Name: a flexible chamber for time-lapse live-cell imaging with stimulated raman scattering microscopy
Uploaded: 2022-08-31T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Flexible Chamber for Time-Lapse Live-Cell Imaging with Stimulated Raman Scattering Microscopy at JoVE.com

Binghamton Üniversitesi'ndeki 2019 Lisans Kıdemli Tasarım Ekibine (Suk Chul Yoon, Ian Foxton, Louis Mazza ve James Walsh) mikroskop muhafaza kutusunun tasarımı, üretimi ve testi için teşekkür etmek istiyoruz. Binghamton Üniversitesi'nden Scott Hancock, Olga Petrova ve Fabiola Moreno Olivas'a yararlı tartışmalar için teşekkür ederiz. Bu araştırma Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından R15GM140444 Ödül Numarası altında desteklenmiştir.

1. Mikroskop çevre muhafazasını inşa edin
NOT: Bu büyük mikroskop çevresel muhafazası, mikroskop gövdesinin sıcaklığını ve 37 ° C'de stabilize edilecek görüntüleme ortamını kontrol etmek için kullanılır (Şekil 1A).
<ol><li>SRS mikroskop çerçevesinin ayaklarının yerlerini ve motorlu sahneyi optik masadaki bir işaretleyici kalem kullanarak işaretleyin. Mikroskobun Galvanometre tarayıcısının önüne iki İris Diyaframı monte edin ...

