Name: a flexible chamber for time-lapse live-cell imaging with stimulated raman scattering microscopy
Uploaded: 2022-08-31T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Flexible Chamber for Time-Lapse Live-Cell Imaging with Stimulated Raman Scattering Microscopy at JoVE.com

Мы хотим поблагодарить группу старших дизайнеров бакалавриата 2019 года (Сук Чул Юн, Ян Фокстон, Луи Мацца и Джеймс Уолш) в Бингемтонском университете за проектирование, изготовление и тестирование корпуса микроскопа. Мы благодарим Скотта Хэнкока, Ольгу Петрову и Фабиолу Морено Оливас из Бингемтонского университета за полезные дискуссии. Это исследование было поддержано Национальными институтами здравоохранения под номером R15GM140444.

1. Постройте экологический корпус микроскопа
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот большой корпус микроскопа используется для контроля температуры корпуса микроскопа и среды визуализации, которая должна быть стабилизирована при 37 ° C (рис. 1A).
<ol><li>Отметьте расположение ноже...

<ol>
	<li>Mertz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Introduction to Optical Microscopy. , (2019).</li><li>Ettinger, A., Wittmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+live+cell+imaging.">Fluorescence live cell imaging.</a> Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).</li><li>Park, Y., Depeursinge, C., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+phase+imaging+in+biomedicine.">Quantitative phase imaging in biomedicine.</a> Nature Photonics. 12 (10), 578-589 (2018).</li><li>Hu, C. D., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+multiple+protein+interactions+in+living+cells+using+multicolor+fluorescence+complementation+analysis.">Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis.</a> Nature Biotechnology. 21 (5), 539-545 (2003).</li><li>lamo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+dye+labeling+changes+the+biodistribution+of+tumor-targeted+nanoparticles.">Fluorescent dye labeling changes the biodistribution of tumor-targeted nanoparticles.</a> Pharmaceutics. 12 (11), 1004 (2020).</li><li>Cheng, J. X., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrational+spectroscopic+imaging+of+living+systems:+An+emerging+platform+for+biology+and+medicine.">Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine.</a> Science. 350 (6264), aaa870 (2015).</li><li>Lu, F. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+DNA+imaging+in+vivo+with+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).</li><li>Hill, A. H., Fu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+imaging+using+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Cellular imaging using stimulated Raman scattering microscopy.</a> Analytical Chemistry. 91 (15), 9333-9342 (2019).</li><li>Bu&#273;a, R., Vuku&#353;i&#263;, K., Toli&#263;, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Cell Biology. (139), 81-101 (2017).</li><li>Chiarelli, T. J., Grieshaber, N. A., Grieshaber, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+forward+genetic+approach+to+identify+and+isolate+developmental+mutants+in+Chlamydia+trachomatis.">Live-cell forward genetic approach to identify and isolate developmental mutants in Chlamydia trachomatis.</a> Journal of Visualized Experiments. (160), e61365 (2020).</li><li>Lemon, W. C., McDole, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+in+the+era+of+too+many+microscopes.">Live-cell imaging in the era of too many microscopes.</a> Current Opinion in Cell Biology. 66, 34-42 (2020).</li><li>Birk, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+oral+biofilms+by+nisin+delivery+in+adhesive+microdevices.">Management of oral biofilms by nisin delivery in adhesive microdevices.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 167, 83-88 (2021).</li><li>Watanabe, I., Okada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+temperature+on+growth+rate+of+cultured+mammalian+cells+(L5178Y).">Effects of temperature on growth rate of cultured mammalian cells (L5178Y).</a> Journal of Cell Biology. 32 (2), 309-323 (1967).</li><li>Lac, A., Lam, A. L., Heit, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fluorescent Microscopy. , 57-73 (2022).</li><li>Grossman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Machinable+glass-ceramics+based+on+tetrasilicic+mica.">Machinable glass-ceramics based on tetrasilicic mica.</a> Journal of the American Ceramic Society. 55 (9), 446-449 (1972).</li><li>Yuan, Y., Shah, N., Almohaisin, M. I., Saha, S., Lu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+fatty+acid-induced+lipotoxicity+and+its+therapeutic+potential+in+glioblastoma+using+stimulated+Raman+microscopy.">Assessing fatty acid-induced lipotoxicity and its therapeutic potential in glioblastoma using stimulated Raman microscopy.</a> Scientific Reports. 11 (1), 1-14 (2021).</li><li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScanImage:+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes.">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomedical Engineering Online. 2 (1), 1-9 (2003).</li><li>Sun, M. W., Yuan, Y. H., Lu, F. K., Di Pasqua, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physicochemical+factors+that+influence+the+biocompatibility+of+cationic+liposomes+and+their+ability+to+deliver+DNA+to+the+nuclei+of+ovarian+cancer+SK-OV-3+cells.">Physicochemical factors that influence the biocompatibility of cationic liposomes and their ability to deliver DNA to the nuclei of ovarian cancer SK-OV-3 cells.