Name: a flexible chamber for time-lapse live-cell imaging with stimulated raman scattering microscopy
Uploaded: 2022-08-31T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Flexible Chamber for Time-Lapse Live-Cell Imaging with Stimulated Raman Scattering Microscopy at JoVE.com

Vi vill tacka 2019 Undergraduate Senior Design Team (Suk Chul Yoon, Ian Foxton, Louis Mazza och James Walsh) vid Binghamton University för design, tillverkning och testning av mikroskophöljet. Vi tackar Scott Hancock, Olga Petrova och Fabiola Moreno Olivas vid Binghamton University för hjälpsamma diskussioner. Denna forskning stöddes av National Institutes of Health under Award Number R15GM140444.

1. Bygg mikroskopets miljöhölje
OBS: Detta stora mikroskop miljöhölje används för att styra temperaturen i mikroskopkroppen och bildmiljön som ska stabiliseras vid 37 ° C (figur 1A).
<ol><li>Markera placeringen av fötterna på SRS-mikroskopramen och det motoriserade steget med en markörpenna på det optiska bordet. Montera två Irismembran framför galvanometerskannern i mikroskopet och justera så att pumpen och Stokes laserstrålar passerar genom mit...

<ol>
	<li>Mertz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Introduction to Optical Microscopy. , (2019).</li><li>Ettinger, A., Wittmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+live+cell+imaging.">Fluorescence live cell imaging.</a> Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).</li><li>Park, Y., Depeursinge, C., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+phase+imaging+in+biomedicine.">Quantitative phase imaging in biomedicine.</a> Nature Photonics. 12 (10), 578-589 (2018).</li><li>Hu, C. D., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+multiple+protein+interactions+in+living+cells+using+multicolor+fluorescence+complementation+analysis.">Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis.</a> Nature Biotechnology. 21 (5), 539-545 (2003).</li><li>lamo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+dye+labeling+changes+the+biodistribution+of+tumor-targeted+nanoparticles.">Fluorescent dye labeling changes the biodistribution of tumor-targeted nanoparticles.</a> Pharmaceutics. 12 (11), 1004 (2020).</li><li>Cheng, J. X., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrational+spectroscopic+imaging+of+living+systems:+An+emerging+platform+for+biology+and+medicine.">Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine.</a> Science. 350 (6264), aaa870 (2015).</li><li>Lu, F. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+DNA+imaging+in+vivo+with+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).</li><li>Hill, A. H., Fu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+imaging+using+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Cellular imaging using stimulated Raman scattering microscopy.</a> Analytical Chemistry. 91 (15), 9333-9342 (2019).</li><li>Bu&#273;a, R., Vuku&#353;i&#263;, K., Toli&#263;, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Cell Biology. (139), 81-101 (2017).</li><li>Chiarelli, T. J., Grieshaber, N. A., Grieshaber, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+forward+genetic+approach+to+identify+and+isolate+developmental+mutants+in+Chlamydia+trachomatis.">Live-cell forward genetic approach to identify and isolate developmental mutants in Chlamydia trachomatis.</a> Journal of Visualized Experiments. (160), e61365 (2020).</li><li>Lemon, W. C., McDole, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+in+the+era+of+too+many+microscopes.">Live-cell imaging in the era of too many microscopes.</a> Current Opinion in Cell Biology. 66, 34-42 (2020).</li><li>Birk, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+oral+biofilms+by+nisin+delivery+in+adhesive+microdevices.">Management of oral biofilms by nisin delivery in adhesive microdevices.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 167, 83-88 (2021).</li><li>Watanabe, I., Okada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+temperature+on+growth+rate+of+cultured+mammalian+cells+(L5178Y).">Effects of temperature on growth rate of cultured mammalian cells (L5178Y).</a> Journal of Cell Biology. 32 (2), 309-323 (1967).</li><li>Lac, A., Lam, A. L., Heit, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fluorescent Microscopy. , 57-73 (2022).</li><li>Grossman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Machinable+glass-ceramics+based+on+tetrasilicic+mica.">Machinable glass-ceramics based on tetrasilicic mica.</a> Journal of the American Ceramic Society. 55 (9), 446-449 (1972).</li><li>Yuan, Y., Shah, N., Almohaisin, M. I., Saha, S., Lu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+fatty+acid-induced+lipotoxicity+and+its+therapeutic+potential+in+glioblastoma+using+stimulated+Raman+microscopy.">Assessing fatty acid-induced lipotoxicity and its therapeutic potential in glioblastoma using stimulated Raman microscopy.</a> Scientific Reports. 11 (1), 1-14 (2021).</li><li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScanImage:+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes.">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomedical Engineering Online. 2 (1), 1-9 (2003).