Name: agarose fluid gels formed by shear processing during gelation for suspended 3d bioprinting
Uploaded: 2023-05-26T14:40:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Agarose Fluid Gels Formed by Shear Processing During Gelation for Suspended 3D Bioprinting at JoVE.com

המחברים רוצים להודות ל-EPSRC (EP/L016346/1), MRC ול-Doctoral Training Alliance Biosciences for Health על המימון והתמיכה בעבודה זו.

הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים, הריאגנטים, הציוד והתוכנות המשמשים בפרוטוקול זה.
1. הכנת מיטת ההשעיה של ג'ל נוזלי
<ol><li>הכינו 1,000 מ"ל של אגרוז מפוזר (0.5% w/v) על ידי הוספת 5 גרם אבקת אגרוז ל-1,000 מ"ל מים אולטרה-טהורים (סוג 1, >18 mΩ·cm-1) בבקבוק זכוכית של 2,000 מ"ל.</li>
	<li>הוסיפו מוט בוחש מגנטי בקוטר 70 מ"מ לתערובת המימית והדקו את פקק הבקבוק על ידי הידוק מלא ולאחר מכן שחרור ברבע סיבוב.</li>
	<li>ממיסים ומעקרים את התערובת על ידי הכנסת בקבוק הזכוכית לסלסלת האוטוקלב, סגירת המכסה והפעלת מחזור במשך 15 דקות בטמפרטורה של 121°C ו-1 Bar. הערה: פרוטוקול זה משמש תמיד לפתרונות autoclaving בשלבים נוספים.</li>
	<li>הוציאו את הבקבוק מהאוטוקלאבה לאחר שהאוטוקלאבה התקרר ל-80°C והניחו אותו על מערבל מגנטי (לא מחומם), כאשר הערבוב מכוון ל-800 סל"ד. אזהרה: הבקבוק והנוזל נשארים חמים.</li>
	<li>מצננים את הסול בתנאי סביבה, תוך שמירה על ערבוב מתמיד, עד שהטמפרטורה נמוכה מג'ל T (נקודתהג'ל ), 32°C.</li>
	<li>מוציאים את הבקבוק מהמערבל ומאחסנים אותו ב-4°C. הערה: ניתן לאחסן את ג'ל הנוזלים עד לצורך.</li>
</ol>2. הכנת ביודיו
<ol><li>הכינו ביו-דיו על בסיס גלן באמצעות סול של 1% (w/w) של מסטיק גלן דל אציל במים אולטרה-טהורים (Type 1, >18 mΩ·cm-1).<ol><li>שוקלים 0.5 גרם אבקת גלן לסירת שקילה.</li>
		<li>הוסף 49.5 גרם של מים טהורים במיוחד לתוך בקבוק זכוכית 100 מ"ל, יחד עם מערבל מגנטי.</li>
		<li>מקפלים לשניים את סירת השקילה המכילה כוח גלן ומוסיפים את האבקה למים באיטיות, תוך ערבוב מתמיד.</li>
		<li>ממיסים ומעקרים את הסול באמצעות אוטוקלאבה ומאפשרים לה להתקרר ל -20 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>יש לאחסן את הדיו הביולוגי בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש חדש.</li>
	</ol></li>
	<li>הכינו דיו ביולוגי מעורבב פקטין-קולגן במים טהורים במיוחד (סוג 1, >18 mΩ·cm-1).<ol><li>הכינו מלאי של 5% (w/v) תמיסות פקטין דלות מתוקסי על ידי שקילה של 2.5 גרם אבקת פקטין לתוך סירת שקילה.</li>
		<li>הוסיפו 50 מ"ל מים טהורים במיוחד לבקבוק זכוכית של 100 מ"ל, יחד עם מערבל מגנטי.</li>
		<li>מקפלים את סירת השקילה המכילה כוח פקטין לשניים ומוסיפים את האבקה למים באיטיות, תוך ערבוב מתמיד.</li>
		<li>Autoclave תערובת מימית ומגניב ל 20 ° C.</li>
		<li>הכינו תערובות פקטין-קולגן ביחס 1:1 ו-2:1 על-ידי הוספת 3 מ"ל של תמיסת הפקטין ל-3 מ"ל של תמיסת קולגן, או על-ידי הוספת 4 מ"ל של תמיסת פקטין ל-2 מ"ל של תמיסת קולגן, בהתאמה. מערבבים בעדינות את התערובות בעזרת פיפטה, על ידי משיכת התערובת וניפוקה 10x. הערה: מומלץ לבצע הליך זה באמצעות חומרים קרים על קרח כדי למנוע ג'לציה מוקדמת של הקולגן. ניתן להשיג קירור מקדים של פקטין וקולגן על-ידי אחסון בטמפרטורה של 4°C לפני הערבוב.</li>
		<li>יש לאחסן ב-4°C עד לשימוש חדש.</li>
	</ol></li>
	<li>הכינו דיו ביולוגי מעורבב אלגינט-קולגן במים טהורים במיוחד (סוג 1, >18 mΩ·cm-1).<ol><li>שקלו 2 גרם אבקת אלגינט לסירת שקילה.</li>
		<li>הוסיפו 50 מ"ל מים טהורים במיוחד לבקבוק זכוכית של 100 מ"ל, יחד עם מערבל מגנטי.</li>
		<li>מקפלים את סירת השקילה המכילה כוח אלגינט לשניים ומוסיפים את האבקה למים באיטיות, תוך ערבוב מתמיד.</li>
		<li>מחממים את הפיזור ל-60°C, תוך ערבוב מתמיד, עד שהאלגינט מומס במלואו (נוזל צלול, מעט חום), ואז מצננים ל-20°C.</li>
		<li>דללו את תמיסת האלגינט עם מדיום תרבית תאים כגון מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) על ידי הוספת 25 מ"ל של תמיסת אלגינט ל-25 מ"ל DMEM.</li>
		<li>הכינו תערובות אלגינט-קולגן (1:1) על ידי הוספת 3 מ"ל של תמיסת אלגינט/DMEM ל-3 מ"ל של תמיסת קולגן. ערבבו בעדינות את התערובות בעזרת פיפטה על ידי משיכת התערובת וניפוקה פי 10 ואחסנו בטמפרטורה של 4°C. הערה: מומלץ לבצע הליך זה באמצעות חומרים קרים על קרח כדי למנוע ג'לציה מוקדמת של הקולגן. ניתן להשיג קירור מקדים של פקטין וקולגן על-ידי אחסון בטמפרטורה של 4°C לפני הערבוב.</li>
	</ol></li>
</ol>3. אפיון ראולוגי של ביו-דיו
<ol><li>הפעל את הראומטר, הכנס גיאומטריות משוננות של 40 מ"מ ואפשר לעמוד במשך 30 דקות.</li>
	<li>אפס את גובה הרווח של הרומטר באמצעות פונקציית גובה הרווח אפס.</li>
	<li>הוסף ~ 2 מ"ל של דגימה בלוח התחתון והנמיך את הגיאומטריה העליונה כדי ליצור גובה רווח של 1 מ"מ.</li>
	<li>חתוך את הדגימה על ידי הסרת חומר עודף שנפלט מבין הלוחות. כדי לעשות זאת, השתמש בקצה שטוח ולא שוחק כדי למשוך נוזלים עודפים מן הרווח ולספוג עם נייר טישו. הערה: שלבים 3.2-3.4 חוזרים על עצמם כדי לשנות את הדגימה לפני כל אחד מהשלבים הבאים.</li>
	<li>בצע פרופילי ויסקומטרי כדי לקבוע את יכולת ההזרקה של הדיו הביולוגי.<ol><li>בחר בדיקת viscometry מתוך אפשרויות המשתמש .</li>
		<li>הזן את הפרמטרים לבדיקת רמפה מבוקרת קצב גזירה: 0.1 עד 500 s-1, עם זמן רמפה של דקה אחת.</li>
		<li>חזור על בדיקת כבש הוויסקומטריה על דגימות חדשות תחת בקרת מאמץ, תוך שימוש בלחצים העליונים והתחתונים שנקבעו מבדיקת הרמפה מבוקרת קצב הגזירה בשלב 3.5.2.</li>
	</ol></li>
	<li>בצע בדיקות דפורמציה קטנות כדי לקבוע את המאפיינים הג'לינג של הביודיו.<ol><li>בחר בדיקת תנודה מתוך אפשרויות המשתמש .</li>
		<li>יש להזין פרמטרים לבדיקת תדר אחת תחת מתח קבוע: תדר 1 הרץ, מתח 0.5% במשך שעה אחת, בזמן שהדיו ג'ל.</li>
	</ol></li>
	<li>בצע מדידות משרעת ותדירות באתרן על דגימות ג'ל.<ol><li>בחר בדיקת תנודה מאפשרויות המשתמש .</li>
