Name: microengineering 3d collagen hydrogels with long-range fiber alignment
Uploaded: 2022-09-07T14:45:00
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この研究の一部は、国立衛生研究所(授与番号R21GM143658)および国立科学財団(助成金番号2150798)によって支援されました。内容は著者の責任であり、必ずしも資金提供機関の公式見解を表すものではありません。

1. 2ピースチャンネルとモジュラープラットフォームベースの製作
注:マイクロ流体チャネルは、定義された厚さのポリジメチルシロキサン(PDMS)シートからかみそりでカットされたマイクロ流体チャネル「カットアウト」と、カットアウトに可逆的に結合してチャネルを形成するチャネルカバーの2つの部分で構成されています。チャネルは、媒体リザーバーと?...

整列したファイバーでCOL1マトリックスを生成するためのプロトコルは、磁気的方法、機械的ひずみの直接適用、およびマイクロ流体技術を使用して説明されています47。マイクロ流体アプローチは、生化学的微小環境を正確に制御できる、明確に定義された流れと輸送特性により、マイクロ生理学的システムを作成するために一般的に使用されます。整列したCOL1ファイバー...

細胞は細胞外マトリックス(ECM)と呼ばれる複雑な3D線維ネットワークに存在し、その大部分は構造タンパク質コラーゲンI型(COL1)1,2で構成されています。ECMの生物物理学的特性は細胞にガイダンスの手がかりを提供し、それに応じて、細胞はECMマイクロアーキテクチャを再構築します3、4、5。これらの相互細胞-マトリックス相互作用は、腫瘍環境7,8,9における血管新生および細胞浸潤を促進し、細胞形態10,11,12、分極13、および分化14に影響を与える整列したCOL1ファイバードメイン6を生じ得る。整列したコラーゲン線維はまた、創傷治癒15を促進し、組織発達において重要な役割を果たし16、および長距離細胞コミュニケーションに寄与する17,18。したがって、ネイティブCOL1ファイバーマイクロアーキテクチャをin vitroで複製することは、整列した微小環境に対する細胞応答を研究するための構造化モデルの開発に向けた重要なステップです。
マイクロ流体細胞培養システムは、マイクロ生理学的システム(MPS)を開発するための好ましい技術として確立されています19,20,21,22,23。有利なマイクロスケールスケーリング効果を活用して、これらのシステムは流体の流れを正確に制御し、機械的力の制御された導入をサポートし、マイクロチャネル21、24、25、26、27内の生化学的微小環境を定義します。MPSプラットフォームは、組織特異的微小環境をモデル化し、多臓器相互作用を研究するために使用されています28。同時に、ヒドロゲルは、インビボで観察されるECMの3D力学および生物学的影響を再現するために広く探求されてきた29,30。 3D培養とマイクロ流体プラットフォームの統合にますます重点が置かれているため、多くのアプローチがマイクロ流体デバイス31、32、33でCOL1ヒドロゲルを組み合わせることができます。しかし、COL1ヒドロゲルをマイクロ流体チャネルに整列させる方法は、幅<1 mmのチャネルの薄い2D「マット」(厚さ<40 μm)に限定されており、整列した3D微小環境で細胞応答をモデル化する可能性は限られています31,34,35,36。
マイクロ流体システムにおいて整列した3D COL1ヒドロゲルを達成するために、自己組織化COL1溶液が局所的な伸長流(流れ方向に沿った速度変化)にさらされると、得られたCOL1ヒドロゲルは、それらが経験する伸長ひずみ速度の大きさに正比例する繊維配向の程度を示すことが示されている37。38。このプロトコルのマイクロチャネル設計は、2つの点で独特です。第1に、セグメント化された設計により、COL1ソリューションに局所的な伸張ひずみが導入され、第2に、その「ツーピース」構造により、ユーザーはCOL1ファイバーを整列させてからチャネルを分解して、整列したファイバーにオープンフォーマットで直接アクセスできます。このアプローチは、秩序あるCOL1マトリックスを持つ微小生理学的システムを開発するモジュラーマイクロ流体プラットフォームの開発にさらに採用できます。以下のプロトコルは、セグメント化されたマイクロチャネルを作製するプロセスについて説明し、ウシアテロCOL1を整列させるためのチャネルの使用を詳述しています。このプロトコルでは、オープンウェル形式でCOL1上の細胞を培養するための手順も提供し、モジュール式の磁気ベース層を使用してプラットフォームに機能を追加する方法について説明します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl)triethoxysilane, 99% (APTES)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>440140-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 Gauge IT Series Angled Dispensing Tip</td>
			<td>Jensen Global</td>
			<td>JG-20-1.0-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3/16&#34; dia. x 1/16&#34; thick Nickel Plated Magnet</td>
			<td>KJ Magnetics</td>
			<td>D31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M (TC) 12X12-6-467MP</td>
			<td>DigiKey</td>
			<td>3M9726-ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACETONE ACS REAGENT &#8805;99.5%</td>
			<td>Signa Aldrich</td>
			<td>179124-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD-20AC LABORATORY CORONA TREATER</td>
			<td>Electro-Technic Products</td>
			<td>12051A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent Grade, Alfa Aesar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>AAJ64100-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear cast acrylic sheet</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8560K181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 100 mL Trypsin 10x, 2.5% Trypsin in HBSS [-] calcium, magnesium, phenol red, Porcine Parvovirus Tested</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45000-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CT-FIRE software</td>