</a> Materials. 14 (2), 416 (2021).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Ozeki, Y., Itoh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulated+Raman+scattering+microscopy+for+live-cell+imaging+with+high+contrast+and+high+sensitivity.">Stimulated Raman scattering microscopy for live-cell imaging with high contrast and high sensitivity.</a> Laser Physics. 20 (5), 1114-1118 (2010).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+live-cell+imaging+of+nucleic+acids+using+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Label-free live-cell imaging of nucleic acids using stimulated Raman scattering microscopy.</a> ChemPhysChem. 13 (4), 1054-1059 (2012).</li><li>Stiebing, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+Raman+and+SRS+imaging+of+living+human+macrophages+reveals+cell-to-cell+heterogeneity+and+dynamics+of+lipid+uptake.">Real-time Raman and SRS imaging of living human macrophages reveals cell-to-cell heterogeneity and dynamics of lipid uptake.</a> Journal of Biophotonics. 10 (9), 1217-1226 (2017).</li><li>Miao, K., Wei, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+and+quantification+of+PolyQ+aggregates+by+stimulated+Raman+scattering+of+selective+deuterium+labeling.">Live-cell imaging and quantification of PolyQ aggregates by stimulated Raman scattering of selective deuterium labeling.</a> ACS Central Science. 6 (4), 478-486 (2020).</li><li>Brzozowski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulated+Raman+scattering+microscopy+in+chemistry+and+life+science+-Development,+innovation,+perspectives.">Stimulated Raman scattering microscopy in chemistry and life science -Development, innovation, perspectives.</a> Biotechnology Advances. 60, 108003 (2022).</li><li>Hislop, E. W., Tipping, W. J., Faulds, K., Graham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+imaging+of+lipid+droplets+in+prostate+cells+using+stimulated+Raman+scattering+microscopy+and+multivariate+analysis.">Label-free imaging of lipid droplets in prostate cells using stimulated Raman scattering microscopy and multivariate analysis.</a> Analytical Chemistry. 94 (25), 8899-8908 (2022).</li><li>Chen, T., Yavuz, A., Wang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+lipid+droplet+biology+with+coherent+Raman+scattering+microscopy.">Dissecting lipid droplet biology with coherent Raman scattering microscopy.</a> Journal of Cell Science. 135 (5), jcs252353 (2022).</li><li>Cao, C., Zhou, D., Chen, T., Streets, A. M., Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-Free+digital+quantification+of+lipid+droplets+in+single+cells+by+stimulated+Raman+microscopy+on+a+microfluidic+platform.">Label-Free digital quantification of lipid droplets in single cells by stimulated Raman microscopy on a microfluidic platform.</a> Analytical Chemistry. 88 (9), 4931-4939 (2016).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulated+Raman+scattering+flow+cytometry+for+label-free+single-particle+analysis.">Stimulated Raman scattering flow cytometry for label-free single-particle analysis.</a> Optica. 4 (1), 103-109 (2017).</li><li>Suzuki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+chemical+imaging+flow+cytometry+by+high-speed+multicolor+stimulated+Raman+scattering.">Label-free chemical imaging flow cytometry by high-speed multicolor stimulated Raman scattering.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (32), 15842-15848 (2019).</li><li>Gala de Pablo, J., Lindley, M., Hiramatsu, K., Goda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+Raman+flow+cytometry+and+beyond.">High-throughput Raman flow cytometry and beyond.</a> Accounts of Chemical Research. 54 (9), 2132-2143 (2021).</li><li>Cole, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging:+the+cell's+perspective.">Live-cell imaging: the cell's perspective.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. 8 (5), 452-459 (2014).</li><li>Kreft, M., Stenovec, M., Zorec, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focus-drift+correction+in+time-lapse+confocal+imaging.">Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1048 (1), 321-330 (2005).</li><li>Firestone, L., Cook, K., Culp, K., Talsania, N., Preston Jr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+autofocus+methods+for+automated+microscopy.">Comparison of autofocus methods for automated microscopy.</a> Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 12 (3), 195-206 (1991).</li><li>Van Helvert, S., Storm, C., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanoreciprocity+in+cell+migration.">Mechanoreciprocity in cell migration.</a> Nature Cell Biology. 20 (1), 8-20 (2018).</li><li>Zong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmon-enhanced+stimulated+Raman+scattering+microscopy+with+single-molecule+detection+sensitivity.">Plasmon-enhanced stimulated Raman scattering microscopy with single-molecule detection sensitivity.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).</li><li>Wei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-multiplex+vibrational+imaging.">Super-multiplex vibrational imaging.</a> Nature. 544 (7651), 465-470 (2017).</li></ol>