</li><li>Sun, M. W., Yuan, Y. H., Lu, F. K., Di Pasqua, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physicochemical+factors+that+influence+the+biocompatibility+of+cationic+liposomes+and+their+ability+to+deliver+DNA+to+the+nuclei+of+ovarian+cancer+SK-OV-3+cells.">Physicochemical factors that influence the biocompatibility of cationic liposomes and their ability to deliver DNA to the nuclei of ovarian cancer SK-OV-3 cells.</a> Materials. 14 (2), 416 (2021).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Ozeki, Y., Itoh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulated+Raman+scattering+microscopy+for+live-cell+imaging+with+high+contrast+and+high+sensitivity.">Stimulated Raman scattering microscopy for live-cell imaging with high contrast and high sensitivity.</a> Laser Physics. 20 (5), 1114-1118 (2010).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+live-cell+imaging+of+nucleic+acids+using+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Label-free live-cell imaging of nucleic acids using stimulated Raman scattering microscopy.</a> ChemPhysChem. 13 (4), 1054-1059 (2012).</li><li>Stiebing, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+Raman+and+SRS+imaging+of+living+human+macrophages+reveals+cell-to-cell+heterogeneity+and+dynamics+of+lipid+uptake.">Real-time Raman and SRS imaging of living human macrophages reveals cell-to-cell heterogeneity and dynamics of lipid uptake.</a> Journal of Biophotonics. 10 (9), 1217-1226 (2017).</li><li>Miao, K., Wei, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+and+quantification+of+PolyQ+aggregates+by+stimulated+Raman+scattering+of+selective+deuterium+labeling.">Live-cell imaging and quantification of PolyQ aggregates by stimulated Raman scattering of selective deuterium labeling.</a> ACS Central Science. 6 (4), 478-486 (2020).</li><li>Brzozowski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulated+Raman+scattering+microscopy+in+chemistry+and+life+science+-Development,+innovation,+perspectives.">Stimulated Raman scattering microscopy in chemistry and life science -Development, innovation, perspectives.</a> Biotechnology Advances. 60, 108003 (2022).</li><li>Hislop, E. W., Tipping, W. J., Faulds, K., Graham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+imaging+of+lipid+droplets+in+prostate+cells+using+stimulated+Raman+scattering+microscopy+and+multivariate+analysis.">Label-free imaging of lipid droplets in prostate cells using stimulated Raman scattering microscopy and multivariate analysis.</a> Analytical Chemistry. 94 (25), 8899-8908 (2022).</li><li>Chen, T., Yavuz, A., Wang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+lipid+droplet+biology+with+coherent+Raman+scattering+microscopy.">Dissecting lipid droplet biology with coherent Raman scattering microscopy.</a> Journal of Cell Science. 135 (5), jcs252353 (2022).</li><li>Cao, C., Zhou, D., Chen, T., Streets, A. M., Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-Free+digital+quantification+of+lipid+droplets+in+single+cells+by+stimulated+Raman+microscopy+on+a+microfluidic+platform.">Label-Free digital quantification of lipid droplets in single cells by stimulated Raman microscopy on a microfluidic platform.</a> Analytical Chemistry. 88 (9), 4931-4939 (2016).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulated+Raman+scattering+flow+cytometry+for+label-free+single-particle+analysis.">Stimulated Raman scattering flow cytometry for label-free single-particle analysis.</a> Optica. 4 (1), 103-109 (2017).</li><li>Suzuki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+chemical+imaging+flow+cytometry+by+high-speed+multicolor+stimulated+Raman+scattering.">Label-free chemical imaging flow cytometry by high-speed multicolor stimulated Raman scattering.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (32), 15842-15848 (2019).</li><li>Gala de Pablo, J., Lindley, M., Hiramatsu, K., Goda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+Raman+flow+cytometry+and+beyond.">High-throughput Raman flow cytometry and beyond.</a> Accounts of Chemical Research. 54 (9), 2132-2143 (2021).</li><li>Cole, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging:+the+cell's+perspective.">Live-cell imaging: the cell's perspective.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. 8 (5), 452-459 (2014).</li><li>Kreft, M., Stenovec, M., Zorec, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focus-drift+correction+in+time-lapse+confocal+imaging.">Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1048 (1), 321-330 (2005).</li><li>Firestone, L., Cook, K., Culp, K., Talsania, N., Preston Jr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+autofocus+methods+for+automated+microscopy.">Comparison of autofocus methods for automated microscopy.</a> Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 12 (3), 195-206 (1991).</li><li>Van Helvert, S., Storm, C., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanoreciprocity+in+cell+migration.">Mechanoreciprocity in cell migration.</a> Nature Cell Biology. 20 (1), 8-20 (2018).</li><li>Zong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmon-enhanced+stimulated+Raman+scattering+microscopy+with+single-molecule+detection+sensitivity.">Plasmon-enhanced stimulated Raman scattering microscopy with single-molecule detection sensitivity.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).</li><li>Wei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-multiplex+vibrational+imaging.">Super-multiplex vibrational imaging.</a> Nature. 544 (7651), 465-470 (2017).</li></ol>