			<td>LOCI - University of Wisconsin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit, (CC-3156 &#38; CC-4176), Lonza CC-3162, 500 mL</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 50% in aqueous solution, Reagent Grade, Packaging=HDPE Bottle, Size=100 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRV0875-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphtec CELITE-50</td>
			<td>Graphtec</td>
			<td>CE LITE-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15-630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Purity Silicone Rubber .010&#34; Thick, 6&#34; X 8&#34; Sheet, 55A Durometer</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>87315K62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Umbilical Vein Endothelial cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C0035C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen&#160;Trypan Blue Stain (0.4%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A4154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser cutter</td>
			<td>Full Spectrum</td>
			<td>20x12 H-series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidics Syringe pump</td>
			<td>New Era Syringe Pumps</td>
			<td>NE-1002X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microman E Single Channel Pipettor, Gilson, Model M1000E</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FD10006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Probes Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutragen Bovine Atelo Collagen</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5010-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pbs (10x), pH 7.4</td>
			<td>VWR</td>
			<td>70011044.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010049.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), with Triton X-100</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J63521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replacement carrier sheet for graphtec craft ROBO CC330L-20</td>
			<td>USCUTTER</td>
			<td>GRPCARSHTN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restek Norm-Ject Plastic Syringe 1 mL Luer Slip</td>
			<td>Restek</td>
			<td>22766.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>University wafer</td>
			<td>452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide, ACS, Packaging=Poly Bottle, Size=500 g</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9292-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>VWR</td>
			<td>102092-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#160;Pierce 20x PBS Tween 20</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28352.00</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microengineering 3d collagen hydrogels with long-range fiber alignment

整列コラーゲンI(COL1)繊維は、腫瘍細胞の運動性を導き、内皮細胞の形態に影響を与え、幹細胞の分化を制御し、心臓および筋骨格組織の特徴です。 in vitroで整列した微小環境に対する細胞応答を研究するために、磁気的、機械的、細胞ベース、およびマイクロ流体法を含む、定義されたファイバー整列を有するCOL1マトリックスを生成するためのいくつかのプロトコルが開発されている。これらのうち、マイクロ流体アプローチは、流体の流れや細胞の微小環境を正確に制御するなどの高度な機能を提供します。しかし、高度な in vitro 培養プラットフォーム用に整列したCOL1マトリックスを生成するためのマイクロ流体アプローチは、500 μm未満の距離に伸びるCOL1繊維の薄い「マット」(厚さ<40 μm)に限定されており、3D細胞培養アプリケーションに役立ちません。ここでは、マイクロ流体デバイス内で定義されたファイバーアライメントのミリメートルスケール領域を持つ3D COL1マトリックス(厚さ130〜250 μm)を作製するためのプロトコルを紹介します。このプラットフォームは、細胞培養用のマイクロエンジニアリングマトリックスへの直接アクセスを提供することにより、構造化された組織の微小環境をモデル化するための高度な細胞培養機能を提供します。

