Name: a flexible chamber for time-lapse live-cell imaging with stimulated raman scattering microscopy
Uploaded: 2022-08-31T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Flexible Chamber for Time-Lapse Live-Cell Imaging with Stimulated Raman Scattering Microscopy at JoVE.com

Queremos agradecer à Equipe de Design Sênior de Graduação de 2019 (Suk Chul Yoon, Ian Foxton, Louis Mazza e James Walsh) da Universidade de Binghamton pelo projeto, fabricação e teste da caixa de gabinete do microscópio. Agradecemos a Scott Hancock, Olga Petrova e Fabiola Moreno Olivas da Universidade de Binghamton pelas discussões úteis. Esta pesquisa foi apoiada pelo National Institutes of Health sob o número de prêmio R15GM140444.

1. Construa o gabinete ambiental do microscópio
NOTA: Este grande gabinete ambiental do microscópio é usado para controlar a temperatura do corpo do microscópio e o ambiente de imagem a ser estabilizado em 37 °C (Figura 1A).
<ol><li>Marque a localização dos pés do quadro do microscópio SRS e do estágio motorizado usando uma caneta marcadora na mesa óptica. Monte dois Diafragmas de Íris na frente do scanner Galvanômetro do microscópio e ajuste para ...

<ol>
	<li>Mertz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Introduction to Optical Microscopy. , (2019).</li><li>Ettinger, A., Wittmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+live+cell+imaging.">Fluorescence live cell imaging.</a> Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).</li><li>Park, Y., Depeursinge, C., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+phase+imaging+in+biomedicine.">Quantitative phase imaging in biomedicine.</a> Nature Photonics. 12 (10), 578-589 (2018).</li><li>Hu, C. D., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+multiple+protein+interactions+in+living+cells+using+multicolor+fluorescence+complementation+analysis.">Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis.</a> Nature Biotechnology. 21 (5), 539-545 (2003).</li><li>lamo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+dye+labeling+changes+the+biodistribution+of+tumor-targeted+nanoparticles.">Fluorescent dye labeling changes the biodistribution of tumor-targeted nanoparticles.</a> Pharmaceutics. 12 (11), 1004 (2020).</li><li>Cheng, J. X., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrational+spectroscopic+imaging+of+living+systems:+An+emerging+platform+for+biology+and+medicine.">Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine.</a> Science. 350 (6264), aaa870 (2015).</li><li>Lu, F. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+DNA+imaging+in+vivo+with+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).</li><li>Hill, A. H., Fu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+imaging+using+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Cellular imaging using stimulated Raman scattering microscopy.</a> Analytical Chemistry. 91 (15), 9333-9342 (2019).</li><li>Bu&#273;a, R., Vuku&#353;i&#263;, K., Toli&#263;, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Cell Biology. (139), 81-101 (2017).</li><li>Chiarelli, T. J., Grieshaber, N. A., Grieshaber, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+forward+genetic+approach+to+identify+and+isolate+developmental+mutants+in+Chlamydia+trachomatis.">Live-cell forward genetic approach to identify and isolate developmental mutants in Chlamydia trachomatis.</a> Journal of Visualized Experiments. (160), e61365 (2020).</li><li>Lemon, W. C., McDole, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+in+the+era+of+too+many+microscopes.">Live-cell imaging in the era of too many microscopes.</a> Current Opinion in Cell Biology. 66, 34-42 (2020).</li><li>Birk, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+oral+biofilms+by+nisin+delivery+in+adhesive+microdevices.">Management of oral biofilms by nisin delivery in adhesive microdevices.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 167, 83-88 (2021).</li><li>Watanabe, I., Okada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+temperature+on+growth+rate+of+cultured+mammalian+cells+(L5178Y).">Effects of temperature on growth rate of cultured mammalian cells (L5178Y).</a> Journal of Cell Biology. 32 (2), 309-323 (1967).</li><li>Lac, A., Lam, A. L., Heit, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fluorescent Microscopy. , 57-73 (2022).</li><li>Grossman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Machinable+glass-ceramics+based+on+tetrasilicic+mica.">Machinable glass-ceramics based on tetrasilicic mica.</a> Journal of the American Ceramic Society. 55 (9), 446-449 (1972).</li><li>Yuan, Y., Shah, N., Almohaisin, M. I., Saha, S., Lu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+fatty+acid-induced+lipotoxicity+and+its+therapeutic+potential+in+glioblastoma+using+stimulated+Raman+microscopy.">Assessing fatty acid-induced lipotoxicity and its therapeutic potential in glioblastoma using stimulated Raman microscopy.</a> Scientific Reports. 11 (1), 1-14 (2021).</li><li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScanImage:+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes.">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomedical Engineering Online. 2 (1), 1-9 (2003).