Time-lapse live-cell SRS-mikroskopi är en alternativ bildteknik för molekylspårning på ett etikettfritt sätt. Jämfört med fluorescensmärkning är SRS-avbildning fri från fotoblekning, vilket möjliggör långtidsövervakning av molekyler. Hittills är dock det levande cellavbildningssystemet på en upprätt SRS-mikroskopi inte kommersiellt tillgängligt. I detta arbete utvecklades ett levande cellavbildningssystem med en stabil värmeisolerad mikroskophöljeslåda och en flexibel inre mjukkammare för att möjli...

Optisk mikroskopi används för att observera mikrostrukturerna i prover. Optisk avbildning är snabb, mindre invasiv och mindre destruktiv än andra tekniker1. Levande cellavbildning med optisk mikroskopi utvecklas för att fånga dynamiken hos odlade levande celler under en lång period2. Olika typer av optiska kontraster ger distinkt information om biologiska prover. Till exempel visar optisk fasmikroskopi den subtila skillnaden i brytningsindex över provet3. Fluorescensmikroskopi används ofta för att avbilda specifika biomolekyler eller cellulära organeller. Emellertid resulterar bredbandsexcitations- och emissionsspektra för fluorescens vanligtvis i spektral överlappning när flerfärgad avbildning utförs4. Fluorescerande molekyler är ljuskänsliga och kan blekas efter långvarig, periodisk ljusexponering. Dessutom kan fluorescensmärkning förändra biodistributionen av molekylerna i celler5. SRS-mikroskopi är en etikettfri kemisk bildteknik6. Kontrasten hos SRS bygger på vibrationsövergången av specifika kemiska bindningar. Vibrationsfrekvensen för en kemisk bindning uppvisar ofta en smal spektralbandbredd, vilket gör det möjligt att avbilda flera Raman-band i samma prover7. SRS-mikroskopi är ett unikt verktyg för avbildning av levande celler, vilket ger flera kemiska kontraster på ett etikettfritt sätt8.
Medan SRS-avbildning av ofärgade celler har använts för många studier, har långvarig time-lapse SRS-avbildning av levande celler inte antagits allmänt. En anledning är att kommersiella öppna kammare inte kan användas direkt för SRS-avbildning på grund av deras stora tjocklek 9,10,11,12. Dessa kammare med glaslock är oftast konstruerade för ljusfälts- eller fluorescensavbildning med ett enda högt NA-mål med ett bakåtdetekteringsschema. SRS-avbildning föredrar dock överförd detektion med både ett högt NA-mål och en hög NA-kondensor, vilket bara lämnar ett mycket kort mellanrum (vanligtvis några millimeter) mellan målet och kondensorn. För att övervinna detta problem designade vi en flexibel kammare med ett mjukt material för att möjliggöra time-lapse SRS-avbildning av levande celler med hjälp av en upprätt mikroskopram. I denna design var vattendoppningsmålet inneslutet i den mjuka kammaren och kan fritt röra sig i tre dimensioner för fokuserings- och bildändamål.
Den optimala temperaturen för odling av de flesta däggdjursceller är 37 °C, medan rumstemperaturen alltid är 10° lägre än detta. Temperatur högre eller lägre än 37 °C har en dramatisk effekt på celltillväxthastigheten13. Därför krävs temperaturkontroll av cellodlingsmiljön i ett levande cellavbildningssystem. Det är känt att temperaturinstabilitet kommer att leda till oskärpningsproblem under långvarig avbildning14. För att uppnå en stabil miljö på 37 °C byggde vi en stor kapslingskammare för att täcka hela mikroskopramen, inklusive ett värmeisoleringsskikt under mikroskopet (figur 1). I den stora temperaturkontrollkammaren hjälper den lilla flexibla kammaren till att noggrant bibehålla den fysiologiska fuktigheten och pH-värdet via det reglerade luftflödet kompletterat med 5% CO 2 (figur 2). Kamrarnas temperatur och fuktighet mättes för att bekräfta att dubbelkammardesignen gav det optimala cellodlingsförhållandet för celltillväxt under långsiktig, periodisk SRS-avbildning (figur 3). Vi demonstrerade sedan tillämpningen av systemet för time-lapse-avbildning och spårning av lipiddroppar (LD) i SKOV3-cancerceller (figur 4, figur 5 och figur 6).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A lab-built SRS microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://rdcu.be/cP6ve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HF2LI 50 MHz lock-in amplifer</td>
			<td>Zurich Instruments</td>
			<td>HF2LI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris diaphragm</td>
			<td>Thorlabs Inc</td>
			<td>SM1D12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinematic mirror mount</td>
			<td>Thorlabs Inc</td>
			<td>KM100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope frame</td>
			<td>Nikon Inc</td>
			<td>FN-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized microscopy stage</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>Z-Deck</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil-immersion condenser (C-AA Achromat/Aplanat, NA 1.4)</td>