<ol>
	<li>Mertz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Introduction to Optical Microscopy. , (2019).</li><li>Ettinger, A., Wittmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+live+cell+imaging.">Fluorescence live cell imaging.</a> Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).</li><li>Park, Y., Depeursinge, C., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+phase+imaging+in+biomedicine.">Quantitative phase imaging in biomedicine.</a> Nature Photonics. 12 (10), 578-589 (2018).</li><li>Hu, C. D., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+multiple+protein+interactions+in+living+cells+using+multicolor+fluorescence+complementation+analysis.">Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis.</a> Nature Biotechnology. 21 (5), 539-545 (2003).</li><li>lamo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+dye+labeling+changes+the+biodistribution+of+tumor-targeted+nanoparticles.">Fluorescent dye labeling changes the biodistribution of tumor-targeted nanoparticles.</a> Pharmaceutics. 12 (11), 1004 (2020).</li><li>Cheng, J. X., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrational+spectroscopic+imaging+of+living+systems:+An+emerging+platform+for+biology+and+medicine.">Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine.</a> Science. 350 (6264), aaa870 (2015).</li><li>Lu, F. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+DNA+imaging+in+vivo+with+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).</li><li>Hill, A. H., Fu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+imaging+using+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Cellular imaging using stimulated Raman scattering microscopy.</a> Analytical Chemistry. 91 (15), 9333-9342 (2019).</li><li>Bu&#273;a, R., Vuku&#353;i&#263;, K., Toli&#263;, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Cell Biology. (139), 81-101 (2017).</li><li>Chiarelli, T. J., Grieshaber, N. A., Grieshaber, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+forward+genetic+approach+to+identify+and+isolate+developmental+mutants+in+Chlamydia+trachomatis.">Live-cell forward genetic approach to identify and isolate developmental mutants in Chlamydia trachomatis.</a> Journal of Visualized Experiments. (160), e61365 (2020).</li><li>Lemon, W. C., McDole, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+in+the+era+of+too+many+microscopes.">Live-cell imaging in the era of too many microscopes.</a> Current Opinion in Cell Biology. 66, 34-42 (2020).</li><li>Birk, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+oral+biofilms+by+nisin+delivery+in+adhesive+microdevices.">Management of oral biofilms by nisin delivery in adhesive microdevices.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 167, 83-88 (2021).</li><li>Watanabe, I., Okada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+temperature+on+growth+rate+of+cultured+mammalian+cells+(L5178Y).">Effects of temperature on growth rate of cultured mammalian cells (L5178Y).</a> Journal of Cell Biology. 32 (2), 309-323 (1967).</li><li>Lac, A., Lam, A. L., Heit, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fluorescent Microscopy. , 57-73 (2022).</li><li>Grossman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Machinable+glass-ceramics+based+on+tetrasilicic+mica.">Machinable glass-ceramics based on tetrasilicic mica.</a> Journal of the American Ceramic Society. 55 (9), 446-449 (1972).</li><li>Yuan, Y., Shah, N., Almohaisin, M. I., Saha, S., Lu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+fatty+acid-induced+lipotoxicity+and+its+therapeutic+potential+in+glioblastoma+using+stimulated+Raman+microscopy.">Assessing fatty acid-induced lipotoxicity and its therapeutic potential in glioblastoma using stimulated Raman microscopy.</a> Scientific Reports. 11 (1), 1-14 (2021).</li><li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScanImage:+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes.">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomedical Engineering Online. 2 (1), 1-9 (2003).</li><li>Sun, M. W., Yuan, Y. H., Lu, F. K., Di Pasqua, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physicochemical+factors+that+influence+the+biocompatibility+of+cationic+liposomes+and+their+ability+to+deliver+DNA+to+the+nuclei+of+ovarian+cancer+SK-OV-3+cells.">Physicochemical factors that influence the biocompatibility of cationic liposomes and their ability to deliver DNA to the nuclei of ovarian cancer SK-OV-3 cells.</a> Materials. 14 (2), 416 (2021).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Ozeki, Y., Itoh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulated+Raman+scattering+microscopy+for+live-cell+imaging+with+high+contrast+and+high+sensitivity.">Stimulated Raman scattering microscopy for live-cell imaging with high contrast and high sensitivity.</a> Laser Physics. 20 (5), 1114-1118 (2010).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+live-cell+imaging+of+nucleic+acids+using+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Label-free live-cell imaging of nucleic acids using stimulated Raman scattering microscopy.</a> ChemPhysChem. 13 (4), 1054-1059 (2012).</li><li>Stiebing, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+Raman+and+SRS+imaging+of+living+human+macrophages+reveals+cell-to-cell+heterogeneity+and+dynamics+of+lipid+uptake.">Real-time Raman and SRS imaging of living human macrophages reveals cell-to-cell heterogeneity and dynamics of lipid uptake.</a> Journal of Biophotonics. 10 (9), 1217-1226 (2017).</li><li>Miao, K., Wei, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+and+quantification+of+PolyQ+aggregates+by+stimulated+Raman+scattering+of+selective+deuterium+labeling.">Live-cell imaging and quantification of PolyQ aggregates by stimulated Raman scattering of selective deuterium labeling.</a> ACS Central Science. 6 (4), 478-486 (2020).</li><li>Brzozowski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulated+Raman+scattering+microscopy+in+chemistry+and+life+science+-Development,+innovation,+perspectives.">Stimulated Raman scattering microscopy in chemistry and life science -Development, innovation, perspectives.</a> Biotechnology Advances. 60, 108003 (2022).</li><li>Hislop, E. W., Tipping, W. J., Faulds, K., Graham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+imaging+of+lipid+droplets+in+prostate+cells+using+stimulated+Raman+scattering+microscopy+and+multivariate+analysis.">Label-free imaging of lipid droplets in prostate cells using stimulated Raman scattering microscopy and multivariate analysis.</a> Analytical Chemistry. 94 (25), 8899-8908 (2022).</li><li>Chen, T., Yavuz, A., Wang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+lipid+droplet+biology+with+coherent+Raman+scattering+microscopy.">Dissecting lipid droplet biology with coherent Raman scattering microscopy.</a> Journal of Cell Science. 135 (5), jcs252353 (2022).</li><li>Cao, C., Zhou, D., Chen, T., Streets, A. M., Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-Free+digital+quantification+of+lipid+droplets+in+single+cells+by+stimulated+Raman+microscopy+on+a+microfluidic+platform.">Label-Free digital quantification of lipid droplets in single cells by stimulated Raman microscopy on a microfluidic platform.</a> Analytical Chemistry. 88 (9), 4931-4939 (2016).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulated+Raman+scattering+flow+cytometry+for+label-free+single-particle+analysis.">Stimulated Raman scattering flow cytometry for label-free single-particle analysis.</a> Optica. 4 (1), 103-109 (2017).</li><li>Suzuki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+chemical+imaging+flow+cytometry+by+high-speed+multicolor+stimulated+Raman+scattering.">Label-free chemical imaging flow cytometry by high-speed multicolor stimulated Raman scattering.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (32), 15842-15848 (2019).</li><li>Gala de Pablo, J., Lindley, M., Hiramatsu, K., Goda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+Raman+flow+cytometry+and+beyond.">High-throughput Raman flow cytometry and beyond.</a> Accounts of Chemical Research. 54 (9), 2132-2143 (2021).</li><li>Cole, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging:+the+cell's+perspective.">Live-cell imaging: the cell's perspective.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. 8 (5), 452-459 (2014).</li><li>Kreft, M., Stenovec, M., Zorec, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focus-drift+correction+in+time-lapse+confocal+imaging.">Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1048 (1), 321-330 (2005).</li><li>Firestone, L., Cook, K., Culp, K., Talsania, N., Preston Jr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+autofocus+methods+for+automated+microscopy.">Comparison of autofocus methods for automated microscopy.</a> Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 12 (3), 195-206 (1991).</li><li>Van Helvert, S., Storm, C., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanoreciprocity+in+cell+migration.">Mechanoreciprocity in cell migration.</a> Nature Cell Biology. 20 (1), 8-20 (2018).</li><li>Zong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmon-enhanced+stimulated+Raman+scattering+microscopy+with+single-molecule+detection+sensitivity.">Plasmon-enhanced stimulated Raman scattering microscopy with single-molecule detection sensitivity.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).</li><li>Wei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-multiplex+vibrational+imaging.">Super-multiplex vibrational imaging.</a> Nature. 544 (7651), 465-470 (2017).</li></ol>