		<li>בחר טאטוא משרעת והזן את הפרמטרים עבור בדיקת טאטוא משרעת מבוקרת מתח: 0.01 עד 500%, בתדר קבוע של 1 הרץ .</li>
		<li>טען מדגם חדש ובחר בדיקת תנודה מתוך אפשרויות המשתמש . לאחר מכן, בחר בדיקת תדר, ופרמטרים של תדר קלט בין 0.01 ל- 10 הרץ וזן שנמצא בתוך האזור הוויסקו-אלסטי הליניארי (LVR) של הספקטרום שנקבע מנתוני טאטוא המשרעת שהתקבלו בשלב 3.7.2 (בדרך כלל ערך בין 50% ל- 80% מה- LVR).</li>
	</ol></li>
</ol>4. תכנון והדפסה של מבנים תלת ממדיים באמצעות מדפסת ביולוגית תלת ממדית
<ol><li>הפעל תוכנת CAD כדי להתחיל את הדור של מודל CAD.<ol><li>בחר כלים | חומרים בתוכנת CAD להגדרת פרמטרי ההדפסה עבור הביו-דיו שנבחר.</li>
		<li>פרמטרי הדפסת קלט הרלוונטיים למדפסת שבשימוש; לדוגמה, עבור התגלית התלת-ממדית, הזן את קוטר חוט הלהט המשוער (~200-500 מיקרומטר עבור רוב הדיו הביולוגי) בכרטיסיה עובי כדי לקבוע את עובי Z של כל שכבה. הערה: דלמינציה של המבנה הסופי מעידה על צורך להגדיל את ערך העובי, בעוד אובדן רזולוציה מדגיש את הצורך להקטין את העובי.</li>
		<li>עצבו את המבנה הרצוי שכבה אחר שכבה באמצעות הכרטיסיות שכבות בתוכנה. קבץ את השכבות באמצעות הכרטיסיה 'קבוצה' והקצה כל שכבה לרמה במישור Z באמצעות הכרטיסיה ' רמה' .<ol><li>לדוגמה, כדי ליצור מבנה סריג (באמצעות ביו-דיו מעורבב אלגינט-קולגן שהוכן בשלב 2.3), צור שכבה אחת עם החוטים לאורך ציר x ושכבה שנייה עם החוטים לאורך ציר y. הקצה את שניהם לרמה נפרדת.</li>
		</ol></li>
		<li>תחת הכרטיסיה קבוצה , קבע את גובה הבנייה על-ידי בחירת מספר היחידות החוזרות במבנה.</li>
		<li>לחץ על הכלי צור ליצירת קוד G לעיצוב ולהצגת עיבוד תלת-ממדי של המבנה.</li>
	</ol></li>
	<li>סגור את BioCAD והפעל את תוכנת ממשק אדם-מכונה (HMI) 3D Discovery כדי להתחיל בתהליך ההדפסה.<ol><li>הרכיבו את ראש ההדפסה בהתאם להוראות היצרן. הרכיבו את המיקרו-שסתום לראש ההדפסה והבריגו בפיית האקסטרוזיה שנבחרה.</li>
		<li>לחץ על הפונקציה מדידת אורך מחט כדי לכייל את ראש ההדפסה.</li>
		<li>טען כלי תרבית (למשל, לוח בעל 6 בארות) על פלטפורמת ההדפסה.</li>
		<li>Aliquot את הדיו הביולוגי לתוך מחסנית ההדפסה והברג לתוך ראש ההדפסה מעל שסתום המיקרו.</li>
		<li>חבר את ראש ההדפסה המורכב למערכת הלחץ הפנאומטי ובחר ראש הדפסה ב- HMI להפעלה .</li>
		<li>לחץ על בדוק לחץ כדי לאפשר כוונון של לחץ האקסטרוזיה.</li>
		<li>לאחר שנבחר לחץ מתאים (~ 30-120 kPa בהתאם לרזולוציה הרצויה), פתח את קוד G שנוצר בעבר ולחץ על הפעל כדי להתחיל בתהליך ההדפסה.</li>
	</ol></li>
</ol>5. הכנת אנלוגים לעור
<ol><li>תרבית פיברובלסטים עוריים אנושיים (HDFs) ותאי גזע שמקורם בשומן (ADSCs) ב- DMEM בתוספת סרום בקר עוברי (FBS) (10%), חיץ HEPES (2.5%) ופניצילין/סטרפטומיצין (1%) בצלוחיות T75 עד למפגש של 90%. תרבית קרטינוציטים אפידרמיס אנושיים (HEKs) במצע גידול קרטינוציטים (KGM) עד למפגש של 70%-80%. שמור את כל התאים בתנאים של 37 ° C, 5% CO2, ו 95% אוויר באינקובטור במהלך התרבית.</li>
	<li>להכנת HDFs ו- ADSCs עבור ביודיו עורי ושומניים, לשטוף את התאים על ידי pipeting בעדינות 3 מ"ל של מלוחים חוצץ פוספט (PBS) לתוך צלוחיות, להטות את הבקבוק כדי לערבל את PBS מעל התאים, ולשאוף, בזהירות לא להפריע את התאים המחוברים.<ol><li>כדי להרים את התאים, פיפטה 3 מ"ל של אנזים דיסוציאציה של תאים 1x לתוך הבקבוק כדי לכסות את התאים ומניחים את הבקבוק באינקובטור במשך 3 דקות, מקישים בחוזקה את הבקבוק על כף היד כדי לעקור את התאים. נטרול פעולת האנזים באמצעות 6 מ"ל DMEM מלא. הערה: יש לדגור למשך 2 דקות נוספות אם התאים נשארים מחוברים לאחר הקשה.</li>
		<li>להכנת ביודיו עורי ושומניים, פיפטה את מתלי התא לתוך צינורות נפרדים 15 מ"ל ולקחת 10 μL מכל אחד לספירת תאים באמצעות המוציטומטר. צנטריפוגה את מתלי התאים הנותרים ב 300 × גרם במשך 5 דקות כדי לגלול את התאים.</li>
		<li>יש לשאוף את הסופרנטנט, להיזהר שלא להפריע לכדורית, להוסיף את תמיסת הפולימר המתאימה (שהוכנה בשלב 2.2), ולערבב באמצעות גירוי עדין על ידי פיפטינג בצפיפויות הבאות:<ol><li>עבור שכבת השומן, פיפטה 5 × 105 ADSCs mL-1 לכל 1:1 קולגן לתערובת פקטין.</li>
			<li>עבור שכבת הפפילרי, פיפטה 3 × 106 HDFs mL-1 לכל 2:1 קולגן לתערובת פקטין.</li>
			<li>עבור שכבת הרשתית, פיפטה 1.5 × 106 HDFs mL-1 לכל 2:1 קולגן לתערובת פקטין.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>כדי להדפיס, טען כל דיו ביולוגי למחסנית נפרדת והדפס את המבנה בג'ל הנוזל התומך בצלחת פטרי מזכוכית בהתאם להוראות בסעיף 4.<ol><li>לאחר השלמת ההדפסה, הזריקו 2 מ"ל של 200 mM CaCl 2∙2H2 O סביב המבנה ו-3 מ"ל של מדיה אדיפוגנית (DMEM מלא בתוספת 500 מיקרומטר איזובוטיל-מתילקסנטין [IBMX], 50 מיקרומטר אינדומתצין ו-1 מיקרומטר דקסמתזון) לתוך ג'ל הנוזל באמצעות מזרק ומחט. מניחים באינקובטור למשך הלילה.</li>
		<li>למחרת, להסיר את המבנה מן האמבטיה תמיכה באמצעות מרית, לשטוף בעדינות PBS, ותרבית במשך 14 ימים במדיום אדיפוגני בצלחת 6 בארות.</li>
		<li>לאחר 14 יום, להסיר מספיק תווך כדי ליצור ממשק אוויר-נוזל על פני השטח של המבנה זרע 2 × 106 keratinocytes על גבי המבנה כדי ליצור שכבת אפידרמיס.</li>
		<li>תרבית נוספת במשך שבוע לפני הניתוח.</li>
	</ol></li>
</ol>6. הכנת מודל עורק התרדמה
<ol><li>טען את תמיסת הביודיו gellan gum (כפי שהוכנה בשלב 2.1) למחסנית מדפסת.</li>
	<li>הדפס את דגם עורק התרדמה בתוך צלחת פטרי המכילה את חומר התמיכה בג'ל נוזלי בהתאם להוראות ההדפסה בסעיף 4.</li>
	<li>לאחר השלמת ההדפסה, הזריקו 2 מ"ל של 200 mM CaCl 2∙2H2 O סביב המבנה באמצעותמזרק ומחט.</li>