			<td>Nikon Inc</td>
			<td>MBL71405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-immersion objective (CFI75 Apo 25XC W 1300)</td>
			<td>Nikon Inc</td>
			<td>MRD77225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials and parts for the microscope enclosure (31&#39;&#39; x 29&#39;&#39; x 28&#39;&#39; L x W x H)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airtherm heater module</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>AIRTHERM-SAT-1W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airtherm heater controller, CO2 and humidity monitor</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>AIRTHERM-SMT-1W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air/CO2 mixer module</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>ECU-HOC-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible duct hose (2-1/2&#39;&#39; ID, 2-3/4&#39;&#39; OD)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>56675K71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-temperature glass-mica ceramic, easy-to-machine (6&#39;&#39; x 6&#39;&#39;, 1/4&#39;&#39; thickness)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8489K62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate sheets (thickness 0.25&#39;&#39;)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8574K286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone rubber sheets (36&#39;&#39; x 36&#39;&#39;, thickness 1/8&#39;&#39;)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5827T43</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials and parts for the Flexible chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>31745K11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-purity inline filter, 1/4 NPT</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>6645T18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hole saw (cutting diameter 1-7/8 inch)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>4066A34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hole saw (cutting diameter 50 mm)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>4556A19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-temperature silicone rubber tubing, soft, 2 mm ID, 5 mm OD</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5054K313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline filter (1/4 NPT, 40 micron)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>98385K843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipurpose 6061 Aluminum round tube (1/8&#39;&#39; wall thickness, 4&#39;&#39; OD)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9056K42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipurpose 6061 Aluminum round tube (3/4&#39;&#39; wall thickness, 3-3/4&#39;&#39; OD)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9056K47</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipurpose 6061 Aluminum bar (12&#39;&#39; x 12&#39;&#39;, thickness 1/4&#39;&#39;)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8975K142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipurpose 6061 Aluminum bar (8&#39;&#39; x 8&#39;&#39;, thickness 3/8&#39;&#39;)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9246K21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective nosepiece (single)</td>
			<td>Nikon Inc</td>
			<td>FN-MN-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample holder (modified)</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>HZ202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-thin natural rubber film (thickness 0.01&#39;&#39;)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8611K13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum-sealable glass jar</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>3231T44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ (Fiji)</td>
			<td></td>
			<td>imagej.net</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScanImage</td>
			<td>Vidrio Technologies, LLC</td>
			<td></td>
			<td>SRS imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials for live-cell imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass bottom sterile culture dishes (Dia.x H, 50 x 7 mm)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>70674-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM cell culture medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoSensor fluorescent dye DND-189</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L7535 (Invitrogen)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>364525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SKOV3 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-77</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a flexible chamber for time-lapse live-cell imaging with stimulated raman scattering microscopy

