Name: agarose fluid gels formed by shear processing during gelation for suspended 3d bioprinting
Uploaded: 2023-05-26T14:40:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Agarose Fluid Gels Formed by Shear Processing During Gelation for Suspended 3D Bioprinting at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить EPSRC (EP / L016346 / 1), MRC и Альянс докторантуры Biosciences for Health за финансирование и поддержку этой работы.

<ol>
	<li>Lee, K. Y., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+for+tissue+engineering.">Hydrogels for tissue engineering.</a> Chemical Reviews. 101 (7), 1869-1880 (2001).</li><li>Caliari, S. R., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+hydrogels+for+cell+culture.">A practical guide to hydrogels for cell culture.</a> Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).</li><li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics+for+3D+cell+culture.">Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture.</a> Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).</li><li>Drury, J. L., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+for+tissue+engineering:+scaffold+design+variables+and+applications.">Hydrogels for tissue engineering: scaffold design variables and applications.</a> Biomaterials. 24 (24), 4337-4351 (2003).</li><li>Iordachescu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+model+for+the+development+of+mature+bone+containing+an+osteocyte+network.">An in vitro model for the development of mature bone containing an osteocyte network.</a> Advanced Biosystems. 2 (2), 1700156 (2018).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel+cryopreservation+system:+an+effective+method+for+cell+storage.">Hydrogel cryopreservation system: an effective method for cell storage.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (11), 3330 (2018).</li><li>McCormack, A., Highley, C. B., Leslie, N. R., Melchels, F. P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printing+in+suspension+baths:+keeping+the+promises+of+bioprinting+afloat.">3D printing in suspension baths: keeping the promises of bioprinting afloat.</a> Trends in Biotechnology. 38 (6), 584-593 (2020).</li><li>Cheng, W., Zhang, J., Liu, J., Yu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granular+hydrogels+for+3D+bioprinting+applications.">Granular hydrogels for 3D bioprinting applications.</a> View. 1 (3), 20200060 (2020).</li><li>Lieben, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+3D+printing+of+human+tissues+is+taking+shape.">The future of 3D printing of human tissues is taking shape.</a> Nature Reviews Rheumatology. 12 (4), 191 (2016).</li><li>Bhattacharjee, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Writing+in+the+granular+gel+medium.">Writing in the granular gel medium.</a> Science Advances. 1 (8), 1500655 (2015).</li><li>Hinton, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+printing+of+complex+biological+structures+by+freeform+reversible+embedding+of+suspended+hydrogels.">Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels.</a> Science Advances. 1 (9), 1500758 (2015).</li><li>Zarrintaj, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose-based+biomaterials+for+tissue+engineering.">Agarose-based biomaterials for tissue engineering.</a> Carbohydrate Polymers. 187, 66-84 (2018).</li><li>te Nijenhuis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Thermoreversible Networks: Viscoelastic Properties and Structure of Gels. , 194-202 (1997).</li><li>Norton, I. T., Jarvis, D. A., Foster, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+model+for+the+formation+and+properties+of+fluid+gels.">A molecular model for the formation and properties of fluid gels.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 26 (4), 255-261 (1999).</li><li>Fern&#225;ndez Farr&#233;s, I., Moakes, R. J. A., Norton, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+biopolymer+fluid+gels:+A+microstructural+approach.">Designing biopolymer fluid gels: A microstructural approach.</a> Food Hydrocolloids. 42, 362-372 (2014).</li><li>Cooke, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structuring+of+hydrogels+across+multiple+length+scales+for+biomedical+applications.">Structuring of hydrogels across multiple length scales for biomedical applications.</a> Advanced Materials. 30 (14), 1705013 (2018).</li><li>Foster, N. C., Allen, P., El Haj, A. J., Grover, L. M., Moakes, R. