Name: a flexible chamber for time-lapse live-cell imaging with stimulated raman scattering microscopy
Uploaded: 2022-08-31T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Flexible Chamber for Time-Lapse Live-Cell Imaging with Stimulated Raman Scattering Microscopy at JoVE.com

אנו רוצים להודות לצוות העיצוב הבכיר לתואר ראשון לשנת 2019 (סוק צ'ול יון, איאן פוקסטון, לואיס מאזה וג'יימס וולש) באוניברסיטת בינגהמטון על התכנון, הייצור והבדיקה של קופסת מארז המיקרוסקופ. אנו מודים לסקוט הנקוק, אולגה פטרובה ופביולה מורנו אוליבס מאוניברסיטת בינגהמטון על הדיונים המועילים. מחקר זה נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס מספר R15GM140444.

1. בניית המתחם הסביבתי במיקרוסקופ
הערה: המארז הסביבתי הגדול הזה של המיקרוסקופ משמש לשליטה בטמפרטורה של גוף המיקרוסקופ וסביבת ההדמיה שיש לייצב ב-37°C (איור 1A).
<ol><li>סמן את מיקומי כפות הרגליים של מסגרת המיקרוסקופ SRS ואת השלב הממונע באמצעות עט סמן על השולחן האופט?...

<ol>
	<li>Mertz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Introduction to Optical Microscopy. , (2019).</li><li>Ettinger, A., Wittmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+live+cell+imaging.">Fluorescence live cell imaging.</a> Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).</li><li>Park, Y., Depeursinge, C., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+phase+imaging+in+biomedicine.">Quantitative phase imaging in biomedicine.</a> Nature Photonics. 12 (10), 578-589 (2018).</li><li>Hu, C. D., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+multiple+protein+interactions+in+living+cells+using+multicolor+fluorescence+complementation+analysis.">Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis.</a> Nature Biotechnology. 21 (5), 539-545 (2003).</li><li>lamo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+dye+labeling+changes+the+biodistribution+of+tumor-targeted+nanoparticles.">Fluorescent dye labeling changes the biodistribution of tumor-targeted nanoparticles.</a> Pharmaceutics. 12 (11), 1004 (2020).</li><li>Cheng, J. X., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrational+spectroscopic+imaging+of+living+systems:+An+emerging+platform+for+biology+and+medicine.">Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine.</a> Science. 350 (6264), aaa870 (2015).</li><li>Lu, F. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+DNA+imaging+in+vivo+with+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).</li><li>Hill, A. H., Fu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+imaging+using+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Cellular imaging using stimulated Raman scattering microscopy.</a> Analytical Chemistry. 91 (15), 9333-9342 (2019).</li><li>Bu&#273;a, R., Vuku&#353;i&#263;, K., Toli&#263;, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Cell Biology. (139), 81-101 (2017).</li><li>Chiarelli, T. J., Grieshaber, N. A., Grieshaber, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+forward+genetic+approach+to+identify+and+isolate+developmental+mutants+in+Chlamydia+trachomatis.">Live-cell forward genetic approach to identify and isolate developmental mutants in Chlamydia trachomatis.</a> Journal of Visualized Experiments. (160), e61365 (2020).</li><li>Lemon, W. C., McDole, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+in+the+era+of+too+many+microscopes.">Live-cell imaging in the era of too many microscopes.</a> Current Opinion in Cell Biology. 66, 34-42 (2020).</li><li>Birk, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+oral+biofilms+by+nisin+delivery+in+adhesive+microdevices.">Management of oral biofilms by nisin delivery in adhesive microdevices.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 167, 83-88 (2021).</li><li>Watanabe, I., Okada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+temperature+on+growth+rate+of+cultured+mammalian+cells+(L5178Y).">Effects of temperature on growth rate of cultured mammalian cells (L5178Y).</a> Journal of Cell Biology. 32 (2), 309-323 (1967).</li><li>Lac, A., Lam, A. L., Heit, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fluorescent Microscopy. , 57-73 (2022).</li><li>Grossman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Machinable+glass-ceramics+based+on+tetrasilicic+mica.">Machinable glass-ceramics based on tetrasilicic mica.</a> Journal of the American Ceramic Society. 55 (9), 446-449 (1972).</li><li>Yuan, Y., Shah, N., Almohaisin, M. I., Saha, S., Lu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+fatty+acid-induced+lipotoxicity+and+its+therapeutic+potential+in+glioblastoma+using+stimulated+Raman+microscopy.">Assessing fatty acid-induced lipotoxicity and its therapeutic potential in glioblastoma using stimulated Raman microscopy.</a> Scientific Reports. 11 (1), 1-14 (2021).</li><li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScanImage:+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes.">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomedical Engineering Online. 2 (1), 1-9 (2003).</li><li>Sun, M. W., Yuan, Y. H., Lu, F. K., Di Pasqua, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physicochemical+factors+that+influence+the+biocompatibility+of+cationic+liposomes+and+their+ability+to+deliver+DNA+to+the+nuclei+of+ovarian+cancer+SK-OV-3+cells.">Physicochemical factors that influence the biocompatibility of cationic liposomes and their ability to deliver DNA to the nuclei of ovarian cancer SK-OV-3 cells.