Stimulerad Raman-spridning (SRS) mikroskopi är en etikettfri kemisk bildteknik. Levande cellavbildning med SRS har visats för många biologiska och biomedicinska tillämpningar. Långvarig time-lapse SRS-avbildning av levande celler har dock inte antagits allmänt. SRS-mikroskopi använder ofta ett vattennedsänkningsmål med hög numerisk bländare (NA) och en hög NA-oljekondensor för att uppnå högupplöst avbildning. I detta fall är klyftan mellan målet och kondensorn bara några millimeter. Därför kan de flesta kommersiella miljökammare inte användas för SRS-avbildning på grund av deras stora tjocklek med ett styvt glasskydd. Detta dokument beskriver design och tillverkning av en flexibel kammare som kan användas för time-lapse live-cellavbildning med överförd SRS-signaldetektering på en upprätt mikroskopram. Kammarens flexibilitet uppnås genom att använda ett mjukt material - en tunn naturgummifilm. Den nya kapslingen och kammardesignen kan enkelt läggas till i en befintlig SRS-bildinstallation. Testerna och de preliminära resultaten visar att det flexibla kammarsystemet möjliggör stabil, långsiktig, time-lapse SRS-avbildning av levande celler, som kan användas för olika bioimaging-applikationer i framtiden.

Vi tillverkade och monterade det flexibla kammarsystemet för time-lapse SRS-avbildning (figur 1 och figur 2) och utvärderade sedan systemets prestanda. Temperaturen inuti mikroskopets miljöhölje nådde den förväntade 37 ° C inom 1 h, vilket inte signifikant påverkade rumstemperaturen (figur 3A). Temperaturen i den flexibla kammaren nådde 37 °C på 1,5 timmar och hölls stabilt vid 37 °C i minst 24 timmar (<strong class="x...

Watch this Scientific Journal Video about A Flexible Chamber for Time-Lapse Live-Cell Imaging with Stimulated Raman Scattering Microscopy at JoVE.com

A Flexible Chamber for Time-Lapse Live-Cell Imaging with Stimulated Raman Scattering Microscopy

Vi rapporterar en steg-top, flexibel miljökammare för time-lapse-avbildning av levande celler med upprätt stimulerad Raman-spridningsmikroskopi med överförd signaldetektering. Lipiddroppar avbildades i SKOV3-celler behandlade med oljesyra i upp till 24 timmar med ett tidsintervall på 3 minuter.

En flexibel kammare för time-lapse live-cell avbildning med stimulerad Raman Scattering mikroskopi

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology. Live-cell imaging with SRS has been demonstrated for many ...

