Name: microengineering 3d collagen hydrogels with long-range fiber alignment
Uploaded: 2022-09-07T14:45:00
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Este trabajo fue apoyado en parte por el Instituto Nacional de Salud bajo el número de concesión R21GM143658 y por la Fundación Nacional de Ciencias bajo el número de subvención 2150798. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de las agencias de financiación.

1. Fabricación del canal de dos piezas y la base de la plataforma modular
NOTA: El canal microfluídico se construye utilizando dos partes: el "recorte" del canal microfluídico, que es una cuchilla cortada de una lámina de polidimetilsiloxano (PDMS) de espesor definido, y la cubierta del canal, que se une reversiblemente al corte y forma el canal. El canal está rodeado por un marco de poli(metacrilato de metilo) (PMMA) que actuará como un depósito de medios (<strong class=...

Los protocolos para generar matrices COL1 con fibras alineadas han sido descritos utilizando métodos magnéticos, la aplicación directa de deformación mecánica y técnicas microfluídicas47. Los enfoques microfluídicos se utilizan comúnmente para crear sistemas microfisiológicos debido a sus características de flujo y transporte bien definidas, que permiten un control preciso sobre el microambiente bioquímico. Dado que las fibras COL1 alineadas proporcionan señales instructivas clave dur...

Las células residen en una compleja red fibrosa 3D llamada matriz extracelular (MEC), la mayor parte de la cual está compuesta por la proteína estructural colágeno tipo I (COL1)1,2. Las propiedades biofísicas de la ECM proporcionan señales de orientación a las células y, en respuesta, las células remodelan la microarquitectura de la ECM 3,4,5. Estas interacciones recíprocas célula-matriz pueden dar lugar a dominios de fibra COL1 alineados6 que promueven la angiogénesis y la invasión celular en el ambiente tumoral 7,8,9 e influyen en la morfología celular 10,11,12, polarización13 y diferenciación 14. Las fibras de colágeno alineadas también promueven la cicatrización de heridas 15, desempeñan un papel clave en el desarrollo de los tejidos16 y contribuyen a la comunicación celular de largo alcance17,18. Por lo tanto, replicar la microarquitectura de fibra COL1 nativa in vitro es un paso importante hacia el desarrollo de modelos estructurados para estudiar las respuestas celulares a microambientes alineados.
Los sistemas de cultivo celular microfluídico se han establecido como una tecnología preferida para desarrollar sistemas microfisiológicos (MPS)19,20,21,22,23. Aprovechando los efectos favorables de escala a microescala, estos sistemas proporcionan un control preciso sobre los flujos de fluidos, admiten la introducción controlada de fuerzas mecánicas y definen el microambiente bioquímico dentro de un microcanal 21,24,25,26,27. Las plataformas MPS se han utilizado para modelar microambientes específicos de tejidos y estudiar interacciones multiorgánicas28. Simultáneamente, los hidrogeles han sido ampliamente explorados para recapitular la mecánica 3D y la influencia biológica de la ECM que se observan in vivo29,30. Con un énfasis creciente en la integración del cultivo 3D con plataformas microfluídicas, numerosos enfoques pueden combinar hidrogeles COL1 en dispositivos microfluídicos31,32,33. Sin embargo, los métodos para alinear hidrogeles COL1 en canales microfluídicos se han limitado a "esteras" delgadas 2D (<40 μm de espesor) en canales de <1 mm de ancho, ofreciendo un potencial limitado para modelar respuestas celulares en microambientes 3D alineados31,34,35,36.
Para lograr hidrogeles COL1 3D alineados en un sistema microfluídico, se ha demostrado que, cuando una solución de COL1 autoensamblable se expone a flujos extensionales locales (cambio de velocidad a lo largo de la dirección de la corriente), los hidrogeles COL1 resultantes muestran un grado de alineación de la fibra que es directamente proporcional a la magnitud de la velocidad de deformación extensional que experimentan37, 38. El diseño de microcanales en este protocolo es único en dos sentidos; primero, el diseño segmentado introduce tensión extensional local a la solución COL1, y segundo, su construcción de "dos piezas" permite al usuario alinear las fibras COL1 y luego desmontar el canal para acceder directamente a las fibras alineadas en un formato abierto. Este enfoque se puede adoptar para desarrollar plataformas microfluídicas modulares que desarrollen sistemas microfisiológicos con matrices COL1 ordenadas. El siguiente protocolo describe el proceso de fabricación de microcanales segmentados y detalla el uso de los canales para alinear el atelo bovino COL1. Este protocolo también proporciona instrucciones para cultivar células en COL1 en un formato de pozo abierto y discute la adición de funcionalidad a la plataforma utilizando una capa base magnética modular.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl)triethoxysilane, 99% (APTES)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>440140-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 Gauge IT Series Angled Dispensing Tip</td>
			<td>Jensen Global</td>