Hızlandırılmış canlı hücreli SRS mikroskopisi, molekül takibi için etiketsiz bir şekilde alternatif bir görüntüleme tekniğidir. Floresan etiketleme ile karşılaştırıldığında, SRS görüntüleme fotobeyazlatma içermez ve moleküllerin uzun süreli izlenmesini sağlar. Bununla birlikte, bugüne kadar, dik SRS mikroskobu üzerindeki canlı hücre görüntüleme sistemi ticari olarak mevcut değildir. Bu çalışmada, iletilen SRS hızlandırılmış görüntülemeyi sağlamak için kararlı bir termal ...

Optik mikroskopi, örneklerin mikroyapılarını gözlemlemek için kullanılır. Optik görüntüleme hızlı, daha az invaziv ve diğer teknolojilerden daha az yıkıcıdır1. Optik mikroskopi ile canlı hücre görüntüleme, kültürlenmiş canlı hücrelerin dinamiklerini uzun bir süre boyunca yakalamak için geliştirilmiştir2. Farklı optik kontrast türleri, biyolojik örnekler hakkında farklı bilgiler sağlar. Örneğin, optik faz mikroskobu, örnek3 boyunca kırılma indekslerindeki ince farkı gösterir. Floresan mikroskopi, spesifik biyomolekülleri veya hücresel organelleri görüntülemek için yaygın olarak kullanılır. Bununla birlikte, floresanın geniş bant uyarımı ve emisyon spektrumları genellikle çok renkli görüntüleme yapıldığında spektral örtüşmeye neden olur4. Floresan molekülleri ışığa duyarlıdır ve uzun süreli, periyodik ışığa maruz kaldıktan sonra ağartılabilir. Ek olarak, floresan etiketleme, hücrelerdeki moleküllerin biyolojik dağılımını değiştirebilir5. SRS mikroskopisi etiketsiz bir kimyasal görüntüleme teknolojisidir6. SRS'nin kontrastı, belirli kimyasal bağların titreşimsel geçişine dayanır. Bir kimyasal bağın titreşim frekansı genellikle dar bir spektral bant genişliği sergiler ve bu da aynı örneklerde birden fazla Raman bandının görüntülenmesini mümkün kılar7. SRS mikroskopisi, canlı hücre görüntülemesi için benzersiz bir araçtır ve etiketsiz bir şekilde çoklu kimyasal kontrastlar sağlar8.
Boyanmamış hücrelerin SRS görüntülemesi birçok çalışma için kullanılmış olsa da, canlı hücrelerin uzun süreli hızlandırılmış SRS görüntülemesi yaygın olarak benimsenmemiştir. Bunun bir nedeni, ticari açık odaların 9,10,11,12 kalınlıkları nedeniyle SRS görüntüleme için doğrudan kullanılamamasıdır. Cam kapaklı bu odalar çoğunlukla geriye doğru algılama şemasına sahip tek bir yüksek NA hedefi kullanılarak parlak alan veya floresan görüntüleme için tasarlanmıştır. Bununla birlikte, SRS görüntüleme, hem yüksek NA hedefi hem de yüksek NA kondenseri kullanılarak iletilen algılamayı tercih eder, bu da amaç ile kondenser arasında sadece çok kısa bir boşluk (tipik olarak birkaç milimetre) bırakır. Bu sorunun üstesinden gelmek için, dik bir mikroskop çerçevesi kullanarak canlı hücrelerin hızlandırılmış SRS görüntülemesini sağlamak için yumuşak bir malzeme kullanarak esnek bir oda tasarladık. Bu tasarımda, suya daldırma hedefi yumuşak odaya yerleştirilmiştir ve odaklama ve görüntüleme amacıyla üç boyutta serbestçe hareket edebilir.
Çoğu memeli hücresinin kültürlenmesi için en uygun sıcaklık 37 ° C'dir, oda sıcaklığı ise her zaman bundan 10 ° daha düşüktür. 37 ° C'den yüksek veya daha düşük sıcaklık, hücre büyüme hızı üzerinde dramatik bir etkiye sahiptir13. Bu nedenle canlı hücre görüntüleme sisteminde hücre kültürü ortamının sıcaklık kontrolü gereklidir. Sıcaklık kararsızlığının uzun süreli görüntüleme sırasında bulanıklaştırma sorunlarına yol açacağı bilinmektedir14. Kararlı bir 37 °C ortam elde etmek için, mikroskopun altında bir ısı yalıtım tabakası da dahil olmak üzere tüm mikroskop çerçevesini kaplayacak büyük bir muhafaza odası inşa ettik (Şekil 1). Büyük sıcaklık kontrol odası içindeki küçük esnek oda, %5 CO 2 ile desteklenen düzenlenmiş hava akışı yoluyla fizyolojik nemin ve pH'ın doğru bir şekilde korunmasına yardımcı olur (Şekil 2). Odaların sıcaklığı ve nemi, çift odacıklı tasarımın uzun süreli, periyodik SRS görüntüleme altında hücre büyümesi için en uygun hücre kültürü koşulunu sağladığını doğrulamak için ölçülmüştür (Şekil 3). Daha sonra sistemin SKOV3 kanser hücrelerinde hızlandırılmış görüntüleme ve lipit damlacıklarının (LD'ler) izlenmesi için uygulanmasını gösterdik (Şekil 4, Şekil 5 ve Şekil 6).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A lab-built SRS microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://rdcu.be/cP6ve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HF2LI 50 MHz lock-in amplifer</td>
			<td>Zurich Instruments</td>
			<td>HF2LI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris diaphragm</td>
			<td>Thorlabs Inc</td>
			<td>SM1D12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinematic mirror mount</td>
			<td>Thorlabs Inc</td>
			<td>KM100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope frame</td>
			<td>Nikon Inc</td>
			<td>FN-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized microscopy stage</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>Z-Deck</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil-immersion condenser (C-AA Achromat/Aplanat, NA 1.4)</td>
