Name: a flexible chamber for time-lapse live-cell imaging with stimulated raman scattering microscopy
Uploaded: 2022-08-31T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Flexible Chamber for Time-Lapse Live-Cell Imaging with Stimulated Raman Scattering Microscopy at JoVE.com

현미경 인클로저 상자의 설계, 제작 및 테스트에 대해 Binghamton University의 2019년 학부 수석 디자인 팀(윤석철, Ian Foxton, Louis Mazza 및 James Walsh)에게 감사드립니다. 도움이 되는 토론을 해주신 Binghamton University의 Scott Hancock, Olga Petrova, Fabiola Moreno Olivas에게 감사드립니다. 이 연구는 수상 번호 R15GM140444에 따라 국립 보건원(National Institutes of Health)의 지원을 받았습니다.

1. 현미경 환경 인클로저 구축
참고: 이 대형 현미경 환경 인클로저는 현미경 본체의 온도와 이미징 환경을 37°C에서 안정화하는 데 사용됩니다(그림 1A).
<ol><li>광학 테이블의 마커 펜을 사용하여 SRS 현미경 프레임과 전동 스테이지의 발 위치를 표시합니다. 현미경의 검류계 스캐너 앞에 두 개의 홍채 다이어프램을 장착하고 펌프와 Stokes 레이저 빔이 조?...

<ol>
	<li>Mertz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Introduction to Optical Microscopy. , (2019).</li><li>Ettinger, A., Wittmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+live+cell+imaging.">Fluorescence live cell imaging.</a> Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).</li><li>Park, Y., Depeursinge, C., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+phase+imaging+in+biomedicine.">Quantitative phase imaging in biomedicine.</a> Nature Photonics. 12 (10), 578-589 (2018).</li><li>Hu, C. D., Kerppola, T. 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타임랩스 라이브 셀 SRS 현미경은 라벨 없는 방식으로 분자 추적을 위한 대체 이미징 기술입니다. 형광 표지와 비교하여 SRS 이미징은 광표백이 없어 분자를 장기간 모니터링할 수 있습니다. 그러나, 현재까지, 직립 SRS 현미경 상의 라이브 세포 이미징 시스템은 상업적으로 이용가능하지 않다. 이 작업에서는 안정적인 단열 현미경 인클로저 상자와 유연한 내부 소프트 챔버가 있는 라이브 셀 이미징...