			<td>JG-20-1.0-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3/16&#34; dia. x 1/16&#34; thick Nickel Plated Magnet</td>
			<td>KJ Magnetics</td>
			<td>D31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M (TC) 12X12-6-467MP</td>
			<td>DigiKey</td>
			<td>3M9726-ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACETONE ACS REAGENT &#8805;99.5%</td>
			<td>Signa Aldrich</td>
			<td>179124-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD-20AC LABORATORY CORONA TREATER</td>
			<td>Electro-Technic Products</td>
			<td>12051A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent Grade, Alfa Aesar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>AAJ64100-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear cast acrylic sheet</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8560K181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 100 mL Trypsin 10x, 2.5% Trypsin in HBSS [-] calcium, magnesium, phenol red, Porcine Parvovirus Tested</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45000-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CT-FIRE software</td>
			<td>LOCI - University of Wisconsin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit, (CC-3156 &#38; CC-4176), Lonza CC-3162, 500 mL</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 50% in aqueous solution, Reagent Grade, Packaging=HDPE Bottle, Size=100 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRV0875-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphtec CELITE-50</td>
			<td>Graphtec</td>
			<td>CE LITE-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15-630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Purity Silicone Rubber .010&#34; Thick, 6&#34; X 8&#34; Sheet, 55A Durometer</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>87315K62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Umbilical Vein Endothelial cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C0035C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen&#160;Trypan Blue Stain (0.4%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A4154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser cutter</td>
			<td>Full Spectrum</td>
			<td>20x12 H-series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidics Syringe pump</td>
			<td>New Era Syringe Pumps</td>
			<td>NE-1002X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microman E Single Channel Pipettor, Gilson, Model M1000E</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FD10006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Probes Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutragen Bovine Atelo Collagen</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5010-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pbs (10x), pH 7.4</td>
			<td>VWR</td>
			<td>70011044.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010049.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), with Triton X-100</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J63521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replacement carrier sheet for graphtec craft ROBO CC330L-20</td>
			<td>USCUTTER</td>
			<td>GRPCARSHTN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restek Norm-Ject Plastic Syringe 1 mL Luer Slip</td>
			<td>Restek</td>
			<td>22766.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>University wafer</td>
			<td>452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide, ACS, Packaging=Poly Bottle, Size=500 g</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9292-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>VWR</td>
			<td>102092-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#160;Pierce 20x PBS Tween 20</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28352.00</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microengineering 3d collagen hydrogels with long-range fiber alignment

Las fibras alineadas de colágeno I (COL1) guían la motilidad de las células tumorales, influyen en la morfología de las células endoteliales, controlan la diferenciación de las células madre y son un sello distintivo de los tejidos cardíacos y musculoesqueléticos. Para estudiar la respuesta celular a microambientes alineados in vitro, se han desarrollado varios protocolos para generar matrices COL1 con alineación de fibra definida, incluidos métodos magnéticos, mecánicos, basados en células y microfluídicos. De estos, los enfoques microfluídicos ofrecen capacidades avanzadas, como un control preciso sobre los flujos de fluidos y el microambiente celular. Sin embargo, los enfoques microfluídicos para generar matrices COL1 alineadas para plataformas avanzadas de cultivo in vitro se han limitado a "esteras" delgadas (<40 μm de espesor) de fibras COL1 que se extienden a distancias inferiores a 500 μm y no son propicias para aplicaciones de cultivo celular 3D. Aquí, presentamos un protocolo para fabricar matrices 3D COL1 (130-250 μm de espesor) con regiones de escala milimétrica de alineación de fibra definida en un dispositivo microfluídico. Esta plataforma proporciona capacidades avanzadas de cultivo celular para modelar microambientes de tejidos estructurados al proporcionar acceso directo a la matriz de microingeniería para el cultivo celular.

