scattering flow cytometry for label-free single-particle analysis.</a> Optica. 4 (1), 103-109 (2017).</li><li>Suzuki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+chemical+imaging+flow+cytometry+by+high-speed+multicolor+stimulated+Raman+scattering.">Label-free chemical imaging flow cytometry by high-speed multicolor stimulated Raman scattering.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (32), 15842-15848 (2019).</li><li>Gala de Pablo, J., Lindley, M., Hiramatsu, K., Goda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+Raman+flow+cytometry+and+beyond.">High-throughput Raman flow cytometry and beyond.</a> Accounts of Chemical Research. 54 (9), 2132-2143 (2021).</li><li>Cole, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging:+the+cell's+perspective.">Live-cell imaging: the cell's perspective.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. 8 (5), 452-459 (2014).</li><li>Kreft, M., Stenovec, M., Zorec, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focus-drift+correction+in+time-lapse+confocal+imaging.">Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1048 (1), 321-330 (2005).</li><li>Firestone, L., Cook, K., Culp, K., Talsania, N., Preston Jr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+autofocus+methods+for+automated+microscopy.">Comparison of autofocus methods for automated microscopy.</a> Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 12 (3), 195-206 (1991).</li><li>Van Helvert, S., Storm, C., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanoreciprocity+in+cell+migration.">Mechanoreciprocity in cell migration.</a> Nature Cell Biology. 20 (1), 8-20 (2018).</li><li>Zong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmon-enhanced+stimulated+Raman+scattering+microscopy+with+single-molecule+detection+sensitivity.">Plasmon-enhanced stimulated Raman scattering microscopy with single-molecule detection sensitivity.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).</li><li>Wei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-multiplex+vibrational+imaging.">Super-multiplex vibrational imaging.</a> Nature. 544 (7651), 465-470 (2017).</li></ol>

Time-lapse live-cell SRS-mikroskopi er en alternativ billeddannelsesteknik til molekylesporing på en etiketfri måde. Sammenlignet med fluorescensmærkning er SRS-billeddannelse fri for fotoblegning, hvilket muliggør langsigtet overvågning af molekyler. Til dato er det levende cellebilleddannelsessystem på en opretstående SRS-mikroskopi imidlertid ikke kommercielt tilgængeligt. I dette arbejde blev der udviklet et levende cellebilleddannelsessystem med en stabil termisk isoleret mikroskopkabinetboks og et fleksibel...