광학 현미경은 샘플의 미세 구조를 관찰하는 데 사용됩니다. 광학 이미징은 다른 기술보다 빠르고, 덜 침습적이며, 덜 파괴적입니다1. 광학 현미경을 이용한 생세포 이미징은 장기간에 걸쳐 배양된 생세포의 역학을 포착하기 위해 개발되었다2. 다양한 유형의 광학 대비는 생물학적 샘플에 대한 뚜렷한 정보를 제공합니다. 예를 들어, 광학 위상 현미경은 샘플3에 걸친 굴절률의 미묘한 차이를 보여줍니다. 형광 현미경은 특정 생체 분자 또는 세포 소기관을 이미지화하는 데 널리 사용됩니다. 그러나, 형광의 광대역 여기 및 방출 스펙트럼은 일반적으로 다색 이미징이 수행될 때 스펙트럼 중첩을 초래한다4. 형광 분자는 빛에 민감하며 장기적이고 주기적으로 빛에 노출되면 표백될 수 있습니다. 또한, 형광 표지는 세포 내 분자의 생체 분포를 변화시킬 수 있다5. SRS 현미경은 무표지 화학 이미징 기술입니다6. SRS의 대비는 특정 화학 결합의 진동 전이에 의존합니다. 화학 결합의 진동 주파수는 종종 좁은 스펙트럼 대역폭을 나타내므로 동일한 샘플에서 여러 라만 대역을 이미지화하는 것이 가능합니다7. SRS 현미경은 살아있는 세포 이미징을 위한 고유한 도구로, 라벨 없는 방식으로 여러 화학적 대조를 제공합니다8.
염색되지 않은 세포의 SRS 이미징은 많은 연구에 사용되었지만 살아있는 세포의 장기 타임랩스 SRS 이미징은 널리 채택되지 않았습니다. 한 가지 이유는 상업용 개방형 챔버가 두께9,10,11,12의 크기 때문에 SRS 이미징에 직접 사용할 수 없기 때문입니다. 유리 뚜껑이 있는 이 챔버는 대부분 역방향 검출 체계와 함께 단일 높은 NA 대물렌즈를 사용하는 명시야 또는 형광 이미징을 위해 설계되었습니다. 그러나, SRS 이미징은 높은 NA 대물렌즈와 높은 NA 콘덴서를 모두 사용하는 송신 검출을 선호하며, 이는 대물렌즈와 콘덴서 사이에 매우 짧은 갭(전형적으로 수 밀리미터)만을 남긴다. 이 문제를 극복하기 위해 우리는 직립 현미경 프레임을 사용하여 살아있는 세포의 타임랩스 SRS 이미징을 가능하게 하는 부드러운 재료를 사용하여 유연한 챔버를 설계했습니다. 이 설계에서 침수 대물렌즈는 소프트 챔버에 둘러싸여 있으며 초점 및 이미징 목적을 위해 3차원으로 자유롭게 이동할 수 있습니다.
대부분의 포유류 세포를 배양하기 위한 최적의 온도는 37°C인 반면 실온은 항상 이보다 10° 낮습니다. 37°C보다 높거나 낮은 온도는 세포 성장률에 극적인 영향을 미친다13. 따라서 생세포 이미징 시스템에서는 세포 배양 환경의 온도 제어가 필요합니다. 온도 불안정은 장시간 이미징 중에 초점 흐림으로 이어지는 것으로 알려져 있다14. 안정적인 37°C 환경을 달성하기 위해 현미경 아래의 단열층을 포함하여 전체 현미경 프레임을 덮을 수 있는 대형 인클로저 챔버를 구축했습니다(그림 1). 크기가 큰 온도 제어 챔버 내에서 작고 유연한 챔버는 5%CO2로 보충된 조절된 공기 흐름을 통해 생리학적 습도와 pH를 정확하게 유지하는 데 도움이 됩니다(그림 2). 챔버의 온도 및 습도를 측정하여 이중 챔버 설계가 장기적이고 주기적인 SRS 이미징 하에서 세포 성장을 위한 최적의 세포 배양 조건을 제공하는지 확인했습니다(그림 3). 그런 다음 SKOV3 암세포에서 시간 경과 이미징 및 지질 방울(LD) 추적을 위한 시스템의 적용을 시연했습니다(그림 4, 그림 5 및 그림 6).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A lab-built SRS microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://rdcu.be/cP6ve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HF2LI 50 MHz lock-in amplifer</td>
			<td>Zurich Instruments</td>
			<td>HF2LI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris diaphragm</td>
			<td>Thorlabs Inc</td>
			<td>SM1D12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinematic mirror mount</td>
			<td>Thorlabs Inc</td>
			<td>KM100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope frame</td>
			<td>Nikon Inc</td>
			<td>FN-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized microscopy stage</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>Z-Deck</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil-immersion condenser (C-AA Achromat/Aplanat, NA 1.4)</td>
			<td>Nikon Inc</td>
			<td>MBL71405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-immersion objective (CFI75 Apo 25XC W 1300)</td>
			<td>Nikon Inc</td>
			<td>MRD77225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials and parts for the microscope enclosure (31&#39;&#39; x 29&#39;&#39; x 28&#39;&#39; L x W x H)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airtherm heater module</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>AIRTHERM-SAT-1W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airtherm heater controller, CO2 and humidity monitor</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>AIRTHERM-SMT-1W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air/CO2 mixer module</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>ECU-HOC-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible duct hose (2-1/2&#39;&#39; ID, 2-3/4&#39;&#39; OD)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>56675K71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-temperature glass-mica ceramic, easy-to-machine (6&#39;&#39; x 6&#39;&#39;, 1/4&#39;&#39; thickness)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8489K62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate sheets (thickness 0.25&#39;&#39;)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8574K286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone rubber sheets (36&#39;&#39; x 36&#39;&#39;, thickness 1/8&#39;&#39;)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5827T43</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials and parts for the Flexible chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>31745K11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-purity inline filter, 1/4 NPT</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>6645T18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hole saw (cutting diameter 1-7/8 inch)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>4066A34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hole saw (cutting diameter 50 mm)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>4556A19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-temperature silicone rubber tubing, soft, 2 mm ID, 5 mm OD</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5054K313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline filter (1/4 NPT, 40 micron)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>98385K843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipurpose 6061 Aluminum round tube (1/8&#39;&#39; wall thickness, 4&#39;&#39; OD)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9056K42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipurpose 6061 Aluminum round tube (3/4&#39;&#39; wall thickness, 3-3/4&#39;&#39; OD)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9056K47</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipurpose 6061 Aluminum bar (12&#39;&#39; x 12&#39;&#39;, thickness 1/4&#39;&#39;)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8975K142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipurpose 6061 Aluminum bar (8&#39;&#39; x 8&#39;&#39;, thickness 3/8&#39;&#39;)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9246K21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective nosepiece (single)</td>
			<td>Nikon Inc</td>
			<td>FN-MN-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample holder (modified)</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>HZ202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-thin natural rubber film (thickness 0.01&#39;&#39;)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8611K13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum-sealable glass jar</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>3231T44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ (Fiji)</td>
			<td></td>
			<td>imagej.net</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScanImage</td>
			<td>Vidrio Technologies, LLC</td>
			<td></td>
			<td>SRS imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials for live-cell imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass bottom sterile culture dishes (Dia.x H, 50 x 7 mm)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>70674-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM cell culture medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoSensor fluorescent dye DND-189</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L7535 (Invitrogen)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>364525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SKOV3 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-77</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a flexible chamber for time-lapse live-cell imaging with stimulated raman scattering microscopy