自己組織化COL1溶液が断面積の減少を伴うチャネルを流れると、COL1溶液の流れ方向の速度(v x)は、2つのセグメント間のくびれの長さ(∂x)に沿って局所的に大きさ∂v x増加し、ε̇=∂v x/∂xの伸長ひずみ速度(ε̇)になります。伸張ひずみ速度は、図2に示すように、粒子画像速度測定(PIV)を使用して測定される流体速度から計算できます。
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Microengineering 3D Collagen Hydrogels with Long-Range Fiber Alignment (Video) | JoVE

このプロトコルは、流体の流れ方向に沿って形状を変化させるマイクロ流体チャネルを使用して、3Dコラーゲンヒドロゲル(厚さ<250 μm)内の繊維を整列させるための伸長ひずみ(伸張)を生成する方法を示します。結果として得られるアライメントは数ミリメートルにまたがり、伸張ひずみ速度の影響を受けます。

長距離繊維配向によるマイクロエンジニアリング3Dコラーゲンヒドロゲル

Aligned collagen I (COL1) fibers guide tumor cell motility, influence endothelial cell morphology, control stem cell differentiation, and are a hallmark ...

この方法により、繊維アライメントのレベルを制御した3Dコラーゲンヒドロゲルを設計して、体内の健康な組織や病気の組織に見られる環境をモデル化することができます。この技術は、整列コラーゲンヒドロゲルを設計し、細胞を導入し、トポグラフィー的に定義された3D環境で細胞がどのように振る舞うかを定量化するためのシンプルなマイクロ流体アプローチを提供します。手順を実演するのは、私の研究室のニール・ジョシ、メヘラン・マンスーリ、アン・バイアリー、ジャスティン・ヴィダスです。まず、厚さ250マイクロメートルのPDMSシートをプラスチックキャリアに取り付け、クラフトカッターを使用して、ブレードの深さ0.5ミリメートル、毎秒1センチメートルの速度、および高い力でマイクロ流体設計をかみそりで切断します。超音波浴を使用して、マイクロ流体チャネルの切り欠きを5分間洗浄します。超音波処理されたチャネルを脱イオン水ですすぎ、5分間摂氏100度のホットプレートで乾燥させます。使用するまで、チャネルを清潔で蓋をしたペトリ皿に保管します。PDMSカバー層を作製し、将来の改質のために表面を機能化するために、49ミリリットルのアセトンに1ミリリットルのアミノプロピルトリエトキシシランを加えて、ガラスビーカーに2%アミノプロピルトリエトキシシラン溶液を調製する。次に、25%グルタルアルデヒド溶液を5%の脱イオン水に希釈します。24ミリメートル×50ミリメートルのカバースリップごとに2ミリリットルの溶液を作ります。IPAを使用してバス超音波処理器のカバースリップを5分間清掃します。脱イオン水を使用してカバースリップからIPAを洗い流します。カバースリップの滑らかな水の膜は、IPAが完全にすすがれていることを示しています。カバースリップをホットプレートで摂氏100度で5分間乾燥させます。乾燥したカバースリップをきれいなペトリ皿に入れ、重ならないようにします。コロナ放電ワンドを使用して、カバースリップをコロナ放電にそれぞれ1分間さらします。コロナ暴露から5分以内にカバースリップを取り外し、各カバースリップをアミノプロピルトリエトキシシラン溶液に10秒間浸し、カバースリップが水没していることを確認してから、カバースリップをアミノプロピルトリエトキシシラン溶液から取り外し、アセトンに10秒間浸し、圧縮空気で乾燥させます。乾いたカバースリップをペトリ皿に戻し、処理面を上に向けてください。各カバースリップの表面に1ミリリットルのグルタルアルデヒド溶液をピペットで貼り付けます。