</a> Materials. 14 (2), 416 (2021).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Ozeki, Y., Itoh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulated+Raman+scattering+microscopy+for+live-cell+imaging+with+high+contrast+and+high+sensitivity.">Stimulated Raman scattering microscopy for live-cell imaging with high contrast and high sensitivity.</a> Laser Physics. 20 (5), 1114-1118 (2010).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+live-cell+imaging+of+nucleic+acids+using+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Label-free live-cell imaging of nucleic acids using stimulated Raman scattering microscopy.</a> ChemPhysChem. 13 (4), 1054-1059 (2012).</li><li>Stiebing, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+Raman+and+SRS+imaging+of+living+human+macrophages+reveals+cell-to-cell+heterogeneity+and+dynamics+of+lipid+uptake.">Real-time Raman and SRS imaging of living human macrophages reveals cell-to-cell heterogeneity and dynamics of lipid uptake.</a> Journal of Biophotonics. 10 (9), 1217-1226 (2017).</li><li>Miao, K., Wei, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+and+quantification+of+PolyQ+aggregates+by+stimulated+Raman+scattering+of+selective+deuterium+labeling.">Live-cell imaging and quantification of PolyQ aggregates by stimulated Raman scattering of selective deuterium labeling.</a> ACS Central Science. 6 (4), 478-486 (2020).</li><li>Brzozowski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulated+Raman+scattering+microscopy+in+chemistry+and+life+science+-Development,+innovation,+perspectives.">Stimulated Raman scattering microscopy in chemistry and life science -Development, innovation, perspectives.</a> Biotechnology Advances. 60, 108003 (2022).</li><li>Hislop, E. W., Tipping, W. J., Faulds, K., Graham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+imaging+of+lipid+droplets+in+prostate+cells+using+stimulated+Raman+scattering+microscopy+and+multivariate+analysis.">Label-free imaging of lipid droplets in prostate cells using stimulated Raman scattering microscopy and multivariate analysis.</a> Analytical Chemistry. 94 (25), 8899-8908 (2022).</li><li>Chen, T., Yavuz, A., Wang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+lipid+droplet+biology+with+coherent+Raman+scattering+microscopy.">Dissecting lipid droplet biology with coherent Raman scattering microscopy.</a> Journal of Cell Science. 135 (5), jcs252353 (2022).</li><li>Cao, C., Zhou, D., Chen, T., Streets, A. M., Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-Free+digital+quantification+of+lipid+droplets+in+single+cells+by+stimulated+Raman+microscopy+on+a+microfluidic+platform.">Label-Free digital quantification of lipid droplets in single cells by stimulated Raman microscopy on a microfluidic platform.</a> Analytical Chemistry. 88 (9), 4931-4939 (2016).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulated+Raman+scattering+flow+cytometry+for+label-free+single-particle+analysis.">Stimulated Raman scattering flow cytometry for label-free single-particle analysis.</a> Optica. 4 (1), 103-109 (2017).</li><li>Suzuki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+chemical+imaging+flow+cytometry+by+high-speed+multicolor+stimulated+Raman+scattering.">Label-free chemical imaging flow cytometry by high-speed multicolor stimulated Raman scattering.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (32), 15842-15848 (2019).</li><li>Gala de Pablo, J., Lindley, M., Hiramatsu, K., Goda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+Raman+flow+cytometry+and+beyond.">High-throughput Raman flow cytometry and beyond.</a> Accounts of Chemical Research. 54 (9), 2132-2143 (2021).</li><li>Cole, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging:+the+cell's+perspective.">Live-cell imaging: the cell's perspective.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. 8 (5), 452-459 (2014).</li><li>Kreft, M., Stenovec, M., Zorec, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focus-drift+correction+in+time-lapse+confocal+imaging.">Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1048 (1), 321-330 (2005).</li><li>Firestone, L., Cook, K., Culp, K., Talsania, N., Preston Jr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+autofocus+methods+for+automated+microscopy.">Comparison of autofocus methods for automated microscopy.</a> Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 12 (3), 195-206 (1991).</li><li>Van Helvert, S., Storm, C., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanoreciprocity+in+cell+migration.">Mechanoreciprocity in cell migration.</a> Nature Cell Biology. 20 (1), 8-20 (2018).</li><li>Zong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmon-enhanced+stimulated+Raman+scattering+microscopy+with+single-molecule+detection+sensitivity.">Plasmon-enhanced stimulated Raman scattering microscopy with single-molecule detection sensitivity.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).</li><li>Wei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-multiplex+vibrational+imaging.">Super-multiplex vibrational imaging.</a> Nature. 544 (7651), 465-470 (2017).</li></ol>