	<li>לאחר מינימום של 3 שעות, להסיר את המבנה מן האמבטיה תמיכה באמצעות מרית לשטוף בעדינות PBS.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lee, K. Y., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+for+tissue+engineering.">Hydrogels for tissue engineering.</a> Chemical Reviews. 101 (7), 1869-1880 (2001).</li><li>Caliari, S. R., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+hydrogels+for+cell+culture.">A practical guide to hydrogels for cell culture.</a> Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).</li><li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics+for+3D+cell+culture.">Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture.</a> Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).</li><li>Drury, J. L., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+for+tissue+engineering:+scaffold+design+variables+and+applications.">Hydrogels for tissue engineering: scaffold design variables and applications.</a> Biomaterials. 24 (24), 4337-4351 (2003).</li><li>Iordachescu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+model+for+the+development+of+mature+bone+containing+an+osteocyte+network.">An in vitro model for the development of mature bone containing an osteocyte network.</a> Advanced Biosystems. 2 (2), 1700156 (2018).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel+cryopreservation+system:+an+effective+method+for+cell+storage.">Hydrogel cryopreservation system: an effective method for cell storage.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (11), 3330 (2018).</li><li>McCormack, A., Highley, C. B., Leslie, N. R., Melchels, F. P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printing+in+suspension+baths:+keeping+the+promises+of+bioprinting+afloat.">3D printing in suspension baths: keeping the promises of bioprinting afloat.</a> Trends in Biotechnology. 38 (6), 584-593 (2020).</li><li>Cheng, W., Zhang, J., Liu, J., Yu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granular+hydrogels+for+3D+bioprinting+applications.">Granular hydrogels for 3D bioprinting applications.</a> View. 1 (3), 20200060 (2020).</li><li>Lieben, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+3D+printing+of+human+tissues+is+taking+shape.">The future of 3D printing of human tissues is taking shape.</a> Nature Reviews Rheumatology. 12 (4), 191 (2016).</li><li>Bhattacharjee, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Writing+in+the+granular+gel+medium.">Writing in the granular gel medium.</a> Science Advances. 1 (8), 1500655 (2015).</li><li>Hinton, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+printing+of+complex+biological+structures+by+freeform+reversible+embedding+of+suspended+hydrogels.">Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels.</a> Science Advances. 1 (9), 1500758 (2015).</li><li>Zarrintaj, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose-based+biomaterials+for+tissue+engineering.">Agarose-based biomaterials for tissue engineering.</a> Carbohydrate Polymers. 187, 66-84 (2018).</li><li>te Nijenhuis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Thermoreversible Networks: Viscoelastic Properties and Structure of Gels. , 194-202 (1997).</li><li>Norton, I. T., Jarvis, D. A., Foster, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+model+for+the+formation+and+properties+of+fluid+gels.">A molecular model for the formation and properties of fluid gels.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 26 (4), 255-261 (1999).</li><li>Fern&#225;ndez Farr&#233;s, I., Moakes, R. J. A., Norton, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+biopolymer+fluid+gels:+A+microstructural+approach.">Designing biopolymer fluid gels: A microstructural approach.</a> Food Hydrocolloids. 42, 362-372 (2014).</li><li>Cooke, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structuring+of+hydrogels+across+multiple+length+scales+for+biomedical+applications.">Structuring of hydrogels across multiple length scales for biomedical applications.</a> Advanced Materials. 30 (14), 1705013 (2018).</li><li>Foster, N. C., Allen, P., El Haj, A. J., Grover, L. M., Moakes, R. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+therapeutic+responses+via+engineering+microenvironments+with+a+novel+synthetic+fluid+gel.">Tailoring therapeutic responses via engineering microenvironments with a novel synthetic fluid gel.</a> Advanced Healthcare Materials. 10 (16), 2100622 (2021).</li><li>Ellis, A. L., Norton, A. B., Mills, T. B., Norton, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilisation+of+foams+by+agar+gel+particles.">Stabilisation of foams by agar gel particles.</a> Food Hydrocolloids. 73, 222-228 (2017).</li><li>Ghebremedhin, M., Seiffert, S., Vilgis, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physics+of+agarose+fluid+gels:+Rheological+properties+and+microstructure.">Physics of agarose fluid gels: Rheological properties and microstructure.</a> Current Research in Food Science. 4, 436-448 (2021).</li><li>Garrec, D. A., Norton, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+fluid+gel+formation+and+properties.">Understanding fluid gel formation and properties.</a> Journal of Food Engineering. 112 (3), 175-182 (2012).</li><li>Garrec, D. A., Guthrie, B., Norton, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kappa+carrageenan+fluid+gel+material+properties.+Part+1:+Rheology.">Kappa carrageenan fluid gel material properties. Part 1: Rheology.</a> Food Hydrocolloids. 33 (1), 151-159 (2013).