			<td>Nikon Inc</td>
			<td>MBL71405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-immersion objective (CFI75 Apo 25XC W 1300)</td>
			<td>Nikon Inc</td>
			<td>MRD77225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials and parts for the microscope enclosure (31&#39;&#39; x 29&#39;&#39; x 28&#39;&#39; L x W x H)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airtherm heater module</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>AIRTHERM-SAT-1W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airtherm heater controller, CO2 and humidity monitor</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>AIRTHERM-SMT-1W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air/CO2 mixer module</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>ECU-HOC-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible duct hose (2-1/2&#39;&#39; ID, 2-3/4&#39;&#39; OD)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>56675K71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-temperature glass-mica ceramic, easy-to-machine (6&#39;&#39; x 6&#39;&#39;, 1/4&#39;&#39; thickness)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8489K62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate sheets (thickness 0.25&#39;&#39;)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8574K286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone rubber sheets (36&#39;&#39; x 36&#39;&#39;, thickness 1/8&#39;&#39;)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5827T43</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials and parts for the Flexible chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>31745K11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-purity inline filter, 1/4 NPT</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>6645T18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hole saw (cutting diameter 1-7/8 inch)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>4066A34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hole saw (cutting diameter 50 mm)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>4556A19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-temperature silicone rubber tubing, soft, 2 mm ID, 5 mm OD</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5054K313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline filter (1/4 NPT, 40 micron)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>98385K843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipurpose 6061 Aluminum round tube (1/8&#39;&#39; wall thickness, 4&#39;&#39; OD)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9056K42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipurpose 6061 Aluminum round tube (3/4&#39;&#39; wall thickness, 3-3/4&#39;&#39; OD)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9056K47</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipurpose 6061 Aluminum bar (12&#39;&#39; x 12&#39;&#39;, thickness 1/4&#39;&#39;)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8975K142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipurpose 6061 Aluminum bar (8&#39;&#39; x 8&#39;&#39;, thickness 3/8&#39;&#39;)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9246K21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective nosepiece (single)</td>
			<td>Nikon Inc</td>
			<td>FN-MN-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample holder (modified)</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>HZ202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-thin natural rubber film (thickness 0.01&#39;&#39;)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8611K13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum-sealable glass jar</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>3231T44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ (Fiji)</td>
			<td></td>
			<td>imagej.net</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScanImage</td>
			<td>Vidrio Technologies, LLC</td>
			<td></td>
			<td>SRS imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials for live-cell imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass bottom sterile culture dishes (Dia.x H, 50 x 7 mm)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>70674-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM cell culture medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoSensor fluorescent dye DND-189</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L7535 (Invitrogen)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>364525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SKOV3 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-77</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a flexible chamber for time-lapse live-cell imaging with stimulated raman scattering microscopy