溶液がカバースリップの端からこぼれないように、できるだけ多くの表面を覆います。カバースリップを溶液に30分間接触させてから、脱イオン水で20秒間すすぎます。圧縮空気を使用してカバースリップを乾燥させ、プラズマ処理面を上にしてペトリ皿に戻します モジュラー磁気ベースをレーザー切断するには、パス数や出力などの適切なレーザー設定を使用してPMMA層から設計を切り取ります。磁石をPMMA層に圧入できるように、レーザー設定を調整する必要があります。石鹸と水を使用してレーザーカット部分を洗浄し、レーザーカットプロセスから破片を取り除きます。溶剤は、レーザーカットされたエッジにマイクロクラックを伝播する可能性があるため、使用しないでください。プラットフォームを組み立てるには、磁石を手でレーザーカットされたベースに押し込みます。磁石の厚さは、磁石がベースの表面と同じ高さになるように、PMMAベースの厚さよりも小さくする必要があります。粘着剤または粘着シートから裏地をはがし、機能面を上に向けてグルタルアルデヒド処理したカバースリップにベースを取り付けます。PDMSチャンネルカットアウトをフレームで定義されたキャビティにそっと配置します。ワイドチップピンセットで押し下げて気泡を取り除き、コンフォーマルコンタクトを確保します。ウシ血清アルブミンまたはBSA処理されたチャンネルカバーを、BSA側を下に向けてチャンネルカットアウトの上に置きます。液体の入口ポートと出口ポートがチャネルと揃っていることを確認します。デバイスはコラーゲンI注射の準備ができています。シリンジポンプ、冷やした滅菌シリンジ、冷やした中和コラーゲンI溶液、および滅菌20ゲージの90度角度チップルアーロックニードルをバイオセーフティキャビネットに入れます。コラーゲンI溶液をシリンジに入れ、気泡を避けます。針先をシリンジに取り付け、注射器を注射器ポンプにロードし、針を下に向けて、コラーゲンI溶液で針をプライミングします。シリンジポンプを毎分50〜2, 000マイクロリットルの必要な流量に設定します。準備したPDMSチャンネルをラボジャックに置き、針と同じ高さにします。PDMSチャンネルの入口ポートに針を挿入します。出口側に30マイクロリットルのコラーゲンが溜まるまでチャネルを注入します。ラボジャックを下げ、新しく充填されたチャネルから針をそっと分離します。すべてのチャンネルがコラーゲンI溶液で満たされるまで繰り返します。新しく形成されたコラーゲンIゲルの脱水を防ぐために、脱イオン水で飽和した清潔で糸くずの出ないワイプと一緒に、充填されたチャネルをペトリ皿に入れます。ペトリ皿を覆い、装填したチャンネルをインキュベーターに2時間入れてから、剥離ステップを行います。ピールオフと培地平衡化のために、ピンセットを使用してPDMSカバーを持ち上げ、重合コラーゲンIゲルを露出させることから始めます。650マイクロリットルの内皮増殖培地をウェルに加えます。または、別のモジュールを取り付けて、追加のコラーゲン層を導入するか、培地灌流機能を提供します。デバイスをインキュベーターに最低4時間放置して、ゲルと培地を平衡化します。細胞を播種する前に培地を交換してください。ガラスカバースリップを機能化することでチャネルリフトオフを可能にし、PDMSカバーをBSAで機能化することでコラーゲンIの付着を防止しました。コラーゲンI線維のアライメントは、カバーを持ち上げた後も影響を受けませんでした。マトリックスの整列したセグメント上で培養されたHUVECの画像は、ランダムな繊維を有するセグメント上のHUVECと比較して、アクチン線維の整列の増加を示しました。私たちのアプローチにより、腫瘍の微小環境をモデル化し、さまざまな細胞タイプがどのように反応するかを定量化することができます。また、長期実験をサポートするために流路を導入することもできます。

Research

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