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+therapeutic+responses+via+engineering+microenvironments+with+a+novel+synthetic+fluid+gel.">Tailoring therapeutic responses via engineering microenvironments with a novel synthetic fluid gel.</a> Advanced Healthcare Materials. 10 (16), 2100622 (2021).</li><li>Ellis, A. L., Norton, A. B., Mills, T. B., Norton, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilisation+of+foams+by+agar+gel+particles.">Stabilisation of foams by agar gel particles.</a> Food Hydrocolloids. 73, 222-228 (2017).</li><li>Ghebremedhin, M., Seiffert, S., Vilgis, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physics+of+agarose+fluid+gels:+Rheological+properties+and+microstructure.">Physics of agarose fluid gels: Rheological properties and microstructure.</a> Current Research in Food Science. 4, 436-448 (2021).</li><li>Garrec, D. A., Norton, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+fluid+gel+formation+and+properties.">Understanding fluid gel formation and properties.</a> Journal of Food Engineering. 112 (3), 175-182 (2012).</li><li>Garrec, D. A., Guthrie, B., Norton, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kappa+carrageenan+fluid+gel+material+properties.+Part+1:+Rheology.">Kappa carrageenan fluid gel material properties. Part 1: Rheology.</a> Food Hydrocolloids. 33 (1), 151-159 (2013).</li><li>Adams, S., Frith, W. J., Stokes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+particle+modulus+on+the+rheological+properties+of+agar+microgel+suspensions.">Influence of particle modulus on the rheological properties of agar microgel suspensions.</a> Journal of Rheology. 48 (6), 1195-1213 (2004).</li><li>Senior, J. J., Cooke, M. E., Grover, L. M., Smith, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+complex+hydrogel+structures+using+suspended+layer+additive+manufacturing+(SLAM).">Fabrication of complex hydrogel structures using suspended layer additive manufacturing (SLAM).</a> Advanced Functional Materials. 29 (49), 1904845 (2019).</li><li>Moakes, R. J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+suspended+layer+additive+manufacturing+approach+to+the+bioprinting+of+tri-layered+skin+equivalents.">A suspended layer additive manufacturing approach to the bioprinting of tri-layered skin equivalents.</a> APL Bioengineering. 5 (4), 046103 (2021).</li><li>Moxon, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suspended+manufacture+of+biological+structures.">Suspended manufacture of biological structures.</a> Advanced Materials. 29 (13), 1605594 (2017).</li><li>Noor, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Printing+of+personalized+thick+and+perfusable+cardiac+patches+and+hearts.">3D Printing of personalized thick and perfusable cardiac patches and hearts.</a> Advanced Science. 6 (11), 1900344 (2019).</li><li>Compaan, A. M., Song, K., Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gellan+fluid+gel+as+a+versatile+support+bath+material+for+fluid+extrusion+bioprinting.">Gellan fluid gel as a versatile support bath material for fluid extrusion bioprinting.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 11 (6), 5714-5726 (2019).</li><li>Moxon, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blended+alginate/collagen+hydrogels+promote+neurogenesis+and+neuronal+maturation.">Blended alginate/collagen hydrogels promote neurogenesis and neuronal maturation.</a> Materials Science and Engineering: C. 104, 109904 (2019).</li><li>H&#246;lzl, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioink+properties+before,+during+and+after+3D+bioprinting.">Bioink properties before, during and after 3D bioprinting.</a> Biofabrication. 8 (3), 032002 (2016).</li><li>Chimene, D., Lennox, K. K., Kaunas, R. R., Gaharwar, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+bioinks+for+3D+printing:+a+materials+science+perspective.">Advanced bioinks for 3D printing: a materials science perspective.</a> Annals of Biomedical Engineering. 44 (6), 2090-2102 (2016).</li><li>Schwab, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printability+and+shape+fidelity+of+bioinks+in+3D+bioprinting.">Printability and shape fidelity of bioinks in 3D bioprinting.</a> Chemical Reviews. 120 (19), 11028-11055 (2020).</li><li>Rutz, A. L., Lewis, P. L., Shah, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+next-generation+bioinks:+Tuning+material+properties+pre-+and+post-printing+to+optimize+cell+viability.">Toward next-generation bioinks: Tuning material properties pre- and post-printing to optimize cell viability.