Uyarılmış Raman saçılması (SRS) mikroskopisi, etiketsiz bir kimyasal görüntüleme teknolojisidir. SRS ile canlı hücre görüntüleme, birçok biyolojik ve biyomedikal uygulama için gösterilmiştir. Bununla birlikte, canlı hücrelerin uzun süreli hızlandırılmış SRS görüntülemesi yaygın olarak benimsenmemiştir. SRS mikroskopisi genellikle yüksek çözünürlüklü görüntüleme elde etmek için yüksek sayısal açıklıklı (NA) suya daldırma hedefi ve yüksek NA yağ daldırma kondenseri kullanır. Bu durumda, amaç ile kondenser arasındaki boşluk sadece birkaç milimetredir. Bu nedenle, çoğu ticari sahne üstü çevre odası, sert bir cam kapaklı büyük kalınlıkları nedeniyle SRS görüntüleme için kullanılamaz. Bu makalede, dik bir mikroskop çerçevesi üzerinde iletilen SRS sinyal tespiti ile hızlandırılmış canlı hücre görüntülemesi için kullanılabilecek esnek bir odanın tasarımı ve üretimi açıklanmaktadır. Odanın esnekliği, yumuşak bir malzeme kullanılarak elde edilir - ince bir doğal kauçuk film. Yeni muhafaza ve bölme tasarımı, mevcut bir SRS görüntüleme kurulumuna kolayca eklenebilir. Test ve ön sonuçlar, esnek oda sisteminin, gelecekte çeşitli biyogörüntüleme uygulamaları için kullanılabilecek canlı hücrelerin kararlı, uzun vadeli, hızlandırılmış SRS görüntülemesini sağladığını göstermektedir.