자극 라만 산란(SRS) 현미경은 라벨이 필요 없는 화학 이미징 기술입니다. SRS를 사용한 생세포 이미징은 많은 생물학적 및 생물 의학 응용 분야에서 입증되었습니다. 그러나, 살아있는 세포의 장기 타임랩스 SRS 이미징은 널리 채택되지 않았다. SRS 현미경은 고해상도 이미징을 달성하기 위해 높은 개구수(NA) 침수 대물렌즈와 높은 NA 오일 이멀젼 콘덴서를 사용하는 경우가 많습니다. 이 경우 대물렌즈와 콘덴서 사이의 간격은 몇 밀리미터에 불과합니다. 그러므로, 대부분의 상업적인 단계 정상 환경 약실은 단단한 유리제 덮개를 가진 그들의 큰 간격 때문에 SRS 화상 진찰을 위해 이용될 수 없습니다. 이 백서는 정립 현미경 프레임에서 전송된 SRS 신호 감지를 통해 타임랩스 라이브 셀 이미징에 사용할 수 있는 유연한 챔버의 설계 및 제작에 대해 설명합니다. 챔버의 유연성은 얇은 천연 고무 필름 인 부드러운 소재를 사용하여 달성됩니다. 새로운 인클로저 및 챔버 설계는 기존 SRS 이미징 설정에 쉽게 추가할 수 있습니다. 테스트 및 예비 결과는 플렉서블 챔버 시스템이 향후 다양한 바이오이미징 애플리케이션에 사용될 수 있는 살아있는 세포의 안정적이고 장기적인 타임랩스 SRS 이미징을 가능하게 한다는 것을 보여줍니다.

타임랩스 SRS 이미징을 위한 플렉시블 챔버 시스템을 제작 및 조립한 다음(그림 1 및 그림 2) 시스템의 성능을 평가했습니다. 현미경 환경 인클로저 내부의 온도는 1시간 이내에 예상 37°C에 도달했으며, 이는 실내 온도에 큰 영향을 미치지 않았습니다(그림 3A). 가요성 챔버 내의 온도는 1.5 시간 내에 37 °C에 도달하였고, 적어도 24 시...

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A Flexible Chamber for Time-Lapse Live-Cell Imaging with Stimulated Raman Scattering Microscopy

우리는 전송된 신호 감지 기능이 있는 직립 자극 라만 산란 현미경을 사용하여 살아있는 세포의 타임랩스 이미징을 위한 무대 상단의 유연한 환경 챔버를 보고합니다. 지질 방울은 3분 시간 간격으로 최대 24시간 동안 올레산으로 처리된 SKOV3 세포에서 이미지화되었습니다.

자극 라만 산란 현미경을 사용한 타임랩스 라이브 셀 이미징을 위한 유연한 챔버

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology. Live-cell imaging with SRS has been demonstrated for many ...