</a> MRS Bulletin. 42 (8), 563-570 (2017).</li><li>Mosadegh, B., Xiong, G., Dunham, S., Min, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+progress+in+3D+printing+for+cardiovascular+tissue+engineering.">Current progress in 3D printing for cardiovascular tissue engineering.</a> Biomedical Materials. 10 (3), 034002 (2015).</li><li>Zhou, K., Sun, Y., Yang, J., Mao, H., Gu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+for+3D+embedded+bioprinting:+a+focused+review+on+bioinks+and+support+baths.">Hydrogels for 3D embedded bioprinting: a focused review on bioinks and support baths.</a> Journal of Materials Chemistry B. 10 (12), 1897-1907 (2022).</li><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+bioprinting+of+collagen+to+rebuild+components+of+the+human+heart.">3D bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart.</a> Science. 365 (6452), 482-487 (2019).</li><li>Kyle, S., Jessop, Z. M., Al-Sabah, A., Whitaker, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printability'+of+candidate+biomaterials+for+extrusion+based+3D+printing:+state-of-the-art.">Printability' of candidate biomaterials for extrusion based 3D printing: state-of-the-art.</a> Advanced Healthcare Materials. 6 (16), 1700264 (2017).</li><li>Hinton, T. J., Lee, A., Feinberg, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+bioprinting+from+the+micrometer+to+millimeter+length+scales:+Size+does+matter.">3D bioprinting from the micrometer to millimeter length scales: Size does matter.</a> Current Opinion in Biomedical Engineering. 1, 31-37 (2017).</li><li>Seoane-Via&#241;o, I., Trenfield, S. J., Basit, A. W., Goyanes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+3D+printed+pharmaceuticals:+From+hype+to+real-world+clinical+applications.">Translating 3D printed pharmaceuticals: From hype to real-world clinical applications.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 174, 553-575 (2021).</li><li>Jovic, T. H., Combellack, E. J., Jessop, Z. M., Whitaker, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+bioprinting+and+the+future+of+surgery.">3D bioprinting and the future of surgery.</a> Frontiers in Surgery. 7, 609836 (2020).</li></ol>

У авторов нет конфликтов интересов, о которых можно было бы заявить.

Рассмотрение выбора материалов, используемых для несущего слоя На этапе разработки от опорного станины требовались различные характеристики. Эти характеристики включали: i) поддержание достаточной структуры для суспендирования экструдированного материала; ii) способность к истончению при сдвиге, позволяющая печатающей головке свободно перемещаться по вспомогательному материалу; iii) быстрая реструктуризация (самовосстанавливающиеся свойства), образующая опору вокруг нанесенных биочернил; iv) термически стабильны как при комнатной температуре, так и при физиологических температурах; v) нейтральный (т.е. незаряженный) материал, который является относительно биоинертным, в диапазоне pH и электролитов (ионных частиц и концентраций), предотвращая взаимодействие с клетками и заряженными биочернилами; vi) нетоксичный; и vii) предпочтительно из неживотного источника.
Несмотря на то, что существует множество биополимерных материалов, которые сохраняют некоторые из этих неотъемлемых характеристик, с возможностью выполнения взвешенного 3D-аддитивного производства без соответствия всем этим характеристикам 11,26,27, намерение здесь состояло в том, чтобы создать опорный слой, который преодолел бы некоторые практические проблемы, связанные с другими вспомогательными материалами. Благодаря химическим свойствам агарозы и, в частности, при составлении в виде жидкого геля для твердых частиц, все эти характеристики могут быть получены. Это позволило создать опорный слой, который можно было использовать для широкого спектра биочернил23,24,25,28. Действительно, биоинертная природа материала обеспечила потенциал для поддержания печатной структуры in situ на протяжении всей культуры, что позволило в течение достаточного времени для полного развития многих различных биочернил без изменений в биологии. Кроме того, частицы, истончение позволило легко удалить их из окончательной печатной конструкции, в то время как нетоксичное, неживотное происхождение позволяет быстро перенести их в клинику, преодолевая барьеры, связанные с этическими и нормативными требованиями.