</li><li>Sun, M. W., Yuan, Y. H., Lu, F. K., Di Pasqua, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physicochemical+factors+that+influence+the+biocompatibility+of+cationic+liposomes+and+their+ability+to+deliver+DNA+to+the+nuclei+of+ovarian+cancer+SK-OV-3+cells.">Physicochemical factors that influence the biocompatibility of cationic liposomes and their ability to deliver DNA to the nuclei of ovarian cancer SK-OV-3 cells.</a> Materials. 14 (2), 416 (2021).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Ozeki, Y., Itoh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulated+Raman+scattering+microscopy+for+live-cell+imaging+with+high+contrast+and+high+sensitivity.">Stimulated Raman scattering microscopy for live-cell imaging with high contrast and high sensitivity.</a> Laser Physics. 20 (5), 1114-1118 (2010).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+live-cell+imaging+of+nucleic+acids+using+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Label-free live-cell imaging of nucleic acids using stimulated Raman scattering microscopy.</a> ChemPhysChem. 13 (4), 1054-1059 (2012).</li><li>Stiebing, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+Raman+and+SRS+imaging+of+living+human+macrophages+reveals+cell-to-cell+heterogeneity+and+dynamics+of+lipid+uptake.">Real-time Raman and SRS imaging of living human macrophages reveals cell-to-cell heterogeneity and dynamics of lipid uptake.</a> Journal of Biophotonics. 10 (9), 1217-1226 (2017).</li><li>Miao, K., Wei, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+and+quantification+of+PolyQ+aggregates+by+stimulated+Raman+scattering+of+selective+deuterium+labeling.">Live-cell imaging and quantification of PolyQ aggregates by stimulated Raman scattering of selective deuterium labeling.</a> ACS Central Science. 6 (4), 478-486 (2020).</li><li>Brzozowski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulated+Raman+scattering+microscopy+in+chemistry+and+life+science+-Development,+innovation,+perspectives.">Stimulated Raman scattering microscopy in chemistry and life science -Development, innovation, perspectives.</a> Biotechnology Advances. 60, 108003 (2022).</li><li>Hislop, E. W., Tipping, W. J., Faulds, K., Graham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+imaging+of+lipid+droplets+in+prostate+cells+using+stimulated+Raman+scattering+microscopy+and+multivariate+analysis.">Label-free imaging of lipid droplets in prostate cells using stimulated Raman scattering microscopy and multivariate analysis.</a> Analytical Chemistry. 94 (25), 8899-8908 (2022).</li><li>Chen, T., Yavuz, A., Wang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+lipid+droplet+biology+with+coherent+Raman+scattering+microscopy.">Dissecting lipid droplet biology with coherent Raman scattering microscopy.</a> Journal of Cell Science. 135 (5), jcs252353 (2022).</li><li>Cao, C., Zhou, D., Chen, T., Streets, A. M., Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-Free+digital+quantification+of+lipid+droplets+in+single+cells+by+stimulated+Raman+microscopy+on+a+microfluidic+platform.">Label-Free digital quantification of lipid droplets in single cells by stimulated Raman microscopy on a microfluidic platform.</a> Analytical Chemistry. 88 (9), 4931-4939 (2016).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulated+Raman+scattering+flow+cytometry+for+label-free+single-particle+analysis.">Stimulated Raman scattering flow cytometry for label-free single-particle analysis.</a> Optica. 4 (1), 103-109 (2017).</li><li>Suzuki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+chemical+imaging+flow+cytometry+by+high-speed+multicolor+stimulated+Raman+scattering.">Label-free chemical imaging flow cytometry by high-speed multicolor stimulated Raman scattering.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (32), 15842-15848 (2019).</li><li>Gala de Pablo, J., Lindley, M., Hiramatsu, K., Goda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+Raman+flow+cytometry+and+beyond.">High-throughput Raman flow cytometry and beyond.</a> Accounts of Chemical Research. 54 (9), 2132-2143 (2021).</li><li>Cole, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging:+the+cell's+perspective.">Live-cell imaging: the cell's perspective.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. 8 (5), 452-459 (2014).</li><li>Kreft, M., Stenovec, M., Zorec, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focus-drift+correction+in+time-lapse+confocal+imaging.">Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1048 (1), 321-330 (2005).</li><li>Firestone, L., Cook, K., Culp, K., Talsania, N., Preston Jr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+autofocus+methods+for+automated+microscopy.">Comparison of autofocus methods for automated microscopy.</a> Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 12 (3), 195-206 (1991).</li><li>Van Helvert, S., Storm, C., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanoreciprocity+in+cell+migration.">Mechanoreciprocity in cell migration.</a> Nature Cell Biology. 20 (1), 8-20 (2018).</li><li>Zong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmon-enhanced+stimulated+Raman+scattering+microscopy+with+single-molecule+detection+sensitivity.">Plasmon-enhanced stimulated Raman scattering microscopy with single-molecule detection sensitivity.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).</li><li>Wei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-multiplex+vibrational+imaging.">Super-multiplex vibrational imaging.</a> Nature. 544 (7651), 465-470 (2017).</li></ol>