</li><li>Adams, S., Frith, W. J., Stokes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+particle+modulus+on+the+rheological+properties+of+agar+microgel+suspensions.">Influence of particle modulus on the rheological properties of agar microgel suspensions.</a> Journal of Rheology. 48 (6), 1195-1213 (2004).</li><li>Senior, J. J., Cooke, M. E., Grover, L. M., Smith, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+complex+hydrogel+structures+using+suspended+layer+additive+manufacturing+(SLAM).">Fabrication of complex hydrogel structures using suspended layer additive manufacturing (SLAM).</a> Advanced Functional Materials. 29 (49), 1904845 (2019).</li><li>Moakes, R. J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+suspended+layer+additive+manufacturing+approach+to+the+bioprinting+of+tri-layered+skin+equivalents.">A suspended layer additive manufacturing approach to the bioprinting of tri-layered skin equivalents.</a> APL Bioengineering. 5 (4), 046103 (2021).</li><li>Moxon, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suspended+manufacture+of+biological+structures.">Suspended manufacture of biological structures.</a> Advanced Materials. 29 (13), 1605594 (2017).</li><li>Noor, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Printing+of+personalized+thick+and+perfusable+cardiac+patches+and+hearts.">3D Printing of personalized thick and perfusable cardiac patches and hearts.</a> Advanced Science. 6 (11), 1900344 (2019).</li><li>Compaan, A. M., Song, K., Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gellan+fluid+gel+as+a+versatile+support+bath+material+for+fluid+extrusion+bioprinting.">Gellan fluid gel as a versatile support bath material for fluid extrusion bioprinting.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 11 (6), 5714-5726 (2019).</li><li>Moxon, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blended+alginate/collagen+hydrogels+promote+neurogenesis+and+neuronal+maturation.">Blended alginate/collagen hydrogels promote neurogenesis and neuronal maturation.</a> Materials Science and Engineering: C. 104, 109904 (2019).</li><li>H&#246;lzl, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioink+properties+before,+during+and+after+3D+bioprinting.">Bioink properties before, during and after 3D bioprinting.</a> Biofabrication. 8 (3), 032002 (2016).</li><li>Chimene, D., Lennox, K. K., Kaunas, R. R., Gaharwar, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+bioinks+for+3D+printing:+a+materials+science+perspective.">Advanced bioinks for 3D printing: a materials science perspective.</a> Annals of Biomedical Engineering. 44 (6), 2090-2102 (2016).</li><li>Schwab, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printability+and+shape+fidelity+of+bioinks+in+3D+bioprinting.">Printability and shape fidelity of bioinks in 3D bioprinting.</a> Chemical Reviews. 120 (19), 11028-11055 (2020).</li><li>Rutz, A. L., Lewis, P. L., Shah, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+next-generation+bioinks:+Tuning+material+properties+pre-+and+post-printing+to+optimize+cell+viability.">Toward next-generation bioinks: Tuning material properties pre- and post-printing to optimize cell viability.</a> MRS Bulletin. 42 (8), 563-570 (2017).</li><li>Mosadegh, B., Xiong, G., Dunham, S., Min, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+progress+in+3D+printing+for+cardiovascular+tissue+engineering.">Current progress in 3D printing for cardiovascular tissue engineering.</a> Biomedical Materials. 10 (3), 034002 (2015).</li><li>Zhou, K., Sun, Y., Yang, J., Mao, H., Gu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+for+3D+embedded+bioprinting:+a+focused+review+on+bioinks+and+support+baths.">Hydrogels for 3D embedded bioprinting: a focused review on bioinks and support baths.</a> Journal of Materials Chemistry B. 10 (12), 1897-1907 (2022).</li><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+bioprinting+of+collagen+to+rebuild+components+of+the+human+heart.">3D bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart.</a> Science. 365 (6452), 482-487 (2019).</li><li>Kyle, S., Jessop, Z. M., Al-Sabah, A., Whitaker, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printability'+of+candidate+biomaterials+for+extrusion+based+3D+printing:+state-of-the-art.">Printability' of candidate biomaterials for extrusion based 3D printing: state-of-the-art.</a> Advanced Healthcare Materials. 6 (16), 1700264 (2017).</li><li>Hinton, T. J., Lee, A., Feinberg, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+bioprinting+from+the+micrometer+to+millimeter+length+scales:+Size+does+matter.">3D bioprinting from the micrometer to millimeter length scales: Size does matter.</a> Current Opinion in Biomedical Engineering. 1, 31-37 (2017).</li><li>Seoane-Via&#241;o, I., Trenfield, S. J., Basit, A. W., Goyanes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+3D+printed+pharmaceuticals:+From+hype+to+real-world+clinical+applications.">Translating 3D printed pharmaceuticals: From hype to real-world clinical applications.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 174, 553-575 (2021).</li><li>Jovic, T. H., Combellack, E. J., Jessop, Z. M., Whitaker, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+bioprinting+and+the+future+of+surgery.">3D bioprinting and the future of surgery.</a> Frontiers in Surgery. 7, 609836 (2020).</li></ol>