Покадровая SRS-микроскопия живых клеток является альтернативным методом визуализации для отслеживания молекул без меток. По сравнению с флуоресцентной маркировкой, визуализация SRS не подвержена фотообесцвечиванию, что позволяет осуществлять долгосрочный мониторинг молекул. Однако н?...

Оптическая микроскопия используется для наблюдения за микроструктурами образцов. Оптическая визуализация является быстрой, менее инвазивной и менее разрушительной, чем другие технологии1. Визуализация живых клеток с помощью оптической микроскопии разработана для захвата динамики культивируемых живых клеток в течение длительного периода2. Различные типы оптических контрастов предоставляют различную информацию о биологических образцах. Например, оптическая фазовая микроскопия показывает тонкую разницу в показателях преломления в образце3. Флуоресцентная микроскопия широко используется для визуализации конкретных биомолекул или клеточных органелл. Однако широкополосные спектры возбуждения и излучения флуоресценции обычно приводят к спектральному перекрытию при выполнении многоцветной визуализации4. Флуоресцентные молекулы светочувствительны и могут быть обесцвечены после длительного периодического воздействия света. Кроме того, флуоресцентная маркировка может изменить биораспределение молекул в клетках5. Микроскопия SRS - это технология химической визуализации без меток6. Контраст SRS основан на колебательном переходе определенных химических связей. Колебательная частота химической связи часто имеет узкую спектральную полосу пропускания, что позволяет получать изображения нескольких полос комбинационного рассеяния света в одних и тех же образцах7. Микроскопия SRS — это уникальный инструмент для визуализации живых клеток, обеспечивающий множественные химические контрасты без меток8.
В то время как SRS-визуализация неокрашенных клеток использовалась для многих исследований, долгосрочная покадровая SRS-визуализация живых клеток не получила широкого распространения. Одна из причин заключается в том, что коммерческие открытые камеры не могут быть непосредственно использованы для визуализации SRS из-за их большой толщины 9,10,11,12. Эти камеры со стеклянной крышкой в основном предназначены для визуализации светлого поля или флуоресценции с использованием одного объектива с высоким уровнем NA со схемой обратного обнаружения. Тем не менее, SRS-визуализация предпочитает передаваемое обнаружение с использованием как объектива с высоким NA, так и конденсатора с высоким NA, что оставляет только очень короткий зазор (обычно несколько миллиметров) между объективом и конденсатором. Чтобы преодолеть эту проблему, мы разработали гибкую камеру с использованием мягкого материала, чтобы обеспечить покадровую SRS-визуализацию живых клеток с использованием вертикальной рамки микроскопа. В этой конструкции объектив для погружения в воду был заключен в мягкую камеру и может свободно перемещаться в трех измерениях для фокусировки и визуализации.
Оптимальная температура для культивирования большинства клеток млекопитающих составляет 37 ° C, в то время как температура в помещении всегда на 10 ° ниже. Температура выше или ниже 37 °C оказывает существенное влияние на скорость роста клеток13. Поэтому в системе визуализации живых клеток требуется контроль температуры среды клеточных культур. Известно, что температурная нестабильность приведет к проблемам с расфокусировкой при длительной визуализации14. Для достижения стабильной температуры 37 °C мы построили большую камеру корпуса, которая покрывает всю раму микроскопа, включая теплоизоляционный слой под микроскопом (рис. 1). В большой камере контроля температуры небольшая гибкая камера помогает точно поддерживать физиологическую влажность и рН за счет регулируемого воздушного потока, дополненного 5% CO 2 (рис. 2). Температура и влажность камер были измерены, чтобы подтвердить, что двухкамерная конструкция обеспечивает оптимальные условия культивирования клеток для роста клеток при длительной периодической визуализации SRS (рис. 3). Затем мы продемонстрировали применение системы для покадровой визуализации и отслеживания липидных капель (LD) в раковых клетках SKOV3 (рис. 4, рис. 5 и рис. 6).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A lab-built SRS microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://rdcu.be/cP6ve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HF2LI 50 MHz lock-in amplifer</td>
			<td>Zurich Instruments</td>
			<td>HF2LI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris diaphragm</td>
			<td>Thorlabs Inc</td>
			<td>SM1D12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinematic mirror mount</td>
			<td>Thorlabs Inc</td>
			<td>KM100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope frame</td>
			<td>Nikon Inc</td>
			<td>FN-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized microscopy stage</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>Z-Deck</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil-immersion condenser (C-AA Achromat/Aplanat, NA 1.4)</td>