Соображения при выборе материалов для биочернил При прямой экструзионной биопечати биочернила наносятся на стол для 2D-печати. Полезно, чтобы мономерные растворы биочернил обладали способностью истончаться при сдвиге; Однако для получения высокоточных конструкций с физиологически значимыми размерами они должны иметь низкую тиксотропию и восстанавливаться до достаточно высокой вязкости, чтобы образовывать твердые нити при осаждении 29,30,31. При повышенной вязкости давление, необходимое для экструзии, значительно выше, что часто отрицательно влияет на жизнеспособность инкапсулированных клеток31,32. Суспензионная биопечать устраняет это ограничение, так как экструдированный материал поддерживается суспензионной ванной на протяжении всего сшивания. Эта разработка значительно расширяет диапазон составов биочернил, которые можно использовать. Например, недавняя работа показала использование растворов коллагена с низкой концентрацией, которые печатаются в очень сложных геометрических формах, аналогичных внутренней структуре сердца33,34,35. В приложениях, упомянутых в этом методе, встроенная печать позволяла выбирать чернила для биоматериала таким образом, чтобы наилучшим образом воспроизводить физиологическую среду, для которой они были предназначены, а не их способность печататься.
Ограничения по размеру структуры В литературе по биофабрикации было продемонстрировано, что различные виды биопринтеров, основанные на альтернативных технологиях печатающих головок, могут быть включены во встроенные технологии производства. Технология, продемонстрированная здесь, ничем не отличается, с примерами, которые включают пневматический биопринтер на основе микроэкструзии (INKREDIBLE), как продемонстрировали Senior et al., и биопринтеры на основе экструзии с управляемыми микроклапанами (3D Discovery)23. Хотя это делает технологию доступной для широкого круга пользователей, которые, возможно, уже владеют биопринтером, ограничения на достижимый размер конструкции в конечном итоге зависят от спецификаций рассматриваемого биопринтера. Первоначально основное ограничение на генерацию больших структур определяется размером печатного стола, границами траекторий X, Y и Z, а также размером сосуда, в котором содержится поддерживающий жидкий гель.
Ограничения в разрешении При изготовлении сложных конструкций микрометрового размера результирующее разрешение сильно зависит от точности принтера (контроль размера шага, степени экструзии), внутреннего диаметра печатного сопла и ряда регулируемых параметров программного обеспечения, включая скорость печати, давление печати и скорость потока36. Кроме того, контроль над размером капель, по-видимому, имеет решающее значение для облегчения создания структур с высоким разрешением, при этом наилучшие результаты наблюдаются в экструзионных принтерах с управляемым микроклапаном. В конечном счете, когда все параметры оптимизированы, разрешение печати может быть достигнуто, чтобы соответствовать или даже быть меньше внутреннего диаметра экструзионных сопел с нанесенной нитью порядка микрометровой шкалы37. Это, однако, зависит от оптимизации всех ранее упомянутых параметров печати, и разрешение может быть значительно ограничено механизмом печати и точностью. Например, пневматическая экструзия, по-видимому, не обеспечивает такое же разрешение печати, как экструзия с управляемым микроклапаном. Таким образом, достижение максимального разрешения печати может повлечь за собой финансовые последствия, поскольку такие системы влекут за собой значительно повышенные расходы для пользователя.
Перспективы и потенциал на будущее В настоящее время существует большой интерес к использованию приостановленных производственных процессов для производства сложных мягких структур, содержащих встроенные ячейки, и, несомненно, в ближайшие годы будут достигнуты значительные успехи. Наблюдается постоянный прогресс в улучшении разрешения печати, хотя еще неизвестно, насколько это будет необходимо, учитывая, что большинство биологических систем способны перестраиваться на молекулярном уровне. В то время как в средствах массовой информации основное внимание уделяется использованию 3D-печатных тканей для непосредственной замены тканей человека после травмы или заболевания, любые надежные медицинские процедуры, обеспечиваемые этими процессами, появятся через несколько лет38,39. Более вероятно, что влияние этих сложных систем культивирования будет заключаться в скрининге лекарств или даже в использовании в качестве инструментов, чтобы улучшить наше понимание биологических процессов38. В частности, здесь может быть очень полезна биология развития, где точный контроль над особым осаждением молекул позволит исследователям исследовать роль многофакторных систем в процессах развития тканей.