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

התחשבות בבחירת החומרים המשמשים למיטה התומכת בשלב הפיתוח נדרשו מאפיינים שונים למיטה התומכת. מאפיינים אלה כללו: i) שמירה על מבנה מספיק כדי להשעות את החומר extruded; ii) יכולת דילול גזירה כדי לאפשר לראש ההדפסה לנוע בחופשיות דרך החומר התומך; iii) ארגון מחדש מהיר (תכונות ריפוי עצמי), יצירת תמיכה סביב bioink שהושקע; 4) יציב תרמית הן בטמפרטורת החדר והן בטמפרטורות פיזיולוגיות; v) חומר נייטרלי (כלומר, לא טעון) שהוא ביואינרטי יחסית, על פני טווח של pH ואלקטרוליטים (מינים יוניים וריכוזים), המונע אינטראקציות עם תאים ודיו ביולוגי טעון; vi) לא רעיל; ו-vii) רצוי ממקור שאינו מן החי.
למרות שישנם חומרים ביופולימרים רבים השומרים על כמה מהמאפיינים האינהרנטיים הללו, עם יכולת לבצע ייצור תוספים תלת ממדיים מושהה מבלי להתאים לכל המאפיינים הללו 11,26,27, הכוונה כאן הייתה לייצר מצע תומך שיתגבר על בעיות מעשיות מסוימות הקשורות לחומרים תומכים אחרים. בשל התכונות הכימיות של agarose, ובפרט, כאשר מנוסח כמו ג'ל נוזל חלקיקי, כל המאפיינים האלה ניתן להשיג. זה איפשר מיטה תומכת שניתן להשתמש בה במגוון רחב של דיו ביולוגי23,24,25,28. ואכן, אופיו הביואינרטי של החומר סיפק את הפוטנציאל לשמור על המבנה המודפס באתרו ברחבי התרבית, ואיפשר לוחות זמנים מספיקים לביודיו רבים ושונים להתפתח במלואם, ללא שינויים בביולוגיה. יתר על כן, האופי החלקיקי והדליל איפשר הסרה קלה מהמבנה המודפס הסופי, בעוד שהמקור הלא רעיל, שאינו מן החי, מאפשר פוטנציאל לתרגום מהיר לכיוון המרפאה, תוך התגברות על חסמים הנוגעים לדרישות אתיות ורגולטוריות.
שיקולים בבחירת החומרים לביו-דיו בהדפסה ביולוגית בשחול ישיר, דיו ביולוגי מופקד על מצע הדפסה דו-ממדית. זה מועיל כי פתרונות ביו-דיו מונומר יש התנהגות גזירה-דילול; עם זאת, כדי לייצר מבנים בעלי נאמנות גבוהה עם ממדים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית, הם חייבים להיות בעלי תיקסוטרופיה נמוכה ולהתאושש לצמיגות גבוהה מספיק, כך שהם יוצרים חוטים מוצקים עם תצהיר 29,30,31. עם צמיגות מוגברת, הלחץ הדרוש לאקסטרוזיה הוא הרבה יותר גבוה, לעתים קרובות משפיע לרעה על כדאיות התא העטוף31,32. הדפסה ביולוגית של מתלים מסירה מגבלה זו, מכיוון שהחומר המושחל נתמך על ידי אמבט ההשעיה לאורך כל הקרוסלינקינג. פיתוח זה מגדיל מאוד את מגוון פורמולציות הדיו הביולוגי שניתן להשתמש בהן. לדוגמה, עבודות אחרונות הראו את השימוש בתמיסות קולגן בריכוז נמוך מודפסות בגיאומטריות מורכבות ביותר המקבילות למבנה הפנימי של הלב33,34,35. ביישומים שהוזכרו בשיטה זו, הדפסה משובצת אפשרה לבחור דיו ביו-חומרי כך שישכפל בצורה הטובה ביותר את הסביבה הפיזיולוגית שלשמה הוא נועד, במקום את יכולתו להדפיס.
מגבלות בגודל המבנה לאורך ספרות הייצור הביולוגי, הוכח כי סוגים שונים של מדפסות ביולוגיות, המונעות על ידי טכנולוגיות ראש הדפסה חלופיות, עשויים להיות משולבים בטכניקות ייצור משובצות. הטכנולוגיה שהודגמה כאן אינה שונה, עם דוגמאות הכוללות מדפסת ביולוגית פנאומטית מבוססת מיקרו-אקסטרוזיה (INKREDIBLE), כפי שהודגם על ידי סניור ואחרים, ומדפסות ביולוגיות מבוססות שחול עם מיקרו-שסתומים הניתנים לשליטה (3D Discovery)23. למרות שזה הופך את הטכנולוגיה לנגישה למגוון משתמשים שאולי כבר יש בבעלותם מדפסת ביולוגית, מגבלות על הגודל הניתן להשגה של המבנה תלויות בסופו של דבר במפרט המדפסת הביולוגית המדוברת. בתחילה, המגבלה העיקרית על יצירת מבנים גדולים מוגדרת על ידי גודל מיטת הדפוס, גבולות מסלולי X, Y ו- Z, וגם גודל הכלי שבו ג'ל הנוזל התומך מכיל.
מגבלות ברזולוציה בעת ייצור מבנים מורכבים בגודל מיקרומטרי, הרזולוציה המתקבלת תלויה מאוד בדיוק של המדפסת (שליטה בגודל המדרגה, מידת השחול), בקוטר הפנימי של פיית ההדפסה ובמגוון פרמטרים הניתנים לכוונון של תוכנה, כולל מהירות הדפסה, לחץ הדפסה ומהירות זרימה36. בנוסף, נראה כי השליטה בגודל הטיפות היא קריטית כדי להקל על יצירת מבנים ברזולוציה גבוהה, כאשר התוצאות הטובות ביותר שנצפו במדפסות אקסטרוזיה עם מיקרו-שסתום הניתן לשליטה. בסופו של דבר, כאשר כל הפרמטרים ממוטבים, ניתן להשיג רזולוציות הדפסה כדי להתאים, או אפילו להיות פחות, מהקוטר הפנימי של חרירי האקסטרוזיה, עם חוט הלהט שהופקד בסדר גודל של מיקרומטר37. עם זאת, הדבר מסתמך על אופטימיזציה של כל פרמטרי ההדפסה שהוזכרו קודם לכן, והרזולוציה יכולה להיות מוגבלת במידה ניכרת על ידי מנגנון ההדפסה והדיוק. נראה כי שחול פנאומטי, למשל, אינו מאפשר רזולוציית הדפסה זהה לזו של אקסטרוזיה עם מיקרו-שסתום הניתן לשליטה. יש, אם כן, השלכת עלות פוטנציאלית להשגת רזולוציית ההדפסה המקסימלית, שכן מערכות כאלה כרוכות בהוצאה מוגברת משמעותית למשתמש.
תחזית עתידית ופוטנציאל כרגע, יש עניין רב סביב השימוש בתהליכי ייצור מושהים כדי לאפשר ייצור של מבנים רכים מורכבים המכילים תאים משובצים, וללא ספק יהיו התקדמות משמעותית בשנים הקרובות. התקדמות מתמשכת בשיפור רזולוציית ההדפסה ניתנת, אם כי נותר לראות עד כמה זה יהיה נחוץ, בהתחשב בכך שרוב המערכות הביולוגיות מסוגלות לארגן את עצמן מחדש ברמה המולקולרית. בעוד מוקד העניין בתקשורת הוא סביב השימוש ברקמות מודפסות בתלת-ממד כדי להחליף ישירות רקמות אנושיות לאחר פציעה או מחלה, כל הליך רפואי חזק המתאפשר על ידי תהליכים אלה נמצא במרחק של כמה שנים38,39. סביר יותר להניח שההשפעה של מערכות תרבית מורכבות אלה תהיה בסינון תרופות או אפילו תשמש ככלים, כדי לשפר את הבנתנו את התהליכים הביולוגיים38 . בפרט, ביולוגיה התפתחותית יכולה להפיק תועלת רבה כאן, כאשר שליטה מדויקת על שקיעת המולקולות המיוחדות תאפשר לחוקרים לחקור את תפקידן של מערכות רב-גורמי בתהליכי התפתחות רקמות.