유연한 환경 챔버 기술은 작동 현미경 프레임에서 전송된 신호 감지를 통해 SRS 이미징으로 타임랩스를 가능하게 합니다. SRS 현미경은 높은 개구수 대물렌즈와 고급 콘덴서를 사용하여 기존 챔버가 들어갈 수 없는 몇 밀리미터의 간격만 남겼습니다. 유연한 챔버는 이 문제를 해결합니다.SRS 현미경을 사용하는 연구원은 이 기술을 쉽게 채택할 수 있습니다. 유연한 챔버는 또한 최적의 생리학적 조건에서 표본을 유지하기 위해 해부 또는 멸균 현미경에 사용할 수 있습니다. 시작하려면 광학 테이블의 마커 펜을 사용하여 SRS 현미경 프레임과 전동 스테이지의 발 위치를 표시하십시오.현미경 프레임과 s를 제거한 후tage 광학 테이블에서 실리콘 고무 시트를 테이블 위에 놓습니다. 칼을 사용하여 표시를 따라 실리콘 고무를 자릅니다. 작은 고무 조각을 제거하고 정사각형 운모 세라믹 시트를 같은 위치에 놓습니다.그런 다음 현미경 프레임과 스테이지를 광학 테이블로 다시 이동하고 마커 라인을 따라 발을 운모 세라믹 시트에 조심스럽게 맞춥니다. SRS 광학 경로를 재정렬한 후 5개의 대형 폴리카보네이트 시트를 사용하여 전체 현미경 프레임을 덮도록 단열 기초 위에 환경 인클로저를 조립합니다. 알루미늄 호일 테이프를 사용하여 상자의 가장자리와 인터페이스를 밀봉합니다.플렉시블 덕트 호스를 인클로저 상자의 입구 및 출구 포트에 연결하여 순환되고 따뜻한 공기 흐름이 히터 모듈에 의해 펌핑되고 제어되도록 합니다. 3개의 고정 나사를 사용하여 가공된 중공 원통형 알루미늄 조각 1을 대물렌즈의 노즈 피스에 장착합니다. 다음으로, 4개의 나사를 사용하여 가공된 중공 원통형 알루미늄 조각 2를 샘플 홀더에 장착합니다.알루미늄 조각 2가 있는 샘플 홀더를 전동 스테이지에 장착하고 나사를 사용하여 장착합니다. 가공된 두 개의 알루미늄 조각 사이에 천연 고무 필름 슬리브를 놓고 양쪽 끝에 고무 밴드를 사용하여 장착합니다. 적절한 튜브와 커넥터를 사용하여 압축된 CO2 실린더를 가스 혼합기 모듈에 연결합니다.CO2 입력 압력을 20-25psi로 설정합니다. 내장된 CO2 센서와 컨트롤러를 사용하여 에어 믹서 모듈이 5%CO2를 조절하고 공기 흐름에 혼합할 수 있는지 확인합니다. 인라인 필터를 사용하여 공기 흐름을 청소하십시오.적절한 튜브와 커넥터를 사용하여 혼합 공기를 핫플레이트에 놓인 사전 멸균된 물병으로 안내한 다음 가습된 공기를 유연한 챔버로 안내합니다. 핫플레이트를 섭씨 37도로 설정합니다. 따뜻한 물에 공기 흐름을 거품을 일으켜 공기 흐름의 습도를 높입니다.s에서 기계 알루미늄 조각 2를 분리합니다.amp나사를 제거하여 홀더. 노즈 피스를 포함하여 플렉시블 챔버의 모든 부분을 70% 에탄올로 닦습니다.ample 홀더 및 물 담그기 목표. UV 램프를 사용하여 전체 인클로저 시스템의 오염을 제거합니다.amp 인클로저에 20-30분 동안 배치합니다.그런 다음 세포 배양 접시를 넣습니다. 접시의 덮개를 제거하고 클램프를 사용하여 고정하십시오. 대략적으로 초점을 맞추기 위해 대물렌즈를 세포 배양 배지로 내립니다.알루미늄 조각 2를 내려 유연한 챔버를 둘러싸고 나사를 사용하여 샘플 홀더에 장착합니다. 그런 다음 센서를 삽입합니다. 일반 세포 배양을 위해 5% CO2 및 19% O2로 공기 공급을 분당 200입방센티미터의 공기 흐름 속도와 섭씨 37도로 설정합니다.레이저 파장을 805 나노 미터로 조정하여 CH2 화학 결합의 진동에 기인하는 2, 854 센티미터 역 라만 시프트를 목표로합니다. 낮은 레이저 출력을 사용하여 세포의 사진 손상을 줄입니다. 소프트웨어의 기본 컨트롤 패널에 있는 초점 버튼을 사용하여 세포의 우수한 SRS 이미징을 얻을 수 있도록 대물렌즈를 조정하고 초점을 맞춥니다.빠른 초점을 맞추려면 구성 패널에서 픽셀 번호를 512 x 512 픽셀로 설정하고 픽셀 유지 시간을 4.8마이크로초로 설정합니다. 초점을 잘 맞춘 후 고품질 이미지를 획득하기 위해 이미징 해상도를 2048마이크로미터 제곱 화각에 대해 2048 x 175 픽셀로 설정합니다. 메인 컨트롤 패널에서 저장 기능을 확인하고 채널 패널에서 SRS 채널을 확인합니다.메인 컨트롤 채널에서 두 프레임 사이의 간격 시간을 180초로 설정합니다. 24시간 이상의 타임랩스 이미징을 위해 획득 번호를 480으로 설정합니다. 메인 컨트롤 패널의 루프 기능을 사용하여 자동 이미징 획득을 시작합니다.타임랩스 SRS 이미징을 위한 플렉시블 챔버 시스템의 성능을 평가하였다. 현미경 환경 인클로저 내부의 온도는 예상 섭씨 37도에 도달했으며 실온에 큰 영향을 미치지 않았습니다. 플렉시블 챔버의 온도는 1.5 시간 만에 섭씨 37도에 도달했으며 최소 24 시간 동안 안정적으로 유지되었습니다.가동 가능한 약실에 있는 상대 습도는 1 시간 동안 85%를 도달하고 적어도 24 시간 동안 유지될 수 있었습니다. 살아있는 SKOV3 세포의 타임 랩스 SRS 이미징은 3 분의 시간 분해능으로 세포 내 지질 방울의 빠르고 활동적인 움직임을 보여주었습니다. 24시간 이미징 세션이 끝날 때까지 세포는 여전히 정상적인 형태와 밀도를 보였으며 이는 세포가 건강했음을 나타냅니다.다음으로, 올레산을 처리한 SKOV3 세포를 영상화하고, 10시간에 걸쳐 지질 액적 축적을 추적하였다. 지질 액적의 양은 지질 액적 대 세포체 면적 비율 및 지질 액적의 총 SRS 강도를 사용하여 정량화하였다. 결과는 지질 방울의 양이 10시간 동안 계속 증가했음을 나타냅니다.형광 염료 DND-189로 표지된 리소좀의 지질 방울의 동시 순방향 SRS 이미징 및 후방 2광자 형광 이미징도 입증되었습니다. 지질 방울과 리소좀의 매우 낮은 정도의 공동 국소화가 관찰되었습니다. 이 프로토콜을 시도할 때 초점 드리프트는 라이브 셀 이미징에서 일반적인 문제라는 점을 명심하십시오.약 2시간의 타임랩스 이미징 후에 초점을 다시 맞춰야 할 수 있습니다. 개발 후, 타임랩스 SRS 이미징은 살아있는 세포에서 라벨이 없는 분자 또는 라만 텍스트가 있는 라벨링된 분자를 추적하기 위한 다양한 연구에 사용되었습니다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