Optisk mikroskopi bruges til at observere mikrostrukturerne af prøver. Optisk billeddannelse er hurtig, mindre invasiv og mindre destruktiv end andre teknologier1. Levende cellebilleddannelse med optisk mikroskopi er udviklet til at fange dynamikken i dyrkede levende celler over en lang periode2. Forskellige typer optiske kontraster giver tydelig information om biologiske prøver. For eksempel viser optisk fasemikroskopi den subtile forskel i brydningsindekserne på tværs af prøven3. Fluorescensmikroskopi bruges i vid udstrækning til at afbilde specifikke biomolekyler eller cellulære organeller. Imidlertid resulterer bredbåndsexcitations- og emissionsspektrene for fluorescens normalt i spektral overlapning, når flerfarvet billeddannelse udføres4. Fluorescerende molekyler er lysfølsomme og kan bleges efter langvarig, periodisk lyseksponering. Derudover kan fluorescensmærkning ændre biofordelingen af molekylerne i celler5. SRS-mikroskopi er en etiketfri kemisk billeddannelsesteknologi6. Kontrasten af SRS er afhængig af vibrationsovergangen af specifikke kemiske bindinger. Vibrationsfrekvensen af en kemisk binding udviser ofte en smal spektral båndbredde, hvilket gør det muligt at afbilde flere Raman-bånd i de samme prøver7. SRS-mikroskopi er et unikt værktøj til billeddannelse af levende celler, der giver flere kemiske kontraster på en etiketfri måde8.
Mens SRS-billeddannelse af ufarvede celler er blevet brugt til mange undersøgelser, er langvarig tidsforløbs-SRS-billeddannelse af levende celler ikke blevet bredt vedtaget. En af grundene er, at kommercielle åbne kamre ikke kan bruges direkte til SRS-billeddannelse på grund af deres store tykkelse 9,10,11,12. Disse kamre med et glaslåg er for det meste designet til brightfield- eller fluorescensbilleddannelse ved hjælp af et enkelt højt NA-mål med et baguddetektionsskema. SRS-billeddannelse foretrækker imidlertid transmitteret detektion ved hjælp af både et højt NA-mål og en høj NA-kondensator, hvilket kun efterlader et meget kort mellemrum (typisk et par millimeter) mellem målet og kondensatoren. For at overvinde dette problem designede vi et fleksibelt kammer ved hjælp af et blødt materiale for at muliggøre time-lapse SRS-billeddannelse af levende celler ved hjælp af en opretstående mikroskopramme. I dette design blev vanddyppemålet indesluttet i det bløde kammer og kan frit bevæge sig i tre dimensioner til fokuserings- og billeddannelsesformål.
Den optimale temperatur til dyrkning af de fleste pattedyrceller er 37 °C, mens rumtemperaturen altid er 10° lavere end dette. Temperatur højere eller lavere end 37 °C har en dramatisk effekt på cellevæksthastigheden13. Derfor kræves temperaturkontrol af cellekulturmiljøet i et levende cellebilleddannelsessystem. Det er kendt, at temperaturstabilitet vil føre til defokuseringsproblemer under langvarig billeddannelse14. For at opnå et stabilt miljø på 37 °C byggede vi et stort kabinetkammer til at dække hele mikroskoprammen, inklusive et varmeisoleringslag under mikroskopet (figur 1). I det store temperaturkontrolkammer hjælper det lille fleksible kammer med nøjagtigt at opretholde den fysiologiske fugtighed og pH via den regulerede luftstrøm suppleret med 5% CO 2 (figur 2). Kamrenes temperatur og fugtighed blev målt for at bekræfte, at dobbeltkammerdesignet gav den optimale cellekulturtilstand for cellevækst under langvarig, periodisk SRS-billeddannelse (figur 3). Vi demonstrerede derefter anvendelsen af systemet til time-lapse-billeddannelse og sporing af lipiddråber (LD'er) i SKOV3-kræftceller (figur 4, figur 5 og figur 6).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A lab-built SRS microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://rdcu.be/cP6ve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HF2LI 50 MHz lock-in amplifer</td>
			<td>Zurich Instruments</td>
			<td>HF2LI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris diaphragm</td>
			<td>Thorlabs Inc</td>
			<td>SM1D12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinematic mirror mount</td>
			<td>Thorlabs Inc</td>
			<td>KM100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope frame</td>
			<td>Nikon Inc</td>
			<td>FN-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized microscopy stage</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>Z-Deck</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil-immersion condenser (C-AA Achromat/Aplanat, NA 1.4)</td>
			<td>Nikon Inc</td>
			<td>MBL71405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-immersion objective (CFI75 Apo 25XC W 1300)</td>
			<td>Nikon Inc</td>
			<td>MRD77225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials and parts for the microscope enclosure (31&#39;&#39; x 29&#39;&#39; x 28&#39;&#39; L x W x H)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airtherm heater module</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>AIRTHERM-SAT-1W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airtherm heater controller, CO2 and humidity monitor</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>AIRTHERM-SMT-1W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air/CO2 mixer module</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>ECU-HOC-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible duct hose (2-1/2&#39;&#39; ID, 2-3/4&#39;&#39; OD)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>56675K71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-temperature glass-mica ceramic, easy-to-machine (6&#39;&#39; x 6&#39;&#39;, 1/4&#39;&#39; thickness)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8489K62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate sheets (thickness 0.25&#39;&#39;)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8574K286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone rubber sheets (36&#39;&#39; x 36&#39;&#39;, thickness 1/8&#39;&#39;)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5827T43</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials and parts for the Flexible chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>31745K11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-purity inline filter, 1/4 NPT</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>6645T18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hole saw (cutting diameter 1-7/8 inch)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>4066A34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hole saw (cutting diameter 50 mm)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>4556A19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-temperature silicone rubber tubing, soft, 2 mm ID, 5 mm OD</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5054K313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline filter (1/4 NPT, 40 micron)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>98385K843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipurpose 6061 Aluminum round tube (1/8&#39;&#39; wall thickness, 4&#39;&#39; OD)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9056K42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipurpose 6061 Aluminum round tube (3/4&#39;&#39; wall thickness, 3-3/4&#39;&#39; OD)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9056K47</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipurpose 6061 Aluminum bar (12&#39;&#39; x 12&#39;&#39;, thickness 1/4&#39;&#39;)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8975K142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipurpose 6061 Aluminum bar (8&#39;&#39; x 8&#39;&#39;, thickness 3/8&#39;&#39;)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9246K21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective nosepiece (single)</td>
			<td>Nikon Inc</td>
			<td>FN-MN-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample holder (modified)</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>HZ202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-thin natural rubber film (thickness 0.01&#39;&#39;)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8611K13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum-sealable glass jar</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>3231T44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ (Fiji)</td>
			<td></td>
			<td>imagej.net</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScanImage</td>
			<td>Vidrio Technologies, LLC</td>
			<td></td>
			<td>SRS imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials for live-cell imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass bottom sterile culture dishes (Dia.x H, 50 x 7 mm)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>70674-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM cell culture medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoSensor fluorescent dye DND-189</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L7535 (Invitrogen)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>364525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SKOV3 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-77</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a flexible chamber for time-lapse live-cell imaging with stimulated raman scattering microscopy