הידרוג'לים הם חומרים מושלמים לשימוש כתומכים בצמיחת תאים1. בהתאם לחומר בו משתמשים, הם ג'ל באמצעות מנגנונים עדינים שאינם פוגעים בכדאיות התא 2,3. תכולת המים הגבוהה (בדרך כלל >90%) פירושה שחומרי מזון וחמצן יכולים להתפזר בקלות לתוך החומר ומוצרי פסולת של חילוף החומרים בתאים מתפזרים החוצה4. לפיכך, הוכח כי כדאיות התא נשמרת לתקופות העולות על שנה5, וכיום ישנן דוגמאות לשימוש בהידרוג'לים לאחסון או "השהיה" של תאים לשימוש טיפולי עתידי6. הם נמצאים בשימוש נרחב בהנדסת רקמות לייצור מבנים דמויי רקמות, אך השימוש בהם נוטה להיות מוגבל על ידי הקושי לשלוט הן במבנה והן בהרכב החומר. מבחינה היסטורית, חוזק ההידרוג'ל נמוך יחסית (ביחס לרקמות קשות רבות), בשל תכולת המים הגבוהה והנפחים הנמוכים שנכבשו על ידי המטריצה הפולימרית המרכיבה את המבנה. יתר על כן, מסלולים רבים לג'לציה (תרמית, יונוטרופית, פיברילוגנזה) מציעים קינטיקה איטית למדי, כלומר התכונות המכניות שלהם נוטות להתפתח בהתמדה עם הזמן. למעט רשתות חודרות, קשיחות מכנית נמוכה וזמני ריפוי איטיים גורמים לעתים קרובות לדיו ביולוגי שאינו מסוגל לעמוד בחופשיות על שיקוע, ונוטה "ליפול" ולאבד הגדרה כאשר הוא מושחל בתחילה.
בניסיון להתגבר על בעיה מרכזית זו, פותחו טכניקות הדפסה משובצות המספקות תמיכה במהלך ההדפסה, בעוד התכונות המכניות של המבנה מתפתחות 7,8. לאחר שהמיקרו-מבנה של הג'ל התפתח במלואו והתכונות המכניות מגיעות לאופטימליות, ניתן להסיר את מטריצת התמיכה, בדרך כלל באמצעות שטיפה עדינה או המסה של שלב התמיכה. העבודה הראשונית על גישה זו השתמשה בפיזור פלורוני צמיגי שבו התפזר השלב המשני9. לאחרונה, Bhattacharjee et al. השתמשו בג'לים בצורה של קרבופול מגורען כדי להדגים כי מערכי תאים יכולים להיות תלויים בג'לתומך 10. לאחר מכן, Hinton et al. דיווחו על שחול של חומרים מבוססי ג'ל המכילים תאים לתוך מצע תמיכה שהורכב מתרחיף מיקרוג'ל שנוצר מג'לטין גרגירי11. לאחר שחול של הידרוג'ל המכיל תאים וריפויו לאחר מכן, הג'לטין הוסר על ידי חימום עדין של אמבט התמיכה, המאפשר המסה של הג'לטין. למרבה הצער, תהליך זה עדיין מציג מספר מגבלות. לדוגמה, המבנה הכימי של ג'לטין בהשוואה לקולגן (כתוצאה מכך היותו צורה הידרוליזה של קולגן) הוא כזה שכימיקלים רבים לאורך עמוד השדרה שלו יכולים לתקשר עם ישויות ביולוגיות; לפיכך, מטריצת תמיכה שיורית עלולה להפריע לתהליכים ביולוגיים במורד הזרם. יתר על כן, מוצרים מן החי מהווים שימוש מגביל כאשר מסתכלים לעבר יכולת התרגום של טכנולוגיה. זה יוצר אתגרים אם החלק המיוצר מיועד לשימוש קליני, או אפילו אם הוא אמור לשמש כדי לענות על שאלות ביולוגיות בסיסיות, כאשר זיהום פני השטח הזה יכול לגרום לבעיה משמעותית.
לאחר מכן יצרנו תהליך מזוקק המאפשר ייצור מושהה של הידרוג'לים, בתוך מטריצה תומכת, שאין לה מטען בתנאים פיזיולוגיים והיא נוצרת מחומרים שאינם מן החי. למרות שניתן להשתמש בתהליך עם מגוון של תמיכות ביופולימריות, אגרוז מספק חומר שהוא אינרטי לאינטראקציות ביולוגיות מכיוון שהוא מבוסס סוכר וטעון באופן נייטרלי ב- pHפיזיולוגי 12,13. במקום לפצל ג'ל קיים, חומר התמיכה נוצר באמצעות יישום של גזירה במהלך gelation14,15,16. זה מייצר מטריצה של חלקיקים המציגים תכונות דמויות דנדרון על פני השטח שלהם והם מפוזרים במטריצה משנית של פולימר ungelled17,18. התוצאה היא חומר בעל תכונות חומר מעניינות 19,20,21,22 שיכול להידקק באופן דומה לג'לים גרגיריים שדווחו בעבר, אך נוטה לשחזר צמיגות מהר יותר כאשר מסירים את הגזירה 23. לאחר שהחומר נושא התא שהוחדר למטריצה התומכת הבשיל במלואו, ניתן להסיר את מטריצת התמיכה באמצעות תסיסה עדינה לפני הכנסתה לתרבית. הוכח כי ניתן להשתמש בתהליך זה כדי לייצר חומרים עם מבנים מורכבים ולשחזר את המבנים הביולוגיים של העור ואת האזור osteochondral23,24,25. נייר שיטות זה מתאר בפירוט כיצד לייצר את החומר התומך ומדגיש דיו ביולוגי מתאים המשמש במגוון מבנים מורכבים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D Discovery Bioprinter</td>
			<td>RegenHU</td>
			<td>BIOFACTORY</td>
			<td>Microvalve extrusion bioprinter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>9012-36-6</td>
			<td>Material used to create fluid gel support baths&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop autoclave</td>
			<td>Prestige Medical</td>
			<td>B8L75814</td>
			<td>Classic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Blue G</td>
			<td>Merck</td>
			<td>6104-58-1</td>
			<td>Dye used to stain structures&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>10035-04-8</td>
			<td>Used to reticulate printed structures&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>D4902-25MG</td>
			<td>Used in adipogenic media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Merck</td>
			<td>D6429</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duran&#160; bottle&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z305219</td>
			<td>glass bottle&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS XL Core Imaging System</td>
			<td>EVOS&#8482;</td>
			<td>AMEX1000</td>
			<td>Brightfield microscope with phase contrast</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10500-064</td>
			<td>Cell culture media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gellan gum</td>
			<td>Special Ingredients</td>
			<td>5060341112638</td>
			<td>Low Acyl Gellan gum used to make the bioink for the corotid artery model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H9897-10PAK</td>
			<td>Buffer for cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>I7378</td>
			<td>Used in adipogenic media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isobutyl-methylxanthine (IBMX)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>I7018-100MG</td>
			<td>Used in adipogenic media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte growth medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>00192060</td>
			<td>Used as media to culture keratinocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Methoxy Pectin</td>
			<td>CP Kelco</td>
			<td>LM-5CS</td>
			<td>Pectin used to make pectin/collagen blends</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td>Used to inhibit bacterial growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureCol EZ Gel solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>5074</td>
			<td>Collagen solution used to make alginate/collagen blends</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Alginate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>9005-38-3</td>
			<td>Alginate powder used to make alginate/collagen blends&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE select&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12563011</td>
			<td>cell dissociation enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Flasks</td>
			<td>StarLab</td>
			<td>CC7682-4175</td>
			<td>Used for culturing cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

agarose fluid gels formed by shear processing during gelation for suspended 3d bioprinting

השימוש במטריצות גרגיריות לתמיכה בחלקים בתהליך ההדפסה הביולוגית דווח לראשונה על ידי Bhattacharjee et al. בשנת 2015, ומאז פותחו מספר גישות להכנה ושימוש במיטות ג'ל תומכות בהדפסה ביולוגית תלת ממדית. מאמר זה מתאר תהליך לייצור תרחיפים מיקרוג'ל באמצעות אגרוז (הידוע בשם ג'ל נוזלי), שבו היווצרות חלקיקים נשלטת על ידי יישום של גזירה במהלך gelation. עיבוד כזה מייצר מיקרו-מבנים מוגדרים בקפידה, עם תכונות חומר עוקבות המקנות יתרונות ברורים כמו הטמעת מדיה מודפסת, הן מבחינה כימית והן מבחינה מכנית. אלה כוללים התנהגות כחומרים ויסקו-אלסטיים דמויי מוצק באפס גזירה, הגבלת דיפוזיה לטווח ארוך, והדגמת התנהגות הגזירה-דילול האופיינית של מערכות מלוקעות. 
עם זאת, על הסרת מתח גזירה, ג'ל נוזלי יש את היכולת לשחזר במהירות את התכונות האלסטיות שלהם. חוסר היסטרזה זה קשור ישירות למיקרו-מבנים המוגדרים שנרמזו קודם לכן; בגלל העיבוד, שרשראות פולימר תגובתיות, לא ג'ליות, בממשק החלקיקים, מאפשרות אינטראקציות בין חלקיקים - בדומה לאפקט סקוטש. התאוששות מהירה זו של תכונות אלסטיות מאפשרת הדפסה ביולוגית של חלקים ברזולוציה גבוהה מביו-חומרים בעלי צמיגות נמוכה, כאשר רפורמה מהירה של מצע התמיכה לוכדת את הביו-דיו באתרו ושומרת על צורתו. יתר על כן, יתרון של ג'ל נוזלי אגרוז הוא מעברי ג'לינג / התכה אסימטריים (טמפרטורת ג'לציה של ~ 30 ° C וטמפרטורת התכה של ~ 90 ° C). היסטרזה תרמית זו של אגרוז מאפשרת להדפיס ולגדל את החלק המודפס ביולוגית באתרו ללא המסת ג'ל הנוזל התומך. פרוטוקול זה מראה כיצד לייצר ג'לים נוזלי אגרוז ומדגים את השימוש בהם לתמיכה בייצור מגוון חלקי הידרוג'ל מורכבים בייצור תוספים בשכבה מרחפת (SLAM).