מיקרוסקופ SRS של תאים חיים בהילוך מהיר הוא טכניקת הדמיה חלופית למעקב אחר מולקולות באופן נטול תוויות. בהשוואה לתיוג פלואורסצנטי, הדמיית SRS אינה מלבינה פוטו, ומאפשרת ניטור ארוך טווח של מולקולות. עם זאת, נכון להיום, מערכת הדמיה של תאים חיים במיקרוסקופ SRS זקוף אינה זמינה מסחרית. בעבודה זו פותחה מ?...

מיקרוסקופ אופטי משמש להתבוננות במיקרו-מבנים של דגימות. הדמיה אופטית היא מהירה, פחות פולשנית ופחות הרסנית מטכנולוגיות אחרות1. דימות תאים חיים עם מיקרוסקופ אופטי פותח כדי ללכוד את הדינמיקה של תאים חיים בתרבית במשך תקופה ארוכה2. סוגים שונים של ניגודים אופטיים מספקים מידע ברור על דגימות ביולוגיות. לדוגמה, מיקרוסקופ פאזה אופטי מראה את ההבדל הדק במדדי השבירה על פני מדגם3. מיקרוסקופ פלואורסצנטי נמצא בשימוש נרחב כדי לדמיין ביומולקולות ספציפיות או אברונים תאיים. עם זאת, ספקטרום העירור והפליטה בפס רחב של פלואורסצנטיות גורם בדרך כלל לחפיפה ספקטרלית כאשר מתבצעת הדמיה מרובת צבעים4. מולקולות פלואורסצנטיות רגישות לאור וניתן להלבין אותן לאחר חשיפה תקופתית ארוכת טווח לאור. בנוסף, תיוג פלואורסצנטי עשוי לשנות את הפיזור הביולוגי של המולקולות בתאים5. מיקרוסקופ SRS הוא טכנולוגיית הדמיה כימית ללא תוויות6. הניגודיות של SRS מסתמכת על מעבר רטט של קשרים כימיים ספציפיים. תדירות הרטט של קשר כימי מציגה לעתים קרובות רוחב פס ספקטרלי צר, מה שהופך את זה אפשרי לצלם רצועות ראמאן מרובות באותן דגימות7. מיקרוסקופ SRS הוא כלי ייחודי להדמיית תאים חיים, המספק ניגודים כימיים מרובים באופן נטול תוויות8.
בעוד שהדמיית SRS של תאים לא מוכתמים שימשה במחקרים רבים, הדמיית SRS ארוכת טווח בהילוך מהיר של תאים חיים לא אומצה באופן נרחב. אחת הסיבות לכך היא שלא ניתן להשתמש ישירות בתאים פתוחים מסחריים להדמיית SRS בגלל עוביים הגדול 9,10,11,12. תאים אלה עם מכסה זכוכית מתוכננים בעיקר עבור הדמיה של שדה בהיר או פלואורסצנטי באמצעות מטרת NA גבוהה אחת עם סכימת זיהוי לאחור. עם זאת, הדמיית SRS מעדיפה גילוי משודר הן באמצעות מטרת NA גבוהה והן באמצעות מעבה NA גבוה, אשר משאיר רק מרווח קצר מאוד (בדרך כלל כמה מילימטרים) בין המטרה לבין המעבה. כדי להתגבר על בעיה זו, תכננו תא גמיש באמצעות חומר רך כדי לאפשר הדמיית SRS בהילוך מהיר של תאים חיים באמצעות מסגרת מיקרוסקופ זקוף. בתכנון זה, מטרת טבילת המים הייתה סגורה בתא הרך ויכולה לנוע בחופשיות בתלת מימד למטרות מיקוד והדמיה.
הטמפרטורה האופטימלית לגידול רוב תאי היונקים היא 37 מעלות צלזיוס, בעוד שטמפרטורת החדר תמיד נמוכה ב -10 מעלות מכך. טמפרטורה גבוהה או נמוכה מ 37 °C יש השפעה דרמטית על קצב צמיחת התאים13. לכן, בקרת טמפרטורה של סביבת תרבית התא נדרשת במערכת דימות של תאים חיים. ידוע כי חוסר יציבות טמפרטורה יוביל לבעיות מיקוד במהלך הדמיה ארוכת טווח14. כדי להשיג סביבה יציבה של 37°C, בנינו תא מארז גדול שיכסה את כל מסגרת המיקרוסקופ, כולל שכבת בידוד תרמי מתחת למיקרוסקופ (איור 1). בתוך תא בקרת הטמפרטורה הגדול, התא הקטן והגמיש עוזר לשמור במדויק על הלחות הפיזיולוגית ועל רמת החומציות באמצעות זרימת האוויר המווסתת בתוספת 5% CO 2 (איור 2). הטמפרטורה והלחות של התאים נמדדו כדי לאשר שהתכנון הדו-תאי סיפק את תנאי תרבית התאים האופטימליים לצמיחת תאים בהדמיית SRS תקופתית ארוכת טווח (איור 3). לאחר מכן הדגמנו את היישום של המערכת עבור דימות בהילוך מהיר ומעקב אחר טיפות שומנים (LDs) בתאי סרטן SKOV3 (איור 4, איור 5 ואיור 6).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A lab-built SRS microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://rdcu.be/cP6ve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HF2LI 50 MHz lock-in amplifer</td>
			<td>Zurich Instruments</td>
			<td>HF2LI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris diaphragm</td>
			<td>Thorlabs Inc</td>
			<td>SM1D12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinematic mirror mount</td>
			<td>Thorlabs Inc</td>
			<td>KM100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope frame</td>
			<td>Nikon Inc</td>
			<td>FN-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized microscopy stage</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>Z-Deck</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil-immersion condenser (C-AA Achromat/Aplanat, NA 1.4)</td>
			<td>Nikon Inc</td>
			<td>MBL71405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-immersion objective (CFI75 Apo 25XC W 1300)</td>
			<td>Nikon Inc</td>