Den flexibla miljökammartekniken möjliggör time-lapse som SRS-avbildning med överförd signaldetektering på en fungerande mikroskopram. SRS-mikroskopi använde ett högt numeriskt bländarmål och en avancerad kondensor, vilket bara lämnade några millimeters mellanrum där en konventionell kammare inte kan passa. En flexibel kammare löser detta problem.Forskare som använder SRS-mikroskopi kan enkelt anta denna teknik. Den flexibla kammaren kan också användas på ett dissekerande eller ett sterilt mikroskop för att bibehålla provet under optimala fysiologiska förhållanden. För att börja, markera platserna för fötterna på SRS-mikroskopramen och det motoriserade steget med en markörpenna på det optiska bordet.När du har tagit bort mikroskopramen och scenen från det optiska bordet lägger du silikongummiarket på bordet. Skär silikongummit längs märkena med en kniv. Ta bort små gummibitar och placera de fyrkantiga glimmerkeramiska arken på samma platser.Flytta sedan mikroskopramen och scenen tillbaka till det optiska bordet och rikta försiktigt in fötterna på glimmerkeramiska ark längs markörlinjerna. Efter att ha justerat SRS optiska väg, montera miljöhöljet ovanpå värmeisoleringsfundamentet för att täcka hela mikroskopramen med fem bitar av stora polykarbonatark. Försegla lådans kanter och gränssnitt med aluminiumfolietejp.Anslut den flexibla kanalslangen till inlopps- och utloppsportarna på kapslingsboxen för att tillåta cirkulerat, varmt luftflöde pumpat och styrt av värmemodulen. Montera den bearbetade ihåliga cylindriska aluminiumbiten 1 på objektivets nosdel med tre skruvar. Montera sedan den bearbetade ihåliga cylindriska aluminiumbiten 2 på provhållaren med fyra skruvar.Montera provhållaren med aluminiumbit 2 på det motoriserade steget och montera den med skruvar. Placera naturgummifilmhylsan mellan de två bearbetade aluminiumbitarna och montera den med gummiband i varje ände. Anslut den komprimerade CO2-cylindern till gasblandarmodulen med rätt slangar och kontakter.Ställ in CO2-ingångstrycket på 20 till 25 psi. Använd den inbyggda CO2-sensorn och en styrenhet för att säkerställa att luftblandarmodulen kan reglera och blanda 5% CO2 i luftflödet. Använd infogade filter för att rensa luftflödet.Använd rätt slangar och kontakter, led den blandade luften till den försteriliserade vattenflaskan placerad på kokplattan och led sedan den fuktade luften till den flexibla kammaren. Ställ in kokplattan på 37 grader Celsius. Bubbla luftflödet i varmt vatten för att öka luftfuktigheten.Koppla bort maskinens aluminiumbit 2 från provhållaren genom att ta bort skruvarna. Torka av alla delar av den flexibla kammaren med 70% etanol, inklusive nässtycket, provhållaren och vattendoppningsmålet. Dekontaminera hela kapslingssystemet med en UV-lampa placerad i höljet i 20 till 30 minuter.Ladda sedan cellodlingsskålen. Ta bort locket på skålen och immobilisera det med klämmorna. Sänk målet i cellodlingsmediet för grov fokusering.Sänk aluminiumstycket 2 för att omsluta den flexibla kammaren och montera den på provhållaren med skruvar. Sätt sedan in sensorn. Ställ in lufttillförseln med 5% CO2 och 19% O2 för normal cellodling med en luftflödeshastighet på 200 kubikcentimeter per minut och temperatur till 37 grader Celsius.Ställ in laservåglängden till 805 nanometer för att rikta in sig på 2.854 centimeter invers Raman-skiftet, vilket tillskrivs vibrationen av CH2-kemiska bindningar. Använd låg lasereffekt för att minska fotoskador på cellerna. Justera och fokusera målet för att uppnå bra SRS-avbildning av cellerna med hjälp av fokusknappen på programvarans huvudkontrollpanel.Om du vill utföra snabb fokusering ställer du in pixelnumret till 512 x 512 pixlar med en pixeluppehållstid på 4,8 mikrosekunder på konfigurationspanelen. Efter att ha uppnått bra fokusering, ställ in bildupplösningen till 2048 x 2048 pixlar för ett 175 mikrometer kvadratiskt synfält för förvärv av högkvalitativa bilder. Kontrollera sparfunktionen på huvudkontrollpanelen och kontrollera SRS-kanalen på kanalpanelen.Ställ in intervalltiden mellan två bildrutor till 180 sekunder på huvudkontrollkanalen. Ställ in insamlingsnumret på 480 för timelapse-avbildning under 24 timmar. Starta automatisk bildinsamling med hjälp av loopfunktionen på huvudkontrollpanelen.Prestandan hos det flexibla kammarsystemet för time-lapse SRS-avbildning utvärderades. Temperaturen inuti mikroskopets miljöhölje nådde de förväntade 37 grader Celsius och påverkade inte rumstemperaturen signifikant. Temperaturen i den flexibla kammaren nådde 37 grader Celsius på 1,5 timmar och hölls stabilt i minst 24 timmar.Den relativa luftfuktigheten i den flexibla kammaren nådde 85% på en timme och kunde bibehållas i minst 24 timmar. Time-lapse SRS-avbildning av levande SKOV3-celler visade snabb och aktiv rörelse av intracellulära lipiddroppar med en tidsupplösning på tre minuter. I slutet av den 24 timmar långa avbildningssessionen visade cellerna fortfarande normal morfologi och densitet, vilket indikerar att cellerna var friska.Därefter avbildades SKOV3-celler behandlade med oljesyra och lipiddroppackumulering spårades under 10 timmar. Lipiddroppmängderna kvantifierades med hjälp av lipiddroppen till cellkroppsareaförhållandet och den totala SRS-intensiteten hos lipiddropparna. Resultaten indikerar att mängden lipiddroppar fortsatte att öka under 10 timmar.Samtidig SRS-avbildning framåt av lipiddroppar och bakåt två fotonfluorescensavbildning av lysosomer märkta med ett fluorescensfärgämne DND-189 visades också. En mycket låg grad av samlokalisering av lipiddroppar och lysosomer observerades. När du försöker detta protokoll, kom ihåg att fokaldrift är ett vanligt problem vid levande cellavbildning.Omfokusering kan behövas efter cirka två timmars time-lapse-avbildning. Efter utvecklingen har time-lapse SRS-avbildning använts för olika studier för att spåra etikettfria molekyler eller märkta molekyler med Raman-text i levande celler.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