A microscopia SRS de células vivas com lapso de tempo é uma técnica alternativa de imagem para rastreamento de moléculas de maneira livre de marcação. Em comparação com a marcação por fluorescência, a imagem SRS é livre de fotoclareamento, permitindo o monitoramento de moléculas a longo prazo. No entanto, até o momento, o sistema de imagem de células vivas em uma microscopia SRS vertical não está disponível comercialmente. Neste trabalho, um sistema de imagem de células vivas com uma caixa de gabinete ...

A microscopia óptica é utilizada para observar as microestruturas das amostras. A imagem óptica é rápida, menos invasiva e menos destrutiva do que outras tecnologias1. A imagem de células vivas com microscopia óptica é desenvolvida para capturar a dinâmica de células vivas cultivadas por um longo período2. Diferentes tipos de contrastes ópticos fornecem informações distintas sobre amostras biológicas. Por exemplo, a microscopia óptica de fase mostra a diferença sutil nos índices de refração ao longo da amostra3. A microscopia de fluorescência é amplamente utilizada para obter imagens de biomoléculas específicas ou organelas celulares. No entanto, os espectros de excitação e emissão de fluorescência geralmente resultam em sobreposição espectral quando imagens multicoloridas são realizadas4. As moléculas fluorescentes são sensíveis à luz e podem ser branqueadas após exposição periódica à luz a longo prazo. Além disso, a marcação por fluorescência pode alterar a biodistribuição das moléculas nas células5. A microscopia SRS é uma tecnologia de imagem química livre demarcação6. O contraste do SRS depende da transição vibracional de ligações químicas específicas. A frequência vibracional de uma ligação química frequentemente exibe uma largura de banda espectral estreita, tornando viável a obtenção de imagens de múltiplas bandas Raman nas mesmas amostras7. A microscopia SRS é uma ferramenta única para imagens de células vivas, fornecendo múltiplos contrastes químicos de forma livre demarcação8.
Embora a imagem SRS de células não coradas tenha sido usada para muitos estudos, a imagem SRS de longo prazo com lapso de tempo de células vivas não foi amplamente adotada. Uma razão é que as câmaras abertas comerciais não podem ser usadas diretamente para imagens SRS devido à sua grande espessura 9,10,11,12. Essas câmaras com tampa de vidro são projetadas principalmente para imagens de campo brilhante ou fluorescência usando uma única objetiva de NA alta com um esquema de detecção para trás. No entanto, a imagem SRS prefere a detecção transmitida usando uma objetiva de NA alta e um condensador de NA alto, o que deixa apenas um intervalo muito curto (normalmente alguns milímetros) entre a objetiva e o condensador. Para superar esse problema, projetamos uma câmara flexível usando um material macio para permitir imagens SRS de lapso de tempo de células vivas usando uma estrutura de microscópio vertical. Neste projeto, a objetiva de imersão de água foi fechada na câmara mole e pode mover-se livremente em três dimensões para fins de focalização e imagem.
A temperatura ideal para o cultivo da maioria das células de mamíferos é de 37 °C, enquanto a temperatura ambiente é sempre 10 ° inferior a esta. Temperaturas superiores ou inferiores a 37 °C têm um efeito dramático na taxa de crescimento celular13. Portanto, o controle da temperatura do ambiente de cultura celular é necessário em um sistema de imagem de células vivas. Sabe-se que a instabilidade da temperatura levará a problemas de desfocalização durante exames de imagem de longo prazo14. Para alcançar um ambiente estável de 37 °C, construímos uma grande câmara de fechamento para cobrir toda a estrutura do microscópio, incluindo uma camada de isolamento térmico sob o microscópio (Figura 1). Dentro da considerável câmara de controle de temperatura, a pequena câmara flexível ajuda a manter com precisão a umidade fisiológica e o pH através do fluxo de ar regulado suplementado com 5% de CO 2 (Figura 2). A temperatura e a umidade das câmaras foram medidas para confirmar que o desenho de câmara dupla forneceu a condição ideal de cultura celular para o crescimento celular sob imagens SRS periódicas de longo prazo (Figura 3). Em seguida, demonstramos a aplicação do sistema para obtenção de imagens por lapso de tempo e rastreamento de gotículas lipídicas (DLs) em células cancerosas SKOV3 (Figura 4, Figura 5 e Figura 6).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A lab-built SRS microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://rdcu.be/cP6ve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HF2LI 50 MHz lock-in amplifer</td>
			<td>Zurich Instruments</td>
			<td>HF2LI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris diaphragm</td>
			<td>Thorlabs Inc</td>
			<td>SM1D12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinematic mirror mount</td>
			<td>Thorlabs Inc</td>
			<td>KM100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope frame</td>
			<td>Nikon Inc</td>