Hızlandırılmış SRS görüntüleme için esnek oda sistemini ürettik ve monte ettik (Şekil 1 ve Şekil 2) ve ardından sistemin performansını değerlendirdik. Mikroskop çevre muhafazası içindeki sıcaklık, 1 saat içinde beklenen 37 ° C'ye ulaştı ve bu da oda sıcaklığını önemli ölçüde etkilemedi (Şekil 3A). Esnek odadaki sıcaklık 1,5 saatte 37 ° C'ye ulaştı ve en az 24 saat boyunca 37 ° C'de sabit bir ...

Watch this Scientific Journal Video about A Flexible Chamber for Time-Lapse Live-Cell Imaging with Stimulated Raman Scattering Microscopy at JoVE.com

A Flexible Chamber for Time-Lapse Live-Cell Imaging with Stimulated Raman Scattering Microscopy

İletilen sinyal algılamalı dik uyarılmış Raman saçılma mikroskobu kullanılarak canlı hücrelerin hızlandırılmış görüntülenmesi için sahne üstü, esnek bir çevre odası sunuyoruz. Lipid damlacıkları, oleik asit ile muamele edilen SKOV3 hücrelerinde, 3 dakikalık bir zaman aralığıyla 24 saate kadar görüntülendi.

Uyarılmış Raman Saçılma Mikroskobu ile Hızlandırılmış Canlı Hücre Görüntüleme için Esnek Bir Oda

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology. Live-cell imaging with SRS has been demonstrated for many ...