			<td>MRD77225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials and parts for the microscope enclosure (31&#39;&#39; x 29&#39;&#39; x 28&#39;&#39; L x W x H)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airtherm heater module</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>AIRTHERM-SAT-1W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airtherm heater controller, CO2 and humidity monitor</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>AIRTHERM-SMT-1W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air/CO2 mixer module</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>ECU-HOC-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible duct hose (2-1/2&#39;&#39; ID, 2-3/4&#39;&#39; OD)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>56675K71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-temperature glass-mica ceramic, easy-to-machine (6&#39;&#39; x 6&#39;&#39;, 1/4&#39;&#39; thickness)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8489K62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate sheets (thickness 0.25&#39;&#39;)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8574K286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone rubber sheets (36&#39;&#39; x 36&#39;&#39;, thickness 1/8&#39;&#39;)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5827T43</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials and parts for the Flexible chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>31745K11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-purity inline filter, 1/4 NPT</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>6645T18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hole saw (cutting diameter 1-7/8 inch)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>4066A34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hole saw (cutting diameter 50 mm)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>4556A19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-temperature silicone rubber tubing, soft, 2 mm ID, 5 mm OD</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5054K313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline filter (1/4 NPT, 40 micron)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>98385K843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipurpose 6061 Aluminum round tube (1/8&#39;&#39; wall thickness, 4&#39;&#39; OD)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9056K42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipurpose 6061 Aluminum round tube (3/4&#39;&#39; wall thickness, 3-3/4&#39;&#39; OD)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9056K47</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipurpose 6061 Aluminum bar (12&#39;&#39; x 12&#39;&#39;, thickness 1/4&#39;&#39;)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8975K142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipurpose 6061 Aluminum bar (8&#39;&#39; x 8&#39;&#39;, thickness 3/8&#39;&#39;)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9246K21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective nosepiece (single)</td>
			<td>Nikon Inc</td>
			<td>FN-MN-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample holder (modified)</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>HZ202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-thin natural rubber film (thickness 0.01&#39;&#39;)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8611K13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum-sealable glass jar</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>3231T44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ (Fiji)</td>
			<td></td>
			<td>imagej.net</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScanImage</td>
			<td>Vidrio Technologies, LLC</td>
			<td></td>
			<td>SRS imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials for live-cell imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass bottom sterile culture dishes (Dia.x H, 50 x 7 mm)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>70674-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM cell culture medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoSensor fluorescent dye DND-189</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L7535 (Invitrogen)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>364525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SKOV3 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-77</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a flexible chamber for time-lapse live-cell imaging with stimulated raman scattering microscopy