אלגינט ודיו קולגן Bioink מסוג I רזולוציית ההדפסה (שנרשמה כפונקציה של קוטר חוט הלהט) נצפתה כבלתי ניתנת להתאמה ישירה באמצעות שינויים בלחץ האקסטרוזיה (איור 1A-C). לחץ שחול ורזולוציית הדפסה היו קשורים ישירות לקוטר הנימה הקטן ביותר שנוצר באמצעות הדפסה בלחץ אקסטרוזיה של 30 kPa. באופן מעניין, בלחץ אקסטרוזיה של 30 kPa, ניתן היה ליצור חוטים שהתאימו לקוטר הפנימי של פיית האקסטרוזיה (קוטר חוט להט ממוצע: 323 מיקרומטר ± 50 מיקרומטר; קוטר הזרבובית: 300 מיקרומטר), דבר המצביע על כך שניתן להשיג "רזולוציה מקסימלית". יתר על כן, פרמטרי ההדפסה עבור רזולוציה זו יכולים להיות מיושמים בהצלחה על יצירת צינור כלי דם אלגינט/קולגן שניתן לחלץ ולחורר (איור 1D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64458/64458fig01.jpg"> איור 1: יצירת הדפסות ברזולוציה גבוהה באמצעות SLAM. התאמת רזולוציית הדפסה של סריגי אלגינט/קולגן כפונקציה של קוטר חוט הלהט באמצעות אקסטרוזיה ב-(A) 30 kPa, (B) 60 kPa ו-(C) 120 kPa. (D) יצירת צינור כלי דם אלגינט/קולגן. מוטות קנה מידה = 400 מיקרומטר (A-C), 10 מ"מ (עומק). קיצור: SLAM = ייצור תוספים בשכבה מושהית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64458/64458fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
אנלוגים לעור SLAM שימש גם ליצירת מבנה דמוי עור (איור 2A) באמצעות ביו-דיו שנוצר מתערובת של קולגן I ופקטין. כדי להשיג שיפוע של תכונות מכניות דומות לאלה המצויות בעור, נעשה שימוש בפרופורציות שונות של פקטין וקולגן בשכבות העוריות (5% w/w פקטין מעורבב ביחס של 2:1 עם ציר קולגן של 5 מ"ג∙mL −1) ובשכבות היפודרמליות (5% w/w פקטין מעורבב ביחס של 1:1 עם ציר קולגן של 5 מ"ג∙mL−1 ). המבנה שהתקבל (איור 2Bi-Bii) שולב היטב לאחר טבילה ב-DMEM, ללא כל סימן לדלמינציה. חשוב לציין שהייתה רמה גבוהה של כדאיות תאים בכל המבנה (איור 2Biii) לאחר תקופה של 14 ימי תרבית. מעניין לציין כי במהלך תקופת התרבות החומרים התקשו24, מה שמעיד על שיפוץ החומר.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64458/64458fig02.jpg"> איור 2: ייצור מבנה דמוי עור . (A) סכמה המראה כיצד תהליך SLAM שימש לייצור מבנה שכבתי המשובץ בפיברובלסטים עוריים אנושיים. מצע התלייה כאן יוצר מחלקיקים שנוצרו מאגרוז, בעוד שהשכבות ההיפודרמליות והעוריות נוצרו בפרופורציות שונות של פקטין וקולגן I. (B) המבנה השכבתי נועד לייצג את המבנה התלת-שכבתי של העור (i). עם ההצלחה בשכפול מבנה זה (ii), רמות גבוהות של כדאיות התא נצפו לאורך הדגימות, כפי שמוצג על ידי צביעת calcein-AM (iii). סרגל קנה מידה = 5 מ"מ (Bii). קיצור: SLAM = ייצור תוספים בשכבה מושהית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64458/64458fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
עורק התרדמה כדי למתוח את גבולות השיטה, הופק מבחר הדפסים מורכבים יותר. בדוגמה אחת כזו, עורק התרדמה הדו-מפרקי הודפס באמצעות ביו-דיו גלן 1% (איור 3A), אשר לאחר מכן הוצלב על-ידי אקסטרוזיה של 200 mM CaCl2 בתוך מצע ג'ל הנוזל (איור 3B) ופשוט הורם מהתמיכה לאחר הג'לציה (איור 3C). למרות פתרונות הדפסה מקדימים שהציגו צמיגות נמוכה, המיטה התומכת הצליחה לאפשר הפקה של הגיאומטריה המורכבת. העורק שמר על מבנהו במהלך השיקוע, ההצלבה והחילוץ (איור 3), ללא צורך לשנות את קודי ההדפסה כדי לשלב פיגומים נוספים.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64458/64458fig03.jpg"> איור 3: תהליך הייצור של עורק התרדמה באמצעות SLAM. (A) שחול של גלן בתוך מצע ג'ל הנוזל במהלך ההדפסה, (B) השלמת הדפסת עורק התרדמה בתוך ג'ל הנוזל במהלך crosslinking, ו-(C) מודל סופי של עורק התרדמה לאחר שליפה מתמיכה בג'ל נוזלי. פסי קנה מידה = 10 מ"מ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64458/64458fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Agarose Fluid Gels Formed by Shear Processing During Gelation for Suspended 3D Bioprinting at JoVE.com

Agarose Fluid Gels Formed by Shear Processing During Gelation for Suspended 3D Bioprinting

עיבוד גזירה במהלך היווצרות הידרוג'ל מביא לייצור מתלי מיקרוג'ל הדקים אך מתחדשים במהירות לאחר הסרת כוחות הגזירה. חומרים אלה שימשו כמטריצה תומכת להדפסה ביולוגית של מבנים מורכבים ועמוסי תאים. כאן מתוארות שיטות המשמשות לייצור המיטה התומכת והדיו הביולוגי התואם.

ג'ל נוזלי אגרוז שנוצר על ידי עיבוד גזירה במהלך הג'לציה להדפסה ביולוגית תלת ממדית מושהית

The use of granular matrices to support parts during the bioprinting process was first reported by Bhattacharjee et al. in 2015, and since then, several ...