Esnek çevre odası tekniği, bir çalışma mikroskobu çerçevesi üzerinde iletilen sinyal algılama ile SRS görüntüleme olarak hızlandırılmış çekim sağlar. SRS mikroskopisi, yüksek sayısal açıklıklı bir hedef ve yüksek uçlu bir kondenser kullandı ve geleneksel bir odanın sığamayacağı yerlerde sadece birkaç milimetre boşluk bıraktı. Esnek bir oda bu sorunu çözer.SRS mikroskobu kullanan araştırmacılar bu tekniği kolayca benimseyebilirler. Esnek oda, numuneyi optimum fizyolojik koşullar altında tutmak için diseksiyon veya steril mikroskopta da kullanılabilir. Başlamak için, SRS mikroskop çerçevesinin ayaklarının yerlerini ve motorlu sahneyi optik masadaki bir işaretleyici kalem kullanarak işaretleyin.Mikroskop çerçevesini ve aşamasını optik masadan çıkardıktan sonra, silikon kauçuk tabakayı masanın üzerine yerleştirin. Silikon kauçuğu bir bıçak kullanarak işaretler boyunca kesin. Küçük kauçuk parçaları çıkarın ve kare mika seramik levhaları aynı yerlere yerleştirin.Ardından mikroskop çerçevesini ve sahneyi optik masaya geri getirin ve ayakları işaretleyici çizgileri boyunca mika seramik tabakalara dikkatlice hizalayın. SRS optik yolunu yeniden hizaladıktan sonra, beş parça büyük polikarbonat levha kullanarak, tüm mikroskop çerçevesini kaplamak için çevresel muhafazayı ısı yalıtım temelinin üzerine monte edin. Alüminyum folyo bant kullanarak kutunun kenarlarını ve arayüzlerini kapatın.Isıtıcı modülü tarafından pompalanan ve kontrol edilen sirkülasyonlu, sıcak hava akışına izin vermek için esnek kanal hortumunu muhafaza kutusunun giriş ve çıkış portlarına bağlayın. İşlenmiş içi boş silindirik alüminyum parça 1'i, üç set vidası kullanarak hedefin burun parçasına monte edin. Daha sonra, işlenmiş içi boş silindirik alüminyum parça 2'yi dört vida kullanarak numune tutucuya monte edin.Alüminyum parça 2'li numune tutucuyu motorlu sahneye takın ve vidalar kullanarak monte edin. Doğal kauçuk film manşonunu işlenmiş iki alüminyum parça arasına yerleştirin ve her iki ucunda lastik bantlar kullanarak monte edin. Sıkıştırılmış CO2 tüpünü uygun boru ve konektörleri kullanarak gaz karıştırıcı modülüne bağlayın.CO2 giriş basıncını 20 ila 25 psi olarak ayarlayın. Hava karıştırıcı modülünün %5 CO2'yi düzenleyebildiğinden ve hava akışına karıştırabildiğinden emin olmak için dahili CO2 sensörünü ve bir kontrolörü kullanın. Hava akışını temizlemek için hat içi filtreler kullanın.Uygun boru ve konektörleri kullanarak, karışık havayı ocak plakasına yerleştirilen önceden sterilize edilmiş su şişesine yönlendirin ve ardından nemlendirilmiş havayı esnek odaya yönlendirin. Ocakçığı 37 santigrat dereceye ayarlayın. Hava akışının nemini artırmak için ılık sudaki hava akışını kabarcıklandırın.Vidaları sökerek makinenin alüminyum parça 2'sini numune tutucudan ayırın. Burun parçası, numune tutucu ve suya daldırma hedefi dahil olmak üzere esnek haznenin tüm parçalarını %70 etanol ile silin. Muhafazaya yerleştirilmiş bir UV lambası kullanarak 20 ila 30 dakika boyunca tüm muhafaza sistemini dekontamine edin.Sonra hücre kültürü kabını yükleyin. Çanağın kapağını çıkarın ve kelepçeleri kullanarak hareketsiz hale getirin. Kaba odaklama için hedefi hücre kültürü ortamına indirin.Esnek hazneyi kapatmak için alüminyum parça 2'yi indirin ve vidaları kullanarak numune tutucuya monte edin. Ardından sensörü takın. Normal hücre kültürü için hava beslemesini% 5 CO2 ve% 19 O2 ile dakikada 200 santimetreküp hava akış hızına ve sıcaklığa 37 santigrat dereceye kadar ayarlayın.CH2 kimyasal bağlarının titreşimine atfedilen 2.854 santimetre ters Raman kaymasını hedeflemek için lazer dalga boyunu 805 nanometreye ayarlayın. Hücrelere verilen fotoğraf hasarını azaltmak için düşük lazer gücü kullanın. Yazılımın ana kontrol panelindeki odak düğmesini kullanarak hücrelerin iyi SRS görüntülemesini elde etmek için hedefi ayarlayın ve odaklayın.Hızlı odaklama gerçekleştirmek için yapılandırma panelinde piksel bekleme süresi 4,8 mikrosaniye olacak şekilde piksel sayısını 512 x 512 piksel olarak ayarlayın. İyi odaklama elde ettikten sonra, yüksek kaliteli görüntüler elde etmek için görüntüleme çözünürlüğünü 175 mikrometre karelik bir görüş alanı için 2048 x 2048 piksel olarak ayarlayın. Ana kontroller panelindeki kaydet işlevini kontrol edin ve kanallar panelindeki SRS kanalını kontrol edin.İki kare arasındaki aralık süresini ana kontroller kanalında 180 saniye olarak ayarlayın. 24 saat boyunca hızlandırılmış görüntüleme için edinme numarasını 480 olarak ayarlayın. Ana kontrol panelindeki döngü işlevini kullanarak otomatik görüntüleme alımını başlatın.Esnek kamara sisteminin hızlandırılmış SRS görüntüleme için performansı değerlendirildi. Mikroskop çevre muhafazasının içindeki sıcaklık beklenen 37 santigrat dereceye ulaştı ve oda sıcaklığını önemli ölçüde etkilemedi. Esnek odadaki sıcaklık 1,5 saatte 37 santigrat dereceye ulaştı ve en az 24 saat boyunca istikrarlı bir şekilde muhafaza edildi.Esnek odadaki bağıl nem bir saat içinde% 85'e ulaştı ve en az 24 saat boyunca korunabildi. Canlı SKOV3 hücrelerinin hızlandırılmış SRS görüntülemesi, hücre içi lipit damlacıklarının hızlı ve aktif hareketini üç dakikalık bir zamansal çözünürlükle gösterdi. 24 saatlik görüntüleme seansının sonunda, hücreler hala normal morfoloji ve yoğunluk gösterdi ve bu da hücrelerin sağlıklı olduğunu gösterdi.Daha sonra, oleik asit ile tedavi edilen SKOV3 hücreleri görüntülendi ve lipit damlacık birikimi 10 saat boyunca izlendi. Lipid damlacık miktarları, lipid damlacığı / hücre vücut alanı oranı ve lipid damlacıklarının toplam SRS yoğunluğu kullanılarak ölçüldü. Sonuçlar, lipit damlacıklarının miktarının 10 saat boyunca artmaya devam ettiğini göstermektedir.Lipid damlacıklarının eşzamanlı ileri SRS görüntülemesi ve floresan boya DND-189 ile etiketlenmiş lizozomların geriye doğru iki foton floresan görüntülemesi de gösterilmiştir. Lipid damlacıklarının ve lizozomların çok düşük derecede kolokalizasyonu gözlendi. Bu protokolü denerken, fokal sürüklenmenin canlı hücre görüntülemede yaygın bir sorun olduğunu unutmayın.Yaklaşık iki saatlik hızlandırılmış görüntülemeden sonra yeniden odaklama gerekebilir. Geliştirilmesinden sonra, hızlandırılmış SRS görüntüleme, canlı hücrelerde etiketsiz molekülleri veya Raman metni ile etiketlenmiş molekülleri izlemek için çeşitli çalışmalar için kullanılmıştır.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