מיקרוסקופ פיזור ראמאן מגורה (SRS) הוא טכנולוגיית הדמיה כימית ללא תוויות. דימות תאים חיים עם SRS הוכח עבור יישומים ביולוגיים וביו-רפואיים רבים. עם זאת, הדמיית SRS ארוכת טווח בהילוך מהיר של תאים חיים לא אומצה באופן נרחב. מיקרוסקופ SRS משתמש לעתים קרובות ביעד טבילה במים עם צמצם מספרי גבוה (NA) ובמעבה טבילת שמן NA גבוה כדי להשיג הדמיה ברזולוציה גבוהה. במקרה זה, הפער בין המטרה לבין המעבה הוא רק כמה מילימטרים. לכן, רוב התאים הסביבתיים המסחריים אינם יכולים לשמש להדמיית SRS בגלל עוביים הגדול עם כיסוי זכוכית קשיח. מאמר זה מתאר את התכנון והייצור של תא גמיש שניתן להשתמש בו להדמיית תאים חיים בהילוך מהיר עם זיהוי אותות SRS המשודרים במסגרת מיקרוסקופ זקוף. הגמישות של החדר מושגת באמצעות חומר רך - סרט גומי טבעי דק. ניתן להוסיף בקלות את המארז החדש ואת עיצוב התא למערך הדמיה SRS קיים. הבדיקות והתוצאות הראשוניות מראות כי מערכת התא הגמישה מאפשרת הדמיית SRS יציבה, ארוכת טווח ובהילוך מהיר של תאים חיים, אשר תוכל לשמש ליישומי הדמיה ביולוגית שונים בעתיד.