Cuando una solución COL1 autoensamblable fluye a través de un canal con área de sección transversal decreciente, la velocidad de flujo (v x) de la solución COL1 aumenta localmente en una magnitud, ∂v x, a lo largo de la longitud de la constricción entre los dos segmentos (∂x), lo que resulta en una velocidad de deformación extensional (ε̇) donde ε̇ = ∂v x / ∂x. La velocidad de deformación extensional se puede calcular a partir de la velocidad del fluido, que se mide ut...

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Microengineering 3D Collagen Hydrogels with Long-Range Fiber Alignment

Este protocolo demuestra el uso de un canal microfluídico con geometría cambiante a lo largo de la dirección del flujo de fluido para generar tensión extensional (estiramiento) para alinear fibras en un hidrogel de colágeno 3D (<250 μm de espesor). La alineación resultante se extiende a lo largo de varios milímetros y está influenciada por la velocidad de deformación extensional.

Microingeniería de hidrogeles de colágeno 3D con alineación de fibras de largo alcance

Aligned collagen I (COL1) fibers guide tumor cell motility, influence endothelial cell morphology, control stem cell differentiation, and are a hallmark ...

Este método nos permite diseñar hidrogeles de colágeno 3D con niveles controlados de alineación de fibras para modelar entornos que se encuentran en tejidos sanos y enfermos en el cuerpo. Esta técnica proporciona un enfoque microfluídico simple para diseñar hidrogeles de colágeno alineados, introducir células y cuantificar cómo se comportan las células en entornos 3D definidos topográficamente. Demostrando el procedimiento estarán Neil Joshi, Mehran Mansouri, Ann Byerly y Justin Vidas para mi laboratorio.Para comenzar, monte una lámina PDMS de 250 micrómetros de espesor en un portador de plástico y corte con una navaja el diseño microfluídico con un cortador artesanal a una profundidad de cuchilla de 0,5 milímetros, velocidad de un centímetro por segundo y alta fuerza. Usando un baño ultrasónico, limpie los recortes del canal microfluídico durante cinco minutos. Enjuague los canales sonicados en agua desionizada y séquelos en una placa caliente a 100 grados centígrados durante cinco minutos.Guarde los canales en una placa de Petri limpia y cubierta hasta que los use. Para fabricar la capa de cobertura de PDMS y funcionalizar la superficie para futuras modificaciones, prepare una solución de trietoxisilano de aminopropilo al 2% en un vaso de precipitados de vidrio agregando un mililitro de trietoxisilano de aminopropilo a 49 mililitros de acetona. A continuación, diluya una solución de glutaraldehído al 25% al 5% en agua desionizada.Haga dos mililitros de solución por cada cubreobjetos de 24 milímetros por 50 milímetros. Limpie los resbalones de la cubierta en un sonicador de baño durante cinco minutos usando IPA. Enjuague el IPA de los cubreobjetos con agua desionizada.Una película lisa de agua en el cubreobjetos indica que el IPA está bien enjuagado. Seque los deslizamientos de la cubierta en una placa caliente durante cinco minutos a 100 grados centígrados. Coloque los deslizamientos de la cubierta seca en placas de Petri limpias, asegurándose de que no se superpongan.Usando una varita de descarga de corona, exponga los resbalones de cubierta a una descarga de corona durante un minuto cada uno. Retire los cubreobjetos dentro de los cinco minutos posteriores a la exposición a la corona y sumerja cada resbalón de cubierta en la solución de aminopropiltrietoxisilano durante 10 segundos, asegurándose de que el cubreobjetos esté sumergido Luego, retire los cubreobjetos de la solución de aminopropil trietoxisilano, sumérjalos en acetona durante 10 segundos y séquelos con aire comprimido. Coloque el deslizamiento de la cubierta seca de nuevo en la placa de Petri, con el lado tratado hacia arriba.Pipetear un mililitro de solución de glutaraldehído sobre la superficie de cada cubreobjetos. Cubra la mayor superficie posible sin permitir que la solución se derrame sobre el borde del cubreobjetos. Deje que los deslizamientos de la cubierta