Provberedning, Imaging och analysprotokoll för knivsegg Scanning Mikroskopi

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

Time-lapse fluorescensavbildning av Arabidopsis rottillväxt med Rapid Manipulering av Root miljö med hjälp av RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Skapa Lim och lösliga övertoningar för Imaging cellmigration med fluorescensmikroskopi

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Sample Drift Correction Following 4D Confocal Time-lapse Imaging

Prov Korrigering Drift Efter 4D Confocal Time-lapse avbildning

The generation of four-dimensional (4D) confocal datasets; consisting of 3D image sequences over time; provides an excellent methodology to capture ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Från Snabb fluorescens avbildning till molekylär diffusion lagen om Live cellmembran i en kommersiell mikroskop

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescens-släckning av en Liposomal-inkapslad Nära-infraröd fluoroforen som ett verktyg för<em&gt; In Vivo</em&gt; Optisk avbildning

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

Levande cell imaging under mekanisk Stretch

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

Snabb Subtraktiv Mönstring av levande cellskikt med en mikroflödessystem Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Visualisera vidhäftning bildandet i celler med hjälp av avancerade Spinning Disk-totalt inre reflektion fluorescensmikroskopi

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

Kontinuerlig mätning av biologiskt buller i Escherichia Coli med tidsfördröjning mikroskopi

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process ...