Name: microengineering 3d collagen hydrogels with long-range fiber alignment
Uploaded: 2022-09-07T14:45:00
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Este trabalho foi apoiado em parte pelo Instituto Nacional de Saúde sob o número de prêmio R21GM143658 e pela National Science Foundation sob o número de concessão 2150798. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa, necessariamente, a opinião oficial das agências de fomento.

1. Fabricação do canal de duas peças e da base da plataforma modular
NOTA: O canal microfluídico é construído usando duas partes — o "recorte" do canal microfluídico, que é cortado a partir de uma folha de polidimetil siloxano (PDMS) de espessura definida, e a tampa do canal, que se liga reversivelmente ao recorte e forma o canal. O canal é circundado por uma estrutura de poli(metacrilato de metila) (PMMA) que atuará como um reservatório de meio (<strong class="xfig...

Protocolos para geração de matrizes de COL1 com fibras alinhadas têm sido descritos utilizando métodos magnéticos, aplicação direta de deformações mecânicas e técnicasmicrofluídicas47. Abordagens microfluídicas são comumente usadas para criar sistemas microfisiológicos devido às suas características de fluxo e transporte bem definidas, que permitem o controle preciso sobre o microambiente bioquímico. Uma vez que as fibras de COL1 alinhadas fornecem pistas instrutivas importantes ...