ייצרנו והרכבנו את מערכת התאים הגמישים להדמיית SRS בהילוך מהיר (איור 1 ואיור 2), ולאחר מכן הערכנו את ביצועי המערכת. הטמפרטורה בתוך המתחם הסביבתי של המיקרוסקופ הגיעה ל-37 מעלות צלזיוס הצפויות בתוך שעה אחת, מה שלא השפיע באופן משמעותי על טמפרטורת החדר (א?...

Watch this Scientific Journal Video about A Flexible Chamber for Time-Lapse Live-Cell Imaging with Stimulated Raman Scattering Microscopy at JoVE.com

A Flexible Chamber for Time-Lapse Live-Cell Imaging with Stimulated Raman Scattering Microscopy

אנו מדווחים על תא סביבתי גמיש ומתקדם להדמיה בהילוך מהיר של תאים חיים באמצעות מיקרוסקופ פיזור ראמאן מגורה זקוף עם זיהוי אותות משודרים. טיפות שומנים צולמו בתאי SKOV3 שטופלו בחומצה אולאית למשך עד 24 שעות במרווח זמן של 3 דקות.

תא גמיש להדמיית תאים חיים בהילוך מהיר עם מיקרוסקופ פיזור ראמאן מגורה

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology. Live-cell imaging with SRS has been demonstrated for many ...