Гидрогели являются идеальными материалами для использования в качестве поддержки роста клеток1. В зависимости от используемого материала они гелеобразно образуются с помощью мягких механизмов, которые не ставят под угрозу жизнеспособность клеток 2,3. Высокое содержание воды (обычно >90%) означает, что питательные вещества и кислород могут легко диффундировать в материал, а отходы клеточного метаболизма диффундируют4. Таким образом, было показано, что жизнеспособность клеток сохраняется в течение периодов, превышающих 1 год5, и в настоящее время есть примеры использования гидрогелей для хранения или «паузы» клеток для будущего терапевтического использования6. Они широко используются в тканевой инженерии для производства тканеподобных структур, но их использование, как правило, ограничено трудностями в контроле как структуры, так и состава материала. Исторически сложилось так, что прочность гидрогеля сравнительно низкая (по отношению ко многим твердым тканям) из-за высокого содержания воды и малых объемов, занимаемых полимерной матрицей, образующей структуру. Кроме того, многие пути гелеобразования (термический, ионотропный, фибриллогенез) предлагают достаточно медленную кинетику, что означает, что их механические свойства имеют тенденцию неуклонно развиваться со временем. За исключением взаимопроникающих сетей, низкая механическая жесткость и медленное время отверждения часто приводят к тому, что биочернила не могут свободно стоять при осаждении, имеют тенденцию к «просадке» и потере четкости при первоначальном экструдировании.
В попытке преодолеть эту ключевую проблему были разработаны встроенные методы печати, которые обеспечивают поддержку во время печати, в то время как механические свойства конструкции развиваются 7,8. Как только микроструктура геля полностью разовьется и механические свойства достигнут оптимального, опорная матрица может быть удалена, как правило, путем осторожной промывки или плавления поддерживающей фазы. В первоначальной работе по этому подходу использовалась вязкая плюроновая дисперсия, в которой вторичная фаза была распределена9. Совсем недавно Bhattacharjee et al. использовали гели в форме гранулированного карбопола, чтобы продемонстрировать, что массивы клеток могут быть суспендированы в поддерживающем геле10. Впоследствии Hinton et al. сообщили об экструзии гелевых материалов, содержащих клетки, в опорный слой, который состоял из микрогелевой суспензии, образованной из гранулированного желатина11. После экструзии ячеистого гидрогеля и его последующего отверждения желатин удаляли путем осторожного нагрева опорной ванны, что позволяло расплавить желатин. К сожалению, этот процесс все еще имеет ряд ограничений. Например, химическая структура желатина по сравнению с коллагеном (следовательно, он является гидролизованной формой коллагена) такова, что многие химические фрагменты в его основной цепи могут взаимодействовать с биологическими объектами; Таким образом, остаточная опорная матрица может мешать последующим биологическим процессам. Кроме того, продукты животного происхождения представляют собой ограничительное использование при рассмотрении вопроса о переводимости технологии. Это создает проблемы, если изготовленная деталь предназначена для клинического использования или даже если она предназначена для ответа на фундаментальные биологические вопросы, где это поверхностное загрязнение может вызвать серьезную проблему.
Впоследствии мы создали усовершенствованный процесс, который позволяет суспендировать производство гидрогелей в поддерживающей матрице, которая не имеет заряда в физиологических условиях и формируется из материалов, не относящихся к животному миру. Хотя этот процесс может быть использован с рядом биополимерных носителей, агароза обеспечивает материал, который инертен к биологическим взаимодействиям, поскольку он основан на сахаре и нейтрально заряжен при физиологическом рН12,13. Вместо того, чтобы фрагментировать уже существующий гель, материал основы формируется путем применения сдвига во время гелеобразования14,15,16. При этом образуется матрица частиц, которые проявляют дендроноподобные черты на своей поверхности и диспергируются во вторичной матрице негелеобразного полимера17,18. В результате получается материал с интересными свойствамиматериала 19,20,21,22, который может разжижаться при сдвиге аналогично ранее сообщенным гранулированным гелям, но имеет тенденцию быстрее восстанавливать вязкость при удалениисдвига 23. После того, как клеточный материал, экструдированный в опорную матрицу, полностью созреет, опорная матрица может быть удалена путем осторожного перемешивания перед помещением в культуру. Было показано, что этот процесс можно использовать для получения материалов со сложной структурой и рекапитуляции биологических структур как кожи, так и остеохондральной области23,24,25. В этом документе подробно описывается, как изготавливать вспомогательный материал, и выделяются соответствующие биочернила, используемые в различных сложных структурах.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D Discovery Bioprinter</td>