As células residem em uma complexa rede fibrosa 3D denominada matriz extracelular (MEC), cuja maior parte é composta pela proteína estrutural colágeno tipo I (COL1)1,2. As propriedades biofísicas da MEC fornecem pistas de orientação às células e, em resposta, as células remodelam a microarquitetura da MEC 3,4,5. Essas interações recíprocas célula-matriz podem dar origem a domínios alinhados das fibras COL16 que promovem angiogênese e invasão celular no ambiente tumoral 7,8,9 e influenciam a morfologia celular 10,11,12, polarização13 e diferenciação 14. As fibras colágenas alinhadas também promovem a cicatrização deferidas15, desempenham papel fundamental no desenvolvimento tecidual 16 e contribuem para a comunicação celular de longo alcance17,18. Portanto, replicar a microarquitetura da fibra COL1 nativa in vitro é um passo importante para o desenvolvimento de modelos estruturados para estudar as respostas celulares a microambientes alinhados.
Sistemas de cultura de células microfluídicas têm se estabelecido como tecnologia preferencial para o desenvolvimento de sistemas microfisiológicos (MPS)19,20,21,22,23. Aproveitando os efeitos favoráveis de escala em microescala, esses sistemas fornecem controle preciso sobre os fluxos de fluidos, suportam a introdução controlada de forças mecânicas e definem o microambiente bioquímico dentro de um microcanal 21,24,25,26,27. As plataformas MPS têm sido utilizadas para modelar microambientes tecido-específicos e estudar interações multi-órgãos28. Simultaneamente, hidrogéis têm sido amplamente explorados para recapitular a mecânica 3D e a influência biológica da MEC que são observadas in vivo29,30. Com uma ênfase crescente na integração da cultura 3D com plataformas microfluídicas, inúmeras abordagens podem combinar hidrogéis de COL1 em dispositivos microfluídicos31,32,33. No entanto, os métodos para alinhar hidrogéis de COL1 em canais microfluídicos têm sido limitados a "esteiras" 2D finas (<40 μm de espessura) em canais <1 mm de largura, oferecendo potencial limitado para modelar respostas celulares em microambientes 3D alinhados31,34,35,36.
Para obter hidrogéis 3D de COL1 alinhados em um sistema microfluídico, foi demonstrado que, quando uma solução de COL1 automontável é exposta a fluxos extensionais locais (mudança de velocidade ao longo da direção do fluxo), os hidrogéis COL1 resultantes exibem um grau de alinhamento da fibra que é diretamente proporcional à magnitude da taxa de deformação extensional que experimentam37, 38º. O design de microcanais neste protocolo é único de duas maneiras; primeiro, o projeto segmentado introduz a tensão extensional local para a solução COL1 e, segundo, sua construção de "duas peças" permite que o usuário alinhe as fibras COL1 e, em seguida, desmonte o canal para acessar diretamente as fibras alinhadas em um formato aberto. Esta abordagem pode ainda ser adotada para o desenvolvimento de plataformas microfluídicas modulares que desenvolvam sistemas microfisiológicos com matrizes de COL1 ordenadas. O protocolo a seguir descreve o processo de fabricação de microcanais segmentados e detalha o uso dos canais para alinhar o ATEL bovino COL1. Este protocolo também fornece instruções para o cultivo de células em COL1 em um formato de poço aberto e discute a adição de funcionalidade à plataforma usando uma camada de base magnética modular.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl)triethoxysilane, 99% (APTES)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>440140-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 Gauge IT Series Angled Dispensing Tip</td>
			<td>Jensen Global</td>
			<td>JG-20-1.0-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3/16&#34; dia. x 1/16&#34; thick Nickel Plated Magnet</td>
			<td>KJ Magnetics</td>
			<td>D31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M (TC) 12X12-6-467MP</td>
			<td>DigiKey</td>
			<td>3M9726-ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACETONE ACS REAGENT &#8805;99.5%</td>
			<td>Signa Aldrich</td>
			<td>179124-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD-20AC LABORATORY CORONA TREATER</td>
			<td>Electro-Technic Products</td>
			<td>12051A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent Grade, Alfa Aesar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>AAJ64100-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear cast acrylic sheet</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8560K181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 100 mL Trypsin 10x, 2.5% Trypsin in HBSS [-] calcium, magnesium, phenol red, Porcine Parvovirus Tested</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45000-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CT-FIRE software</td>
			<td>LOCI - University of Wisconsin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit, (CC-3156 &#38; CC-4176), Lonza CC-3162, 500 mL</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 50% in aqueous solution, Reagent Grade, Packaging=HDPE Bottle, Size=100 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRV0875-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphtec CELITE-50</td>
			<td>Graphtec</td>
			<td>CE LITE-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15-630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Purity Silicone Rubber .010&#34; Thick, 6&#34; X 8&#34; Sheet, 55A Durometer</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>87315K62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Umbilical Vein Endothelial cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C0035C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen&#160;Trypan Blue Stain (0.4%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A4154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser cutter</td>
			<td>Full Spectrum</td>
			<td>20x12 H-series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidics Syringe pump</td>
			<td>New Era Syringe Pumps</td>
			<td>NE-1002X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microman E Single Channel Pipettor, Gilson, Model M1000E</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FD10006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Probes Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutragen Bovine Atelo Collagen</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5010-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pbs (10x), pH 7.4</td>
			<td>VWR</td>
			<td>70011044.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010049.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), with Triton X-100</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J63521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replacement carrier sheet for graphtec craft ROBO CC330L-20</td>
			<td>USCUTTER</td>
			<td>GRPCARSHTN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restek Norm-Ject Plastic Syringe 1 mL Luer Slip</td>
			<td>Restek</td>
			<td>22766.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>University wafer</td>
			<td>452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide, ACS, Packaging=Poly Bottle, Size=500 g</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9292-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>VWR</td>
			<td>102092-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#160;Pierce 20x PBS Tween 20</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28352.00</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microengineering 3d collagen hydrogels with long-range fiber alignment

As fibras alinhadas de colágeno I (COL1) guiam a motilidade das células tumorais, influenciam a morfologia das células endoteliais, controlam a diferenciação das células-tronco e são uma marca registrada dos tecidos cardíaco e musculoesquelético. Para estudar a resposta celular a microambientes alinhados in vitro, vários protocolos foram desenvolvidos para gerar matrizes de COL1 com alinhamento de fibras definido, incluindo métodos magnéticos, mecânicos, baseados em células e microfluídicos. Destas, as abordagens microfluídicas oferecem recursos avançados, como controle preciso sobre os fluxos de fluidos e o microambiente celular. No entanto, as abordagens microfluídicas para gerar matrizes alinhadas de COL1 para plataformas avançadas de cultura in vitro têm sido limitadas a "esteiras" finas (<40 μm de espessura) de fibras de COL1 que se estendem por distâncias inferiores a 500 μm e não são propícias a aplicações de cultura celular 3D. Aqui, apresentamos um protocolo para fabricar matrizes 3D de COL1 (130-250 μm de espessura) com regiões de alinhamento de fibras definidas em escala milimétrica em um dispositivo microfluídico. Esta plataforma fornece recursos avançados de cultura de células para modelar microambientes de tecidos estruturados, fornecendo acesso direto à matriz micro-projetada para cultura de células.