Bıçak kenar Tarama Mikroskopi için Numune Hazırlama, Görüntüleme ve Analiz Protokolleri

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

Biyomühendislik

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

RootChip kullanarak Kök Çevre Rapid manipülasyonu ile Arabidopsis Kök Büyüme Time-lapse Floresans Görüntüleme

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Floresan Mikroskobu ile Görüntüleme Hücre Göç Yapıştırıcı ve Çözünür Degradeler oluşturma

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Sample Drift Correction Following 4D Confocal Time-lapse Imaging

4D Eşodaklı Time-lapse Görüntüleme ardından Numune Drift Düzeltme

The generation of four-dimensional (4D) confocal datasets; consisting of 3D image sequences over time; provides an excellent methodology to capture ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Ticari Mikroskop Canlı Hücre Zarları Moleküler Difüzyon Kanunu Hızlı Floresans Görüntüleme Gönderen

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Aracı Olarak bir lipozomal-kapsüllü Yakın-Kızılötesi floroforun Floresan-söndürme<em&gt; İn Vivo</em&gt; Optik Görüntüleme

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

Mekanik Stretch sırasında Canlı Hücre Görüntüleme

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

mikroakışkan Probe ile Canlı Hücre Katmanlar hızlı Subtractive Desenlendirme

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Hücreleri tarafından seçilmiş adezyon oluşumunda görselleştirme gelişmiş Disk-toplam iç yansıma floresans mikroskobu iplik

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

Zaman Atlamalı Mikroskopi Kullanılarak Escherichia Coli'de Biyolojik Gürültünün Sürekli Ölçümü

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process ...