			<td>RegenHU</td>
			<td>BIOFACTORY</td>
			<td>Microvalve extrusion bioprinter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>9012-36-6</td>
			<td>Material used to create fluid gel support baths&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop autoclave</td>
			<td>Prestige Medical</td>
			<td>B8L75814</td>
			<td>Classic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Blue G</td>
			<td>Merck</td>
			<td>6104-58-1</td>
			<td>Dye used to stain structures&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>10035-04-8</td>
			<td>Used to reticulate printed structures&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>D4902-25MG</td>
			<td>Used in adipogenic media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Merck</td>
			<td>D6429</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duran&#160; bottle&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z305219</td>
			<td>glass bottle&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS XL Core Imaging System</td>
			<td>EVOS&#8482;</td>
			<td>AMEX1000</td>
			<td>Brightfield microscope with phase contrast</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10500-064</td>
			<td>Cell culture media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gellan gum</td>
			<td>Special Ingredients</td>
			<td>5060341112638</td>
			<td>Low Acyl Gellan gum used to make the bioink for the corotid artery model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H9897-10PAK</td>
			<td>Buffer for cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>I7378</td>
			<td>Used in adipogenic media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isobutyl-methylxanthine (IBMX)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>I7018-100MG</td>
			<td>Used in adipogenic media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte growth medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>00192060</td>
			<td>Used as media to culture keratinocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Methoxy Pectin</td>
			<td>CP Kelco</td>
			<td>LM-5CS</td>
			<td>Pectin used to make pectin/collagen blends</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td>Used to inhibit bacterial growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureCol EZ Gel solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>5074</td>
			<td>Collagen solution used to make alginate/collagen blends</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Alginate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>9005-38-3</td>
			<td>Alginate powder used to make alginate/collagen blends&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE select&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12563011</td>
			<td>cell dissociation enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Flasks</td>
			<td>StarLab</td>
			<td>CC7682-4175</td>
			<td>Used for culturing cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

agarose fluid gels formed by shear processing during gelation for suspended 3d bioprinting

Использование гранулированных матриц для поддержки деталей в процессе биопечати было впервые описано Bhattacharjee et al. в 2015 году, и с тех пор было разработано несколько подходов к подготовке и использованию поддерживающих гелевых слоев в 3D-биопечати. В этой статье описывается процесс производства микрогелевых суспензий с использованием агарозы (известных как жидкие гели), в котором образование частиц регулируется применением сдвига во время гелеобразования. Такая обработка создает тщательно определенные микроструктуры с последующими свойствами материала, которые дают явные преимущества в качестве встраивания печатных носителей, как химически, так и механически. К ним относятся поведение вязкоупругих твердых материалов при нулевом сдвиге, ограничение диффузии на большие расстояния и демонстрация характерного поведения флоккулированных систем при истончении сдвига. 
Однако при снятии напряжения сдвига жидкие гели обладают способностью быстро восстанавливать свои эластичные свойства. Это отсутствие гистерезиса напрямую связано с определенными микроструктурами, о которых упоминалось ранее; Из-за обработки реакционноспособные, негелеобразные полимерные цепи на границе раздела частиц облегчают межчастичные взаимодействия, аналогичные эффекту Velcro. Это быстрое восстановление эластичных свойств позволяет биопечатать детали с высоким разрешением из биоматериалов с низкой вязкостью, поскольку быстрое преобразование опорного слоя улавливает биочернила на месте, сохраняя их форму. Кроме того, преимуществом агарозных жидких гелей является асимметричный переход гелеобразования/плавления (температура гелеобразования ~30 °C и температура плавления ~90 °C). Этот термический гистерезис агарозы позволяет печатать и культивировать биопечатную часть in situ без плавления поддерживающего жидкого геля. В этом протоколе показано, как производить гели с агарозной жидкостью, и демонстрируется их использование для поддержки производства ряда сложных деталей гидрогеля в рамках производства аддитив с подвесным слоем (SLAM).