טכניקת התא הסביבתי הגמישה מאפשרת קיטועי זמן כהדמיית SRS עם זיהוי אותות משודרים במסגרת מיקרוסקופ הפעלה. מיקרוסקופ SRS השתמש ביעד צמצם מספרי גבוה ובמעבה בעל קצה גבוה, והשאיר רק מרווח של מילימטרים ספורים שבו תא קונבנציונלי אינו יכול להתאים. תא גמיש פותר בעיה זו.חוקרים המשתמשים במיקרוסקופ SRS יכולים לאמץ בקלות טכניקה זו. ניתן להשתמש בתא הגמיש גם במיקרוסקופ מנתח או סטרילי כדי לשמור על הדגימה בתנאים פיזיולוגיים אופטימליים. כדי להתחיל, סמן את מיקומי כפות הרגליים של מסגרת המיקרוסקופ SRS ואת השלב הממונע באמצעות עט סמן על השולחן האופטי.לאחר הסרת מסגרת המיקרוסקופ והבמה מהשולחן האופטי, הניחו את יריעת גומי הסיליקון על השולחן. חותכים את גומי הסיליקון לאורך הסימנים באמצעות סכין. הוציאו חתיכות גומי קטנות, והניחו את יריעות הנציץ הקרמיות המרובעות באותם מיקומים.לאחר מכן הזיזו את מסגרת המיקרוסקופ ואת הבמה בחזרה לשולחן האופטי ויישרו בזהירות את כפות הרגליים על יריעות הנציץ הקרמיות לאורך קווי הסמן. לאחר יישור מחדש של הנתיב האופטי SRS, הרכיבו את המארז הסביבתי על גבי בסיס הבידוד התרמי כדי לכסות את כל מסגרת המיקרוסקופ, באמצעות חמש חתיכות של יריעות פוליקרבונט גדולות. אטמו את הקצוות והממשקים של הקופסה באמצעות נייר אלומיניום.חבר את צינור התעלה הגמיש לכניסה וליציאות היציאה של תיבת המארז כדי לאפשר זרימת אוויר חם במחזור הדם הנשאב ונשלט על ידי מודול המחמם. הרכיבו את חתיכת האלומיניום הגלילית החלולה במכונה 1 לחתיכת האף של המטרה באמצעות שלושה ברגים קבועים. לאחר מכן, הרכיבו את פיסת האלומיניום הגלילית החלולה במכונה 2 למחזיק הדגימה באמצעות ארבעה ברגים.הכנס את מחזיק הדגימה עם חתיכת אלומיניום 2 על הבמה הממונעת והרכיב אותו באמצעות ברגים. הניחו את שרוול סרט הגומי הטבעי בין שני חלקי האלומיניום המיוצרים במכונה והרכיבו אותו באמצעות גומיות בכל קצה. חבר את גליל ה- CO2 הדחוס למודול מערבל הגז באמצעות צינורות ומחברים מתאימים.הגדר את לחץ הכניסה של CO2 על 20 עד 25 psi. השתמש בחיישן CO2 המובנה ובבקר כדי להבטיח שמודול מערבל האוויר יכול לווסת ולערבב 5% CO2 בזרימת האוויר. השתמש במסננים מוטבעים כדי לנקות את זרימת האוויר.באמצעות צינורות ומחברים מתאימים, כוונו את האוויר המעורב לבקבוק המים המעוקר מראש שהונח על הפלטה החמה ולאחר מכן כוונו את האוויר הלח לתא הגמיש. כוונו את הפלטה החמה ל-37 מעלות צלזיוס. בוערו את זרימת האוויר במים החמים כדי להגביר את הלחות של זרימת האוויר.נתק את המכונה אלומיניום חתיכת 2 ממחזיק הדגימה על ידי הסרת הברגים. נגבו את כל חלקי התא הגמיש עם 70% אתנול, כולל פיסת האף, מחזיק הדגימה ויעד טבילת המים. לטהר את כל מערכת המארז באמצעות מנורת UV להציב במארז במשך 20 עד 30 דקות.לאחר מכן לטעון את צלחת תרבית התא. הסר את מכסה המנה ולשתק אותו באמצעות מלחציים. הנמיכו את המטרה למדיה של תרבית התאים למיקוד גס.מנמיכים את חתיכת האלומיניום 2 כדי לתחום את התא הגמיש ולהרכיב אותו על מחזיק הדגימה באמצעות ברגים. לאחר מכן הכנס את החיישן. הגדר את אספקת האוויר עם 5% CO2 ו- 19% O2 לתרבית תאים רגילה עם קצב זרימת אוויר של 200 סנטימטרים מעוקבים לדקה וטמפרטורה ל -37 מעלות צלזיוס.כוונן את אורך גל הלייזר ל 805 ננומטר כדי לכוון את שינוי ראמאן הופכי 2, 854 סנטימטר, אשר מיוחס לרטט של קשרים כימיים CH2. השתמש בעוצמת לייזר נמוכה כדי להפחית את נזקי הצילום לתאים. התאם ומקד את המטרה כדי להשיג הדמיית SRS טובה של התאים באמצעות לחצן המיקוד בלוח הבקרה הראשי של התוכנה.כדי לבצע מיקוד מהיר, הגדר את מספר הפיקסלים ל- 512 על 512 פיקסלים עם זמן שהייה של 4.8 מיקרו-שניות בלוח התצורה. לאחר השגת מיקוד טוב, הגדר את רזולוציית ההדמיה להיות 2048 על ידי 2048 פיקסלים עבור שדה ראייה בריבוע של 175 מיקרומטר לרכישת תמונות באיכות גבוהה. בדוק את פונקציית השמירה בלוח הבקרה הראשי ובדוק את ערוץ SRS בחלונית הערוצים.הגדר את מרווח הזמן בין שתי מסגרות ל- 180 שניות בערוץ הפקדים הראשי. הגדר את מספר הרכישה ל- 480 עבור הדמיה בהילוך מהיר במשך 24 שעות. הפעל רכישת הדמיה אוטומטית באמצעות פונקציית הלולאה בלוח הבקרה הראשי.הביצועים של מערכת התא הגמיש להדמיית SRS בהילוך מהיר הוערכו. הטמפרטורה בתוך המתחם הסביבתי במיקרוסקופ הגיעה ל-37 מעלות צלזיוס הצפויות ולא השפיעה באופן משמעותי על טמפרטורת החדר. הטמפרטורה בתא הגמיש הגיעה ל-37 מעלות צלזיוס תוך שעה וחצי ונשמרה ביציבות במשך 24 שעות לפחות.הלחות היחסית בתא הגמיש הגיעה ל-85% בשעה אחת וניתן היה לשמור עליה לפחות 24 שעות. הדמיית SRS בהילוך מהיר של תאי SKOV3 חיים הראתה תנועה מהירה ופעילה של טיפות שומנים תוך תאיות ברזולוציה זמנית של שלוש דקות. בסוף סשן ההדמיה שארך 24 שעות, התאים עדיין הראו מורפולוגיה וצפיפות תקינות, מה שמצביע על כך שהתאים היו בריאים.לאחר מכן, תאי SKOV3 שטופלו בחומצה אולאית צולמו והצטברות טיפות שומנים הייתה במעקב במשך 10 שעות. כמויות טיפות השומנים כומתו באמצעות יחס טיפת השומנים לשטח גוף התא ועוצמת SRS הכוללת של טיפות השומנים. התוצאות מצביעות על כך שכמות טיפות השומנים המשיכה לעלות במשך 10 שעות.כמו כן הודגמה הדמיית SRS קדמית סימולטנית של טיפות שומנים והדמיית פלואורסצנטיות של שני פוטונים לאחור של ליזוזומים המסומנים בצבע פלואורסצנטי DND-189. נצפתה רמה נמוכה מאוד של קולוקליזציה של טיפות שומנים וליזוזומים. בעת ניסיון פרוטוקול זה, זכור כי נדידת מוקד היא בעיה נפוצה בדימות תאים חיים.ייתכן שיהיה צורך במיקוד מחדש לאחר כשעתיים של הדמיה בהילוך מהיר. לאחר פיתוחו, הדמיית SRS בהילוך מהיר שימשה למחקרים שונים כדי לעקוב אחר מולקולות ללא תוויות או מולקולות מסומנות עם טקסט ראמאן בתאים חיים.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