Stimuleret Ramanspredning (SRS) mikroskopi er en etiketfri kemisk billeddannelsesteknologi. Levende cellebilleddannelse med SRS er blevet demonstreret til mange biologiske og biomedicinske anvendelser. Imidlertid er langvarig tidsforløbs-SRS-billeddannelse af levende celler ikke blevet bredt vedtaget. SRS-mikroskopi bruger ofte et vandnedsænkningsmål med høj numerisk blænde (NA) og en kondensator med høj NA-olienedsænkning for at opnå billeddannelse med høj opløsning. I dette tilfælde er afstanden mellem målet og kondensatoren kun få millimeter. Derfor kan de fleste kommercielle miljøkamre ikke bruges til SRS-billeddannelse på grund af deres store tykkelse med et stift glasdæksel. Dette papir beskriver design og fremstilling af et fleksibelt kammer, der kan bruges til time-lapse live-cellebilleddannelse med transmitteret SRS-signaldetektion på en opretstående mikroskopramme. Kammerets fleksibilitet opnås ved at bruge et blødt materiale - en tynd naturgummifilm. Det nye kabinet og kammerdesign kan nemt føjes til en eksisterende SRS-billedopsætning. Testen og de foreløbige resultater viser, at det fleksible kammersystem muliggør stabil, langsigtet SRS-billeddannelse med time-lapse af levende celler, som kan bruges til forskellige bioimaging-applikationer i fremtiden.

Vi fremstillede og samlede det fleksible kammersystem til time-lapse SRS-billeddannelse (figur 1 og figur 2) og evaluerede derefter systemets ydeevne. Temperaturen inde i mikroskopets miljøkabinet nåede de forventede 37 °C inden for 1 time, hvilket ikke påvirkede rumtemperaturen signifikant (figur 3A). Temperaturen i det fleksible kammer nåede 37 °C på 1,5 time, og den blev stabilt holdt på 37 °C i mindst 24 timer (<strong ...

Watch this Scientific Journal Video about A Flexible Chamber for Time-Lapse Live-Cell Imaging with Stimulated Raman Scattering Microscopy at JoVE.com

A Flexible Chamber for Time-Lapse Live-Cell Imaging with Stimulated Raman Scattering Microscopy

Vi rapporterer et stage-top, fleksibelt miljøkammer til time-lapse-billeddannelse af levende celler ved hjælp af opretstående stimuleret Raman-spredningsmikroskopi med transmitteret signaldetektion. Lipiddråber blev afbildet i SKOV3-celler behandlet med oliesyre i op til 24 timer med et tidsinterval på 3 minutter.

Et fleksibelt kammer til time-lapse levende cellebilleddannelse med stimuleret Ramanspredningsmikroskopi

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology. Live-cell imaging with SRS has been demonstrated for many ...