			<td>Nikon Inc</td>
			<td>MBL71405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-immersion objective (CFI75 Apo 25XC W 1300)</td>
			<td>Nikon Inc</td>
			<td>MRD77225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials and parts for the microscope enclosure (31&#39;&#39; x 29&#39;&#39; x 28&#39;&#39; L x W x H)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airtherm heater module</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>AIRTHERM-SAT-1W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airtherm heater controller, CO2 and humidity monitor</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>AIRTHERM-SMT-1W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air/CO2 mixer module</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>ECU-HOC-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible duct hose (2-1/2&#39;&#39; ID, 2-3/4&#39;&#39; OD)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>56675K71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-temperature glass-mica ceramic, easy-to-machine (6&#39;&#39; x 6&#39;&#39;, 1/4&#39;&#39; thickness)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8489K62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate sheets (thickness 0.25&#39;&#39;)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8574K286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone rubber sheets (36&#39;&#39; x 36&#39;&#39;, thickness 1/8&#39;&#39;)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5827T43</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials and parts for the Flexible chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>31745K11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-purity inline filter, 1/4 NPT</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>6645T18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hole saw (cutting diameter 1-7/8 inch)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>4066A34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hole saw (cutting diameter 50 mm)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>4556A19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-temperature silicone rubber tubing, soft, 2 mm ID, 5 mm OD</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5054K313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline filter (1/4 NPT, 40 micron)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>98385K843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipurpose 6061 Aluminum round tube (1/8&#39;&#39; wall thickness, 4&#39;&#39; OD)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9056K42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipurpose 6061 Aluminum round tube (3/4&#39;&#39; wall thickness, 3-3/4&#39;&#39; OD)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9056K47</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipurpose 6061 Aluminum bar (12&#39;&#39; x 12&#39;&#39;, thickness 1/4&#39;&#39;)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8975K142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipurpose 6061 Aluminum bar (8&#39;&#39; x 8&#39;&#39;, thickness 3/8&#39;&#39;)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9246K21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective nosepiece (single)</td>
			<td>Nikon Inc</td>
			<td>FN-MN-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample holder (modified)</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>HZ202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-thin natural rubber film (thickness 0.01&#39;&#39;)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8611K13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum-sealable glass jar</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>3231T44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ (Fiji)</td>
			<td></td>
			<td>imagej.net</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScanImage</td>
			<td>Vidrio Technologies, LLC</td>
			<td></td>
			<td>SRS imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials for live-cell imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass bottom sterile culture dishes (Dia.x H, 50 x 7 mm)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>70674-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM cell culture medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoSensor fluorescent dye DND-189</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L7535 (Invitrogen)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>364525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SKOV3 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-77</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a flexible chamber for time-lapse live-cell imaging with stimulated raman scattering microscopy