			<td>FN-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized microscopy stage</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>Z-Deck</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil-immersion condenser (C-AA Achromat/Aplanat, NA 1.4)</td>
			<td>Nikon Inc</td>
			<td>MBL71405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-immersion objective (CFI75 Apo 25XC W 1300)</td>
			<td>Nikon Inc</td>
			<td>MRD77225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials and parts for the microscope enclosure (31&#39;&#39; x 29&#39;&#39; x 28&#39;&#39; L x W x H)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airtherm heater module</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>AIRTHERM-SAT-1W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airtherm heater controller, CO2 and humidity monitor</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>AIRTHERM-SMT-1W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air/CO2 mixer module</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>ECU-HOC-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible duct hose (2-1/2&#39;&#39; ID, 2-3/4&#39;&#39; OD)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>56675K71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-temperature glass-mica ceramic, easy-to-machine (6&#39;&#39; x 6&#39;&#39;, 1/4&#39;&#39; thickness)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8489K62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate sheets (thickness 0.25&#39;&#39;)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8574K286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone rubber sheets (36&#39;&#39; x 36&#39;&#39;, thickness 1/8&#39;&#39;)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5827T43</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials and parts for the Flexible chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>31745K11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-purity inline filter, 1/4 NPT</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>6645T18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hole saw (cutting diameter 1-7/8 inch)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>4066A34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hole saw (cutting diameter 50 mm)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>4556A19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-temperature silicone rubber tubing, soft, 2 mm ID, 5 mm OD</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5054K313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline filter (1/4 NPT, 40 micron)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>98385K843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipurpose 6061 Aluminum round tube (1/8&#39;&#39; wall thickness, 4&#39;&#39; OD)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9056K42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipurpose 6061 Aluminum round tube (3/4&#39;&#39; wall thickness, 3-3/4&#39;&#39; OD)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9056K47</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipurpose 6061 Aluminum bar (12&#39;&#39; x 12&#39;&#39;, thickness 1/4&#39;&#39;)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8975K142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipurpose 6061 Aluminum bar (8&#39;&#39; x 8&#39;&#39;, thickness 3/8&#39;&#39;)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9246K21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective nosepiece (single)</td>
			<td>Nikon Inc</td>
			<td>FN-MN-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample holder (modified)</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>HZ202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-thin natural rubber film (thickness 0.01&#39;&#39;)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8611K13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum-sealable glass jar</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>3231T44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ (Fiji)</td>
			<td></td>
			<td>imagej.net</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScanImage</td>
			<td>Vidrio Technologies, LLC</td>
			<td></td>
			<td>SRS imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials for live-cell imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass bottom sterile culture dishes (Dia.x H, 50 x 7 mm)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>70674-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM cell culture medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoSensor fluorescent dye DND-189</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L7535 (Invitrogen)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>364525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SKOV3 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-77</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a flexible chamber for time-lapse live-cell imaging with stimulated raman scattering microscopy