reposen en contacto con la solución durante 30 minutos y luego enjuague con agua desionizada durante 20 segundos.Seque los cubreobjetos con aire comprimido y vuelva a colocarlos en las placas de Petri, el lado tratado con plasma hacia arriba Para cortar con láser la base magnética modular, corte los diseños de la capa de PMMA utilizando los ajustes de láser apropiados, como el número de pasadas y la potencia. Los ajustes del láser deben ajustarse para que los imanes puedan colocarse a presión en la capa de PMMA. Lave la pieza cortada con láser con agua y jabón para eliminar los residuos del proceso de corte por láser.No utilice disolventes, ya que pueden propagar microfisuras en los bordes cortados con láser. Para ensamblar la plataforma, empuje los imanes a mano en la base cortada con láser. El grosor de los imanes debe ser menor que el grosor de la base de PMMA para garantizar que los imanes estén al ras de la superficie de la base.Despegue el respaldo del adhesivo sensible a la presión, o lámina de PSA, y fije la base a un cubreobjetos tratado con glutaraldehído con el lado funcionalizado hacia arriba. Coloque suavemente el recorte del canal PDMS en la cavidad definida por el marco. Presione hacia abajo con pinzas de punta ancha para eliminar las burbujas de aire y garantizar el contacto conformado.Coloque la albúmina sérica bovina o la cubierta del canal tratada con BSA en la parte superior del recorte del canal con el lado de BSA hacia abajo. Asegúrese de que los puertos de entrada y salida del fluido estén alineados con el canal. El dispositivo está listo para la inyección de colágeno I.Coloque una bomba de jeringa, una jeringa estéril refrigerada, una solución de colágeno I neutralizado refrigerado y una aguja luer lock estéril de calibre 20 grados de ángulo de 90 grados en un gabinete de bioseguridad. Cargue la solución de colágeno I en la jeringa, evitando burbujas. Conecte la punta de la aguja a la jeringa, cargue la jeringa en la bomba de la jeringa, con la aguja hacia abajo, y prepare la aguja con la solución de colágeno I.Ajuste la bomba de jeringa al caudal requerido entre 50 y 2, 000 microlitros por minuto. Coloque los canales PDMS preparados en un conector de laboratorio y nivele con la aguja. Inserte la aguja en el puerto de entrada del canal PDMS.Inyecte el canal hasta que se acumule una gota de 30 microlitros de colágeno I en el lado de salida. Baje el gato de laboratorio y separe suavemente la aguja del canal recién llenado. Repita hasta que todos los canales se hayan llenado con la solución de colágeno I.Cargue los canales llenos en las placas de Petri junto con una toallita limpia y sin pelusa saturada con agua desionizada para evitar la deshidratación del gel de colágeno I recién formado. Cubra la placa de Petri y coloque los canales cargados en la incubadora durante dos horas antes del paso de despegado. Para el despegado y el equilibrio de los medios, comience por levantar la cubierta PDMS con pinzas para exponer el gel de colágeno I polimerizado.Agregue 650 microlitros de medios de crecimiento endotelial al pozo. Alternativamente, conecte otro módulo para introducir una capa de colágeno adicional o proporcionar capacidades de perfusión de medios. Deje los dispositivos en la incubadora durante un mínimo de cuatro horas para equilibrar el gel y el medio.Reemplace el medio antes de sembrar con celdas. La funcionalización del deslizamiento de la cubierta de vidrio permitió el despegue del canal y la funcionalización de la cubierta PDMS con BSA evitaron la fijación de colágeno I. La alineación de la fibra de colágeno I no se vio afectada después de levantar la cubierta.Las imágenes de los HUVEC cultivados en el segmento alineado de la matriz mostraron una mayor alineación de la fibra de actina en comparación con los HUVEC en el segmento con fibras aleatorias. Nuestro enfoque nos permite modelar el microambiente tumoral y cuantificar cómo responden los diferentes tipos de células. También podemos introducir canales de flujo para apoyar experimentos a largo plazo.

Research

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