Микроскопия с вынужденным комбинационным рассеянием света (SRS) представляет собой технологию химической визуализации без меток. Визуализация живых клеток с помощью SRS была продемонстрирована для многих биологических и биомедицинских применений. Тем не менее, долгосрочная покадровая SRS-визуализация живых клеток не получила широкого распространения. В микроскопии SRS часто используется объектив с высокой числовой апертурой (NA) и масляный конденсатор с высоким содержанием NA для получения изображений с высоким разрешением. В этом случае зазор между объективом и конденсатором составляет всего несколько миллиметров. Поэтому большинство коммерческих сценических экологических камер не могут быть использованы для визуализации SRS из-за их большой толщины с жесткой стеклянной крышкой. В этой статье описывается конструкция и изготовление гибкой камеры, которая может быть использована для покадровой визуализации живых клеток с детектированием передаваемого сигнала SRS на вертикальной рамке микроскопа. Гибкость камеры достигается за счет использования мягкого материала – тонкой пленки натурального каучука. Новая конструкция корпуса и камеры может быть легко добавлена к существующей установке визуализации SRS. Испытания и предварительные результаты показывают, что гибкая камерная система обеспечивает стабильную, долгосрочную, покадровую SRS-визуализацию живых клеток, которая может быть использована для различных приложений биовизуализации в будущем.

Мы изготовили и собрали гибкую камерную систему для покадровой визуализации SRS (рис. 1 и рис. 2), а затем оценили производительность системы . Температура внутри корпуса микроскопа достигала ожидаемых 37 °C в течение 1 часа, что не оказывало существенного вли...

Watch this Scientific Journal Video about A Flexible Chamber for Time-Lapse Live-Cell Imaging with Stimulated Raman Scattering Microscopy at JoVE.com

A Flexible Chamber for Time-Lapse Live-Cell Imaging with Stimulated Raman Scattering Microscopy

Мы сообщаем о том, что в верхней части сцены используется гибкая экологическая камера для покадровой визуализации живых клеток с использованием вертикальной вынужденной микроскопии комбинационного рассеяния света с детектированием передаваемого сигнала. Липидные капли визуализировали в клетках SKOV3, обработанных олеиновой кислотой, в течение 24 ч с интервалом времени 3 мин.

Гибкая камера для покадровой визуализации живых клеток с помощью микроскопии со стимулированным комбинационным рассеянием света

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology. Live-cell imaging with SRS has been demonstrated for many ...