A microscopia de espalhamento Raman estimulado (SRS) é uma tecnologia de imagem química livre de marcação. A imagem de células vivas com SRS tem sido demonstrada para muitas aplicações biológicas e biomédicas. No entanto, a imagem de longo prazo com SRS de lapso de tempo de células vivas não tem sido amplamente adotada. A microscopia SRS geralmente usa uma objetiva de imersão em água de alta abertura numérica (NA) e um condensador de imersão em óleo de alto NA para obter imagens de alta resolução. Neste caso, o espaço entre a objetiva e o condensador é de apenas alguns milímetros. Portanto, a maioria das câmaras ambientais comerciais de topo de palco não pode ser usada para imagens SRS devido à sua grande espessura com uma cobertura de vidro rígida. Este artigo descreve o projeto e a fabricação de uma câmara flexível que pode ser usada para imagens de células vivas com lapso de tempo com detecção de sinal SRS transmitido em um quadro de microscópio vertical. A flexibilidade da câmara é alcançada usando um material macio - uma fina película de borracha natural. O novo design do gabinete e da câmara pode ser facilmente adicionado a uma configuração de imagem SRS existente. Os testes e os resultados preliminares demonstram que o sistema de câmara flexível permite imagens SRS estáveis, de longo prazo e com lapso de tempo de células vivas, que podem ser usadas para várias aplicações de bioimagem no futuro.

Fabricamos e montamos o sistema de câmara flexível para obtenção de imagens SRS com lapso de tempo (Figura 1 e Figura 2) e, em seguida, avaliamos o desempenho do sistema. A temperatura no interior do compartimento ambiente do microscópio atingiu os 37 °C esperados em 1 h, o que não afetou significativamente a temperatura ambiente (Figura 3A). A temperatura na câmara flexível atingiu 37 °C em 1,5 h, mantendo-se estável a 3...

Watch this Scientific Journal Video about A Flexible Chamber for Time-Lapse Live-Cell Imaging with Stimulated Raman Scattering Microscopy at JoVE.com

A Flexible Chamber for Time-Lapse Live-Cell Imaging with Stimulated Raman Scattering Microscopy

Relatamos uma câmara ambiental flexível e de estágio para obtenção de imagens de lapso de tempo de células vivas usando microscopia de espalhamento Raman estimulada vertical com detecção de sinal transmitido. As gotículas lipídicas foram fotografadas em células SKOV3 tratadas com ácido oleico por até 24 h com um intervalo de tempo de 3 min.

Uma câmara flexível para imagens de células vivas com lapso de tempo com microscopia de espalhamento Raman estimulada

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology. Live-cell imaging with SRS has been demonstrated for many ...