היכולת להשתמש בדיו ביולוגי שונה היא בעלת חשיבות עליונה לפיתוח מוצלח של מבנים מודפסים ביולוגית, וטכנולוגיה זו מאפשרת שימוש בחומרים שבדרך כלל אינם תואמים לטכניקות הדפסה קונבנציונליות. תווך השהייה מונע קריסה של ביו-דיו בצמיגות נמוכה בעת השקעתו, ומאפשר שילוב של ביו-דיו שונים בתוך מבנה יחיד כדי ליצור וריאציות אזוריות בתכונות כימיות ומכניות הדומות יותר לרקמות מקומיות. הדגמת ההליך תהיה ד"ר טום רוברטסון, עמית מחקר מאוניברסיטת בירמינגהם, וד"ר ג'סיקה סניור, עמיתת מחקר מאוניברסיטת האדרספילד.כדי להתחיל, הפעל את הריומטר והכנס גיאומטריות משוננות של 40 מ"מ, מה שמאפשר לו לעמוד במשך 30 דקות. אפס את גובה הרווח של הרומטר באמצעות פונקציית גובה הרווח אפס. הוסף כשני מיליליטר דגימה בלוח התחתון והנמיך את הגיאומטריה העליונה ליצירת גובה רווח של מילימטר אחד.חתכו את הדגימה על ידי הסרת עודפי החומר שנפלט מבין הלוחות באמצעות קצה שטוח ולא שוחק כדי למשוך נוזל עודף מהרווח, והשרו אותו בנייר טישו. כדי לקבוע את יכולת ההזרקה של הדיו הביולוגי, בצע פרופילי viscometry על-ידי בחירה בבדיקת Viscometry מתוך אפשרויות המשתמש. הזן את הפרמטרים לבדיקת רמפה מבוקרת קצב גזירה במהירות 0.1 עד 500 לשנייה עם זמן רמפה של דקה.טען דגימה חדשה וחזור על התהליך כדי להבטיח יכולת שחזור. כדי לקבוע את מאפייני הג'לינג של הביו-דיו, בוצעו בדיקות דפורמציה קטנות על ידי בחירת בדיקות תנודה מאפשרויות המשתמש. יש להזין פרמטרים לבדיקת תדר אחת תחת מאמץ קבוע, כתדירות של הרץ אחד, מאמץ של 0.5% במשך שעה אחת בזמן שהדיו ג'ל.חזור על בדיקת כבש הוויסקומטריה על דגימות חדשות תחת בקרת מאמץ באמצעות הלחצים העליונים והתחתונים שנקבעו מבדיקת הרמפה מבוקרת קצב הגזירה בשלב כפי שהודגם בעבר. כדי לבצע מדידות משרעת ותדר באתרן על דגימות ג'ל, בחר בדיקת תנודה מתוך אפשרויות המשתמש. לאחר בחירת טאטוא המשרעת, הזן את הפרמטרים לבדיקת טאטוא משרעת הנשלטת על ידי מתח ב- 0.01 עד 500% בתדר הרץ אחד קבוע.לאחר השלמת הבדיקה, נתח את הספקטרום כדי לקבוע את האזור הויסקו-אלסטי הליניארי. טען דגימה חדשה על הריומטר ואפשר לו לג'ל. לאחר מכן בחר בדיקת תנודה מתוך אפשרויות המשתמש.בחר בדיקת תדר ופרמטרים של תדר קלט בין 0.01 ל -10 הרץ ומתח בתוך האזור הויסקו-אלסטי הליניארי של הספקטרום שנקבע מנתוני טאטוא המשרעת שהתקבלו קודם לכן. כדי להפעיל תוכנת CAD ולהתחיל את הדור של מודל CAD, בחר באפשרות כלים ולאחר מכן לחץ על חומרים בתוכנת CAD כדי להגדיר את פרמטרי ההדפסה עבור הביו-דיו שנבחר. הזן את קוטר חוט הלהט המשוער בכרטיסיה עובי כדי לקבוע את עובי z של כל שכבה.לעיצוב המבנה שכבה אחר שכבה, השתמשו בכרטיסיות שכבות בתוכנה, קבצו את השכבות באמצעות הכרטיסייה 'קבוצה' והקצו כל שכבה לרמה במישור z באמצעות הכרטיסייה 'רמה'. צור מבנה סריג על ידי יצירת שכבה אחת עם החוטים לאורך ציר x ושכבה שנייה לאורך ציר y והקצה את שתיהן לרמה נפרדת. תחת הכרטיסיה קבוצה, קבע את גובה הבנייה על-ידי בחירת מספר היחידות החוזרות במבנה.לאחר מכן לחץ על הכלי צור כדי ליצור קוד G עבור העיצוב ולהציג עיבוד תלת ממדי של המבנה. במדפסת הביולוגית, יש להכניס את הדיו הביולוגי למחסנית ההדפסה ולהבריג אותו לראש ההדפסה שמעל למיקרו-שסתום. לאחר מכן לחץ על פונקציית מדידת אורך המחט כדי לכייל את ראש ההדפסה.לאחר מכן, חברו את ראש ההדפסה המורכב למערכת הלחץ הפנאומטית, והעמיסו את כלי התרבית על פלטפורמת ההדפסה. לאחר בחירת לחץ מתאים, פתח את קוד ה- G שנוצר קודם ולחץ על הפעל כדי להתחיל בתהליך ההדפסה. לאחר השלמת ההדפסה של עורק התרדמה, השתמש מזרק ומחט כדי להזריק שני מיליליטר של 200 מילימולר סידן כלורי dihydrate סביב המבנה.לאחר שלוש שעות לפחות, הסירו את מצע התמיכה בג'ל נוזלי מרחבי המבנה ושטפו אותו בעדינות ב-PBS. לאחר מכן הסר את המבנה מאמבט התמיכה באמצעות מרית. נצפתה התאמת רזולוציית הדפסה של סריגי אלגינט וקולגן כפונקציה של קוטר חוט הלהט באמצעות אקסטרוזיה ב 30, 60 ו -120 קילופסקל והתוצאות הראו כי הרזולוציה ניתנת לכוונון ישיר עם השינויים בלחץ האקסטרוזיה.כדי להשיג שיפוע של תכונות מכניות דומות לאלה שנמצאו בעור, נעשה שימוש בפרופורציות שונות של פקטין וקולגן בשכבות העור וההיפודרמיס, וכתוצאה מכך נוצר מבנה ללא סימן לדלמינציה. רמה גבוהה של כדאיות התא נצפתה בכל המבנה לאחר 14 ימי תרבית שבמהלכם החומרים התקשחו, מה שמעיד על עיצוב מחדש של החומר. עבור הריאולוגיה, חשוב שהדגימה תיטען כראוי כדי להבטיח נתונים הניתנים לשחזור, ועבור ההדפסה הביולוגית, חשוב שהמבנה יהיה מקושר במלואו לפני הוצאתו מהמיטה התומכת.תרבית מבני רקמות בקנה מידה גדול לפרקי זמן ממושכים מסייעת לחקור את תגובת התאים המשובצים לגירויים פיזיים וכימיים.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

הנדסת ג&#39;ל קולגן Cellularized 3D לשחזור רקמות וכלי דם

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

הכנת ג&#39;לי 3D קולגן microchannels לחקר אינטראקציות 3D<em&gt; In vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

יצירת רקמת הלב מציגה שילוב מכני של Spheroids באמצעות 3D Bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting של הסחוס, תחליפי רקמת העור ניצול פסיבים הרומן ערבוב טכניקה יחידה עבור Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

ייצור של בארות Agarose מותאם אישית עבור תא זריעה וטבעת רקמות הרכבה עצמית תוך שימוש בתבניות מודפס 3D

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

פרוטוקולים של 3D ביוריטינג ג'לטין הידרוג'ל מבוסס-דיו

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...

3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue

הדפסה ביולוגית תלת-ממדית של אסטרוציטים קליפת המוח מורין לרקמה דמוית עצב הנדסית

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also ...

Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting

ייצור אוטומטי בקנה מידה גדול של כדורי תאי גזע שמקורם בשומן להדפסה ביולוגית תלת-ממדית

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue ...

Ensemble Force Spectroscopy by Shear Forces

ספקטרוסקופיית כוח אנסמבל על ידי כוחות גזירה

Single-molecule techniques based on fluorescence and mechanochemical principles provide superior sensitivity in biological sensing. However, due to the ...

Quantitative Characterization of Bioink Properties for Continuous DLP Printing

Quantitative Characterization of Liquid Photosensitive Bioink Properties for Continuous Digital Light Processing Based Printing

Quantitative Characterization of Liquid Photosensitive Bioink Properties for Continuous Digital Light Processing Based Printing (Video) | JoVE 

אפיון כמותי של תכונות ביודיו נוזלי רגיש לאור להדפסה רציפה מבוססת עיבוד אור דיגיטלי

Precise printing fabrication of bioinks is a prerequisite for tissue engineering; the Jacobs working curve is the tool to determine the precise printing ...