나이프 - 에지 스캐닝 현미경에 대한 표본 준비, 이미징 및 분석 프로토콜

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

연구

생체공학

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

RootChip를 사용하여 루트 환경의 신속한 조작과 Arabidopsis 루트 성장의 시간 저속 형광 이미징

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

형광 현미경과 영상 셀 마이그레이션을위한 접착제 및 가용성식이 그라디언트를 만들기

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Sample Drift Correction Following 4D Confocal Time-lapse Imaging

4D 공 촛점 시간 경과 이미징을 다음 샘플 편차 수정

The generation of four-dimensional (4D) confocal datasets; consisting of 3D image sequences over time; provides an excellent methodology to capture ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

상용 현미경에서 라이브 세포막에 분자 확산 법률에 빠른 형광 이미징

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

위한 도구로 리포좀 캡슐화 된 근적외선 형광의 형광 담금질<em&gt; 생체</em&gt; 광학 이미징

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

기계 스트레치 동안 라이브 세포 이미징

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

미세 유동 프로브와 라이브 셀 레이어의 빠른 빼기 패터닝

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

회전 디스크-총 내부 반사 형광 현미경 검사 법 고급 시각화에 의해 세포 접착 형성

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

시간 경과 현미경 검사를 사용하여 대장균에서 생물학적 소음의 지속적인 측정

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process ...