הכנת הדגימה, הדמיה, ניתוח הפרוטוקולים מיקרוסקופית סכין קצה סריקה

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

זמן לשגות דימות פלואורסצנטי של צמיחה רוט ארבידופסיס עם מניפולציה מהירה של הסביבה רוט שימוש RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

יצירת Gradients הדבק והמסיס לנדידת תאי דימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Sample Drift Correction Following 4D Confocal Time-lapse Imaging

תיקון להיסחף לדוגמא בעקבות הזמן לשגות הדמיה 4D Confocal

The generation of four-dimensional (4D) confocal datasets; consisting of 3D image sequences over time; provides an excellent methodology to capture ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

מהדמיה מהירה פלואורסצנטי לחוק דיפוזיה מולקולרי בקרום תא חי במיקרוסקופ מסחרי

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

הקרינה-מרווה של Fluorophore הקרוב אינפרא אדום-כמוס liposomal ככלי ל<em&gt; In vivo</em&gt; דימות אופטי

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

הדמיה של תא חי במהלך מכאני למתוח

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

דפוסי Subtractive מהירים של שכבות תא חיות עם בדיקת Microfluidic

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

להמחיש אדהזיה היווצרות בתאים באמצעות מתקדם ספינינג מיקרוסקופ פלורסצנטיות השתקפות פנימית דיסק-סיכום

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

מדידה רציפה של רעש ביולוגי ב Escherichia קולי באמצעות מיקרוסקופיה לשגות זמן

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process ...