A técnica de câmara ambiental flexível permite time-lapse como imagem SRS com detecção de sinal transmitido em uma estrutura de microscópio cirúrgico. A microscopia SRS usou uma objetiva de abertura numérica alta e um condensador de alta extremidade, deixando apenas alguns milímetros de distância onde uma câmara convencional não pode se encaixar. Uma câmara flexível resolve esse problema.Pesquisadores que utilizam a microscopia SRS podem facilmente adotar essa técnica. A câmara flexível também pode ser usada em um microscópio dissecante ou estéril para manter o espécime em condições fisiológicas ideais. Para começar, marque a localização dos pés da estrutura do microscópio SRS e do estágio motorizado usando uma caneta marcadora na mesa óptica.Depois de remover a estrutura do microscópio e o estágio da mesa óptica, coloque a folha de borracha de silicone sobre a mesa. Corte a borracha de silicone ao longo das marcas usando uma faca. Retire pequenos pedaços de borracha e coloque as folhas de cerâmica de mica quadrada nos mesmos locais.Em seguida, mova a estrutura do microscópio e o palco de volta para a mesa óptica e alinhe cuidadosamente os pés nas folhas de cerâmica de mica ao longo das linhas do marcador. Depois de realinhar o caminho óptico SRS, monte o gabinete ambiental no topo da fundação de isolamento térmico para cobrir toda a estrutura do microscópio, usando cinco peças de grandes folhas de policarbonato. Sele as bordas e interfaces da caixa usando fita de alumínio.Conecte a mangueira flexível do duto às portas de entrada e saída da caixa do compartimento para permitir que o fluxo de ar quente circulado seja bombeado e controlado pelo módulo aquecedor. Monte a peça cilíndrica oca usinada de alumínio 1 na peça do nariz da objetiva usando três parafusos ajustados. Em seguida, monte a peça cilíndrica oca de alumínio usinada 2 no suporte da amostra usando quatro parafusos.Encaixe o suporte de amostra com peça de alumínio 2 no palco motorizado e monte-o usando parafusos. Coloque a manga de película de borracha natural entre as duas peças de alumínio usinadas e monte-a usando elásticos em cada extremidade. Conecte o cilindro de CO2 comprimido ao módulo misturador de gás usando tubulação e conectores adequados.Ajuste a pressão de entrada de CO2 em 20 a 25 psi. Use o sensor de CO2 integrado e um controlador para garantir que o módulo misturador de ar possa regular e misturar 5% de CO2 no fluxo de ar. Use filtros em linha para limpar o fluxo de ar.Usando tubos e conectores adequados, guie o ar misturado até a garrafa de água pré-esterilizada colocada na placa de aquecimento e, em seguida, guie o ar umidificado para a câmara flexível. Ajuste a placa de aquecimento em 37 graus Celsius. Borbulhe o fluxo de ar na água morna para aumentar a umidade do fluxo de ar.Desconecte a peça de alumínio 2 da máquina do suporte da amostra, removendo os parafusos. Limpe todas as partes da câmara flexível com etanol 70%, incluindo a peça do nariz, o suporte da amostra e a objetiva de imersão em água. Descontamine todo o sistema de compartimento usando uma lâmpada UV colocada no compartimento por 20 a 30 minutos.Em seguida, carregue a placa de cultura celular. Retire a tampa do prato e imobilize-o com as pinças. Abaixe a objetiva no meio de cultura celular para focalização grosseira.Abaixe a peça de alumínio 2 para fechar a câmara flexível e monte-a no suporte da amostra usando parafusos. Em seguida, insira o sensor. Ajuste o fornecimento de ar com 5%CO2 e 19%O2 para cultura celular normal com uma taxa de fluxo de ar de 200 centímetros cúbicos por minuto e temperatura de 37 graus Celsius.Sintonize o comprimento de onda do laser para 805 nanômetros para atingir o deslocamento Raman inverso de 2.854 centímetros, que é atribuído à vibração das ligações químicas CH2. Use baixa potência do laser para reduzir os danos fotográficos às células. Ajuste e foque o objetivo de obter uma boa imagem SRS das células usando o botão de foco no painel de controles principal do software.Para executar o foco rápido, defina o número de pixels para 512 por 512 pixels com um tempo de permanência de pixels de 4,8 microssegundos no painel de configuração. Depois de alcançar um bom foco, defina a resolução de imagem para 2048 por 2048 pixels para um campo de visão quadrado de 175 micrômetros para a aquisição de imagens de alta qualidade. Verifique a função salvar no painel de controles principal e verifique o canal SRS no painel de canais.Defina o tempo de intervalo entre dois quadros como 180 segundos no canal de controles principal. Defina o número de aquisição como 480 para imagens de lapso de tempo em 24 horas. Inicie a aquisição automatizada de imagens usando a função de loop no painel de controles principal.O desempenho do sistema de câmara flexível para imagens SRS time-lapse foi avaliado. A temperatura no interior do recinto ambiente do microscópio atingiu os 37 graus Celsius esperados e não afetou significativamente a temperatura ambiente. A temperatura na câmara flexível atingiu 37 graus Celsius em 1,5 horas e foi mantida estável por pelo menos 24 horas.A umidade relativa do ar na câmara flexível atingiu 85% em uma hora e pôde ser mantida por pelo menos 24 horas. A imagem SRS de lapso de tempo de células SKOV3 vivas mostrou o movimento rápido e ativo de gotículas lipídicas intracelulares com uma resolução temporal de três minutos. Ao final da sessão de imagem de 24 horas, as células ainda apresentavam morfologia e densidade normais, indicando que as células estavam saudáveis.Em seguida, células SKOV3 tratadas com ácido oleico foram fotografadas e o acúmulo de gotículas lipídicas foi rastreado ao longo de 10 horas. As quantidades de gotículas lipídicas foram quantificadas usando a razão entre gotículas lipídicas e área corporal celular e intensidade total de SRS das gotículas lipídicas. Os resultados indicam que a quantidade de gotículas lipídicas continuou aumentando ao longo de 10 horas.Imagens simultâneas de SRS para frente de gotículas lipídicas e imagens de fluorescência de dois fótons para trás de lisossomos marcados com um corante de fluorescência DND-189 também foram demonstradas. Observou-se baixíssimo grau de colocalização de gotículas lipídicas e lisossomos. Ao tentar esse protocolo, tenha em mente que a deriva focal é um problema comum em imagens de células vivas.O refoco pode ser necessário após cerca de duas horas de imagens de lapso de tempo. Após seu desenvolvimento, a imagem SRS de lapso de tempo tem sido usada para vários estudos para rastrear moléculas livres de rótulos ou moléculas marcadas com texto Raman em células vivas.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