Den fleksible miljøkammerteknik muliggør time-lapse som SRS-billeddannelse med transmitteret signaldetektering på en driftsmikroskopramme. SRS-mikroskopi brugte et højt numerisk blændemål og en højspændt kondensator, hvilket kun efterlader et par millimeters mellemrum, hvor et konventionelt kammer ikke kan passe. Et fleksibelt kammer løser dette problem.Forskere, der bruger SRS-mikroskopi, kan nemt vedtage denne teknik. Det fleksible kammer kan også bruges på et dissekering eller et sterilt mikroskop for at opretholde prøven under optimale fysiologiske forhold. Til at begynde med skal du markere placeringen af fødderne på SRS-mikroskoprammen og det motoriserede trin ved hjælp af en markørpen på det optiske bord.Når du har fjernet mikroskopramme og scene fra det optiske bord, skal du lægge silikonegummipladen på bordet. Skær silikonegummiet langs mærkerne med en kniv. Fjern små gummistykker, og placer de firkantede glimmerkeramiske plader på de samme steder.Flyt derefter mikroskoprammen og scenen tilbage til det optiske bord, og juster forsigtigt fødderne på glimmerkeramikpladerne langs markørlinjerne. Efter justering af SRS optiske sti skal du samle miljøkabinettet oven på varmeisoleringsfundamentet for at dække hele mikroskoprammen ved hjælp af fem stykker store polykarbonatark. Forsegl kassens kanter og grænseflader ved hjælp af aluminiumsfolietape.Tilslut den fleksible kanalslange til indløbs- og udløbsportene i kabinetboksen for at tillade cirkuleret, varm luftstrøm pumpet og styret af varmemodulet. Monter det bearbejdede hule cylindriske aluminiumsstykke 1 på næsestykket på målet ved hjælp af tre sæt skruer. Monter derefter det bearbejdede hule cylindriske aluminiumsstykke 2 på prøveholderen ved hjælp af fire skruer.Monter prøveholderen med aluminiumsstykke 2 på det motoriserede trin, og monter det ved hjælp af skruer. Placer filmbøsningen af naturgummi mellem de to bearbejdede aluminiumsstykker, og monter den ved hjælp af elastikker i hver ende. Tilslut den komprimerede CO2-cylinder til gasblandemodulet ved hjælp af korrekt slange og stik.Indstil CO2-indgangstrykket til 20 til 25 psi. Brug den indbyggede CO2-sensor og en regulator til at sikre, at luftblandermodulet kan regulere og blande 5 % CO2 i luftstrømmen. Brug inline-filtre til at rense luftstrømmen.Brug korrekt slange og stik til at føre den blandede luft til den præsteriliserede vandflaske, der er placeret på kogepladen, og før derefter den befugtede luft til det fleksible kammer. Indstil kogepladen til 37 grader Celsius. Boble luftstrømmen i det varme vand for at øge luftfugtigheden.Afbryd maskinens aluminiumsstykke 2 fra prøveholderen ved at fjerne skruerne. Tør alle dele af det fleksible kammer af med 70 % ethanol, inklusive næsestykket, prøveholderen og målet for vanddypning. Dekontaminer hele kabinetsystemet ved hjælp af en UV-lampe placeret i kabinettet i 20 til 30 minutter.Læg derefter cellekulturskålen. Fjern dækslet på skålen og immobiliser det ved hjælp af klemmerne. Sænk målet ned i cellekulturmediet for grov fokusering.Sænk aluminiumsstykket 2 for at omslutte det fleksible kammer og monter det på prøveholderen ved hjælp af skruer. Indsæt derefter sensoren. Indstil lufttilførslen med 5% CO2 og 19% O2 til normal cellekultur med en luftstrømningshastighed på 200 kubikcentimeter pr. Minut og temperatur til 37 grader Celsius.Indstil laserbølgelængden til 805 nanometer for at målrette mod det 2.854 centimeter inverse Raman-skift, som tilskrives vibrationen af CH2 kemiske bindinger. Brug lav lasereffekt til at reducere fotoskader på cellerne. Juster og fokuser målet for at opnå god SRS-billeddannelse af cellerne ved hjælp af fokusknappen på softwarens hovedkontrolpanel.For at udføre hurtig fokusering skal du indstille pixeltallet til at være 512 x 512 pixels med en pixelopholdstid på 4,8 mikrosekunder på konfigurationspanelet. Når du har opnået god fokusering, skal du indstille billedopløsningen til at være 2048 x 2048 pixels for et 175 mikrometer kvadratisk synsfelt til erhvervelse af billeder i høj kvalitet. Kontroller gemmefunktionen på hovedkontrolpanelet, og kontroller SRS-kanalen på kanalpanelet.Indstil intervaltiden mellem to billeder til at være 180 sekunder på hovedkontrolkanalen. Angiv anskaffelsesnummeret til 480 for timelapse-billedbehandling over 24 timer. Start automatisk billedoptagelse ved hjælp af sløjfefunktionen på hovedkontrolpanelet.Ydeevnen af det fleksible kammersystem til time-lapse SRS-billeddannelse blev evalueret. Temperaturen inde i mikroskopets miljøkabinet nåede de forventede 37 grader Celsius og påvirkede ikke rumtemperaturen væsentligt. Temperaturen i det fleksible kammer nåede 37 grader Celsius på 1,5 timer og blev stabilt opretholdt i mindst 24 timer.Den relative luftfugtighed i det fleksible kammer nåede 85% på en time og kunne opretholdes i mindst 24 timer. Time-lapse SRS-billeddannelse af levende SKOV3-celler viste den hurtige og aktive bevægelse af intracellulære lipiddråber med en tidsmæssig opløsning på tre minutter. Ved afslutningen af den 24 timers billeddannelsessession viste cellerne stadig normal morfologi og tæthed, hvilket indikerer, at cellerne var sunde.Dernæst blev SKOV3-celler behandlet med oliesyre afbildet, og lipiddråbeakkumulering blev sporet over 10 timer. Lipiddråbemængderne blev kvantificeret ved anvendelse af lipiddråben til cellearealforholdet og den samlede SRS-intensitet af lipiddråberne. Resultaterne tyder på, at mængden af lipiddråber blev ved med at stige over 10 timer.Samtidig fremadrettet SRS-billeddannelse af lipiddråber og bagud to fotonfluorescensbilleddannelse af lysosomer mærket med et fluorescensfarvestof DND-189 blev også demonstreret. En meget lav grad af colokalisering af lipiddråber og lysosomer blev observeret. Når du forsøger denne protokol, skal du huske på, at fokaldrift er et almindeligt problem i levende cellebilleddannelse.Det kan være nødvendigt at fokusere igen efter ca. to timers timelapse-billeddannelse. Efter dens udvikling er time-lapse SRS-billeddannelse blevet brugt til forskellige undersøgelser til at spore etiketfrie molekyler eller mærkede molekyler med Raman-tekst i levende celler.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