Гибкая технология камеры окружающей среды позволяет получать покадровую съемку в виде SRS с детектированием передаваемого сигнала на рамке операционного микроскопа. В микроскопии SRS использовался объектив с высокой числовой апертурой и конденсатор с высоким концом, оставляя всего несколько миллиметров зазора, в который не поместилась обычная камера. Гибкая камера решает эту проблему.Исследователи, использующие микроскопию SRS, могут легко принять эту технику. Гибкая камера также может быть использована на препарирующем или стерильном микроскопе для поддержания образца в оптимальных физиологических условиях. Для начала отметьте расположение ножек рамы микроскопа SRS и моторизованного столика с помощью маркера на оптическом столе.Сняв рамку микроскопа и предметный столик с оптического стола, положите лист силиконовой резины на стол. Разрежьте силиконовую резину вдоль следов с помощью ножа. Удалите мелкие кусочки резины и поместите квадратные керамические листы слюды в те же места.Затем переместите рамку микроскопа и предметный столик обратно на оптический стол и аккуратно выровняйте ножки на листах слюдяной керамики вдоль линий маркера. После выравнивания оптического тракта SRS соберите экологический корпус поверх теплоизоляционного фундамента, чтобы покрыть всю раму микроскопа, используя пять кусков больших поликарбонатных листов. Заклейте края и стыки коробки с помощью ленты из алюминиевой фольги.Подсоедините гибкий шланг воздуховода к впускному и выпускному отверстиям коробки корпуса, чтобы обеспечить циркуляцию теплого воздушного потока, перекачиваемого и контролируемого модулем нагревателя. Установите обработанную полую цилиндрическую алюминиевую деталь 1 на носовую часть объектива с помощью трех установочных винтов. Затем установите обработанную полую цилиндрическую алюминиевую деталь 2 на держатель образца с помощью четырех винтов.Установите держатель образца с алюминиевой деталью 2 на моторизованный столик и установите его с помощью винтов. Поместите втулку из натуральной резиновой пленки между двумя обработанными алюминиевыми деталями и закрепите ее с помощью резинок на каждом конце. Подсоедините баллон со сжатым CO2 к модулю газового смесителя, используя соответствующие трубки и соединители.Установите входное давление CO2 от 20 до 25 фунтов на квадратный дюйм. Используйте встроенный датчик CO2 и контроллер, чтобы модуль воздушного смесителя мог регулировать и смешивать 5% CO2 с воздушным потоком. Используйте встроенные фильтры для очистки воздушного потока.Используя соответствующие трубки и соединители, направьте смешанный воздух в предварительно стерилизованную бутылку с водой, помещенную на конфорку, а затем направьте увлажненный воздух в гибкую камеру. Установите конфорку на 37 градусов по Цельсию. Пузырьки воздушного потока в теплой воде, чтобы увеличить влажность воздушного потока.Отсоедините алюминиевую деталь машины 2 от держателя образца, открутив винты. Протрите все части гибкой камеры 70%-ным этанолом, включая носовую часть, держатель образца и объектив для погружения в воду. Обеззаразьте всю систему корпуса с помощью УФ-лампы, помещенной в корпус на 20-30 минут.Затем загрузите чашку для культивирования клеток. Снимите крышку посуды и обездвижьте ее с помощью зажимов. Опустите объектив в питательную среду для грубой фокусировки.Опустите алюминиевую деталь 2, чтобы закрыть гибкую камеру, и закрепите ее на держателе образца с помощью винтов. Затем вставьте датчик. Установите подачу воздуха с 5% CO2 и 19% O2 для нормальной культуры клеток со скоростью воздушного потока 200 кубических сантиметров в минуту и температурой 37 градусов по Цельсию.Настройте длину волны лазера на 805 нанометров, чтобы нацелиться на обратный рамановский сдвиг 2 854 сантиметра, который объясняется вибрацией химических связей CH2. Используйте низкую мощность лазера, чтобы уменьшить фотоповреждение клеток. Отрегулируйте и сфокусируйте цель, чтобы добиться хорошей визуализации клеток SRS, используя кнопку фокусировки на главной панели управления программного обеспечения.