Preparação de amostras, Imaging, and Analysis Protocolos para Faca de ponta microscopia de varredura

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

Bioengenharia

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

Time-lapse imagens de fluorescência de crescimento de raiz Arabidopsis com Manipulação acelerada do meio root usando o RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Criando Gradientes adesivas e solúvel para a migração celular Imaging com Microscopia de Fluorescência

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Sample Drift Correction Following 4D Confocal Time-lapse Imaging

Correção Deriva de exemplo a seguir 4D confocal tempo-lapso

The generation of four-dimensional (4D) confocal datasets; consisting of 3D image sequences over time; provides an excellent methodology to capture ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

De fast imagens de fluorescência com a Lei difusão molecular em membranas de células vivas em um microscópio comercial

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescência-têmpera de um Fluoróforo encapsulado em lipossomas Near-infrared como ferramenta para<em&gt; In Vivo</em&gt; Imageamento óptico

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

Imagens de células vivas durante Mecânica estiramento

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

Padronização Subtractive rápida de camadas de células vivas com uma Probe microfluídicos

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Visualizando a formação de adesão em células por meio de avançados girando a reflexão interna Total disco microscopia de fluorescência

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

Medição contínua do ruído biológico em Escherichia Coli Usando microscopia de lapso de tempo

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process ...