Prøvepræparation, Imaging, og Analyse protokoller for knivsæg Scanning Mikroskopi

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

Time-lapse fluorescensimagografi af Arabidopsis rodvækst med Rapid Manipulation af The Root miljøet ved hjælp af RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Oprettelse Lim og Opløseligt Gradienter for Imaging Cell Migration med Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Sample Drift Correction Following 4D Confocal Time-lapse Imaging

Sample Drift Korrektion Efter 4D Confocal Time-lapse Imaging

The generation of four-dimensional (4D) confocal datasets; consisting of 3D image sequences over time; provides an excellent methodology to capture ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Fra Hurtig fluorescensimagografi til molekylær diffusion lov om levende cellemembraner i en kommerciel mikroskop

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescens-quenching af et liposomalt indkapslet Near-infrarøde fluorofor som et værktøj til<em&gt; In Vivo</em&gt; Optisk Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

Live-Cell Imaging under Mechanical Stretch

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

Hurtig Subtraktiv mønster af levende cellelag med et Mikrofluid Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Visualisere vedhæftning dannelse i celler ved hjælp af avancerede Spinning Disk-Total interne Reflection Fluorescens mikroskopi

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

Kontinuerlig måling af biologisk støj i Escherichia Coli ved hjælp af time-lapse mikroskopi

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process ...