Quando uma solução de COL1 automontável flui através de um canal com área de secção transversal decrescente, a velocidade de fluxo (v x) da solução de COL1 aumenta localmente em uma magnitude, ∂v x, ao longo do comprimento da constrição entre os dois segmentos (∂x), resultando em uma taxa de deformação extensional (ε̇) onde ε̇ = ∂v x/∂x. A taxa de deformação extensional pode ser calculada a partir da velocidade do fluido, que é medida por meio da velocimetria p...

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Microengineering 3D Collagen Hydrogels with Long-Range Fiber Alignment (Video) | JoVE

Este protocolo demonstra o uso de um canal microfluídico com geometria variável ao longo da direção do fluxo de fluido para gerar deformação extensional (alongamento) para alinhar as fibras em um hidrogel de colágeno 3D (<250 μm de espessura). O alinhamento resultante se estende por vários milímetros e é influenciado pela taxa de deformação extensional.

Microengenharia 3D Colágeno Hidrogéis com Alinhamento de Fibras de Longo Alcance

Aligned collagen I (COL1) fibers guide tumor cell motility, influence endothelial cell morphology, control stem cell differentiation, and are a hallmark ...

Este método nos permite projetar hidrogéis de colágeno 3D com níveis controlados de alinhamento de fibras para modelar ambientes encontrados em tecidos saudáveis e doentes do corpo. Esta técnica fornece uma abordagem microfluídica simples para projetar hidrogéis de colágeno alinhados, introduzir células e quantificar como as células se comportam em ambientes 3D topograficamente definidos. Demonstrando o procedimento estarão Neil Joshi, Mehran Mansouri, Ann Byerly e Justin Vidas para o meu laboratório.Para começar, monte uma folha PDMS de 250 micrômetros de espessura em um suporte de plástico e corte o design microfluídico usando um cortador artesanal a uma profundidade de lâmina de 0,5 milímetros, velocidade de um centímetro por segundo e alta força. Usando um banho ultra-sônico, limpe os recortes do canal microfluídico por cinco minutos. Enxágue os canais sonicados em água deionizada e seque-os em uma placa quente a 100 graus Celsius por cinco minutos.Guarde os canais em uma placa de Petri limpa e coberta até o uso. Para fabricar a camada de cobertura PDMS e funcionalizar a superfície para futuras modificações, prepare uma solução de 2% de aminopropiltrietoxisilano em um copo de vidro adicionando um mililitro de aminopropil trietoxisilano a 49 mililitros de acetona. Em seguida, diluir uma solução de glutaraldeído a 25% a 5% em água deionizada.Faça dois mililitros de solução para cada 24 milímetros por 50 milímetros de tampa deslizante. Limpe as tampas em um sonicador de banho por cinco minutos usando IPA. Enxágue o IPA das lamínulas da tampa com água deionizada.Uma película lisa de água na tampa indica que o IPA está completamente enxaguado. Seque a tampa desliza em uma placa quente por cinco minutos a 100 graus Celsius. Coloque as tampas secas em placas de Petri limpas, garantindo que elas não se sobreponham.Usando uma varinha de descarga corona, exponha as tampas a uma descarga corona por um minuto cada. Remova as lamíneas da tampa dentro de cinco minutos após a exposição à coroa e mergulhe cada deslizamento da tampa na solução de aminopropiltrietoxisilano por 10 segundos, garantindo que a tampa fique submersa Em seguida, remova as lâminas da tampa da solução de aminopropiltrietoxisilano, mergulhe-as em acetona por 10 segundos e seque-as com ar comprimido. Coloque a tampa seca de volta na placa de Petri, com o lado tratado virado para cima.Pipetar um mililitro de solução de glutaraldeído na superfície de cada lamínula. Cubra o máximo de superfície possível sem permitir que a solução se espalhe sobre a borda da tampa. Deixe a tampa em contato com a solução por 30 minutos