Чтобы выполнить быструю фокусировку, установите на панели конфигурации число пикселей 512 на 512 пикселей с временем выдержки пикселя 4,8 микросекунды. После достижения хорошей фокусировки установите разрешение изображения 2048 на 2048 пикселей для поля зрения 175 микрометров в квадрате для получения высококачественных изображений. Проверьте функцию сохранения на главной панели управления и проверьте канал SRS на панели каналов.Установите интервал между двумя кадрами равным 180 секундам на канале основного управления. Установите номер сбора на 480 для покадровой съемки в течение 24 часов. Запустите автоматическое получение изображений с помощью функции петли на главной панели управления.Была оценена производительность гибкой камерной системы для покадровой SRS-визуализации. Температура внутри корпуса микроскопа достигала ожидаемых 37 градусов по Цельсию и не оказывала существенного влияния на температуру в помещении. Температура в гибкой камере достигала 37 градусов по Цельсию за 1,5 часа и стабильно поддерживалась не менее 24 часов.Относительная влажность в гибкой камере достигала 85% за один час и могла поддерживаться не менее 24 часов. Покадровая SRS-визуализация живых клеток SKOV3 показала быстрое и активное движение внутриклеточных липидных капель с временным разрешением три минуты. К концу 24-часового сеанса визуализации клетки все еще демонстрировали нормальную морфологию и плотность, что указывает на то, что клетки были здоровы.Затем были визуализированы клетки SKOV3, обработанные олеиновой кислотой, и накопление липидных капель отслеживалось в течение 10 часов. Количество липидных капель определяли количественно с использованием соотношения липидных капель к площади тела клеток и общей интенсивности SRS липидных капель. Результаты показывают, что количество липидных капель продолжало увеличиваться в течение 10 часов.Также была продемонстрирована одновременная прямая SRS-визуализация липидных капель и обратная двухфотонная флуоресцентная визуализация лизосом, меченных флуоресцентным красителем DND-189. Наблюдалась очень низкая степень колокализации липидных капель и лизосом. При попытке использовать этот протокол имейте в виду, что фокальный дрейф является распространенной проблемой при визуализации живых клеток.Перефокусировка может потребоваться примерно через два часа покадровой съемки. После его разработки покадровая SRS-визуализация использовалась для различных исследований для отслеживания молекул без меток или меченых молекул с рамановским текстом в живых клетках.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

Изготовление образцов, Imaging, и анализ протоколов для ножа сканирующей микроскопии

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

Замедленной флуоресценции от роста корней арабидопсиса с быстрой манипуляции Корень окружающей среды Использование RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Создание клей и растворимых Градиенты для работы с изображениями миграции клеток с флуоресцентной микроскопии

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Sample Drift Correction Following 4D Confocal Time-lapse Imaging

Образец коррекция дрейфа После 4D конфокальной Покадровый Визуализация

The generation of four-dimensional (4D) confocal datasets; consisting of 3D image sequences over time; provides an excellent methodology to capture ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

От быстрого флуоресценции визуализации к молекулярной диффузии Закона о живых клеточных мембран в торговом микроскоп

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Флуоресценции тушение липосомальной инкапсулированный в ближней инфракрасной области флуорофорные как инструмент для<em&gt; В Vivo</em&gt; Оптических изображений

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

Живых изображений сотовый процессе механической Stretch

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

Rapid Субтрактивный структурирование живых слоев клеток с микрожидком Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Визуализация адгезии образование в клетках посредством передовых спиннинг диска всего внутреннего отражения микроскопии флуоресцирования

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

Непрерывное измерение биологического шума в Escherichia Coli с использованием замедленной микроскопии

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process ...