e, em seguida, enxágue com água deionizada por 20 segundos.Seque as tampas usando ar comprimido e coloque-as de volta nas placas de Petri, o lado tratado com plasma para cima Para cortar a laser a base magnética modular, corte os desenhos da camada de PMMA usando configurações de laser apropriadas, como o número de passadas e a potência. As configurações do laser devem ser ajustadas para que os ímãs possam ser pressionados na camada de PMMA. Lave a parte cortada a laser usando água e sabão para remover os detritos do processo de corte a laser.Não use solventes, pois eles podem propagar micro-fissuras nas bordas cortadas a laser. Para montar a plataforma, empurre ímãs manualmente para a base cortada a laser. A espessura dos ímãs deve ser menor do que a espessura da base de PMMA para garantir que os ímãs estejam nivelados com a superfície da base.Retire o suporte do adesivo sensível à pressão, ou folha de PSA, e prenda a base a uma tampa tratada com glutaraldeído com o lado funcionalizado voltado para cima. Coloque suavemente o recorte do canal PDMS na cavidade definida pelo quadro. Pressione para baixo com pinças de ponta larga para remover bolhas de ar e garantir contato conforme.Coloque a albumina de soro bovino ou a tampa do canal tratado com BSA em cima do recorte do canal com o lado BSA voltado para baixo. Verifique se as portas de entrada e saída de fluido estão alinhadas com o canal. O aparelho está pronto para a injeção de colágeno I.Coloque uma bomba de seringa, uma seringa estéril resfriada, uma solução de colágeno I neutralizado resfriada e uma agulha de bloqueio luer de ponta angular estéril de 20 graus de calibre 90 graus em um armário de biossegurança. Coloque a solução de colágeno I na seringa, evitando bolhas. Fixe a ponta da agulha à seringa, carregue a seringa na bomba da seringa, com a agulha virada para baixo e prima a agulha com solução de colagénio I.Ajuste a bomba de seringa para a taxa de fluxo necessária entre 50 a 2.000 microlitros por minuto. Coloque os canais PDMS preparados em um macaco de laboratório e nivele com a agulha. Insira a agulha na porta de entrada do canal PDMS.Injete o canal até que uma gota de 30 microlitros de colágeno eu colete no lado de saída. Abaixe o macaco de laboratório e separe suavemente a agulha do canal recém-preenchido. Repita até que todos os canais tenham sido preenchidos com solução de colágeno I.Coloque os canais preenchidos nas placas de Petri ao lado de um lenço limpo e sem fiapos saturado com água deionizada para evitar a desidratação do gel de colágeno I recém-formado. Tampe a placa de Petri e coloque os canais carregados na incubadora por duas horas antes da etapa de descascamento. Para o peel-off e equilíbrio do meio, comece retirando a tampa do PDMS usando uma pinça para expor o gel de colágeno I polimerizado.Adicione 650 microlitros de meio de crescimento endotelial ao poço. Alternativamente, conecte outro módulo para introduzir uma camada adicional de colágeno ou fornecer recursos de perfusão de mídia. Deixe os dispositivos na incubadora por no mínimo quatro horas para equilibrar o gel e o meio.Substitua a mídia antes de semear por células. A funcionalização da tampa de vidro permitiu a decolagem do canal e a funcionalização da tampa PDMS com BSA impediu a fixação do colágeno I. O alinhamento das fibras de colágeno I permaneceu inalterado após a retirada da cobertura.Imagens das HUVECs cultivadas no segmento alinhado da matriz mostraram maior alinhamento das fibras de actina em comparação com as HUVECs no segmento com fibras aleatórias. Nossa abordagem nos permite modelar o microambiente tumoral e quantificar como diferentes tipos celulares respondem. Também podemos introduzir canais de fluxo para apoiar experimentos de longo prazo.

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