Альгинатные и коллагеновые биочернила I типа Было обнаружено, что разрешение печати (записанное в зависимости от диаметра нити) напрямую настраивается с помощью изменений давления экструзии (рис. 1A-C). Давление экструзии и разрешение печати были напрямую связаны с наименьшими диаметрами нити, полученными при печати при давлении экструзии 30 кПа. Интересно, что при давлении экструзии 30 кПа могут генерироваться нити, соответствующие внутреннему диаметру экструзионного сопла (средний диаметр нити: 323 мкм ± 50 мкм; диаметр сопла: 300 мкм), что позволяет предположить, что может быть достигнуто «максимальное разрешение». Кроме того, параметры печати для этого разрешения могут быть успешно применены для создания альгинатной/коллагеновой сосудистой трубки, которая может быть извлечена и перфузирована (рис. 1D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64458/64458fig01.jpg"> Рисунок 1: Генерация отпечатков с высоким разрешением с использованием SLAM. Адаптация разрешения печати альгинатных/коллагеновых решеток в зависимости от диаметра нити путем экструзии при (A) 30 кПа, (B) 60 кПа и (C) 120 кПа. (D) Образование альгинатной/коллагеновой сосудистой трубки. Масштабные линейки = 400 мкм (A-C), 10 мм (D). Аббревиатура: SLAM = аддитивное производство с подвесным слоем. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64458/64458fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Аналоги кожи SLAM также использовался для создания структуры, похожей на кожу (рис. 2A), с использованием биочернил, образованных из смеси коллагена I и пектина. Для достижения градиента механических свойств, сходных с теми, которые обнаруживаются в коже, различные пропорции пектина и коллагена использовались в дермальном (5% пектина, смешанного в соотношении 2:1 с коллагеновым запасом 5 мг∙мл-1) и гиподермальном (5% вес/вес пектина, смешанного в соотношении 1:1 с запасом коллагена 5 мг∙мл-1) слоях. Полученная структура (рис. 2Bi-Bii) была хорошо интегрирована после погружения в DMEM без признаков расслоения. Важно отметить, что наблюдался высокий уровень жизнеспособности клеток по всей структуре (рис. 2Biii) после периода культивирования в течение 14 дней. Интересно, что за период культуры материалы застылив 24 раза, что указывает на переделку материала.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64458/64458fig02.jpg"> Рисунок 2: Создание кожистой структуры. (A) Схема, показывающая, как процесс SLAM был использован для создания слоистой структуры, встроенной в дермальные фибробласты человека. Подвесное ложе здесь было изготовлено из частиц, образованных из агарозы, в то время как подкожный и дермальный слои были сформированы из различных пропорций пектина и коллагена I. (B) Слоистая структура предназначалась для представления трехслойной структуры кожи (i). При успешном воспроизведении этой структуры (ii) высокие уровни жизнеспособности клеток были отмечены во всех образцах, как показано окрашиванием кальцеином-AM (iii). Масштабная линейка = 5 мм (Bii). Аббревиатура: SLAM = аддитивное производство с подвесным слоем. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64458/64458fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Сонная артерия Чтобы раздвинуть границы метода, была произведена подборка более сложных отпечатков. В одном из таких примеров раздвоенная сонная артерия была напечатана с использованием 1% геллановых биочернил (рис. 3А), которые затем сшивали путем экструзии 200 мМ CaCl2 в слое псевдоожиженного геля (рис. 3В) и просто поднимали с носителя после гелеобразования (рис. 3В). Несмотря на то, что решения-прекурсоры для печати демонстрировали низкую вязкость, опорный слой успешно позволял производить сложную геометрию. Артерия сохранила свою структуру во время осаждения, сшивания и экстракции (рис. 3) без необходимости изменения кодов печати для включения дополнительных строительных лесов.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64458/64458fig03.jpg"> Рисунок 3: Процесс изготовления геллано-сонной артерии с использованием SLAM . (A) Экструзия гелана в слое жидкостного геля во время печати, (B) завершенный отпечаток сонной артерии в жидком геле во время сшивания и (C) окончательная модель сонной артерии после извлечения из жидкой гелевой подложки. Масштабные линейки = 10 мм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64458/64458fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Agarose Fluid Gels Formed by Shear Processing During Gelation for Suspended 3D Bioprinting at JoVE.com

Agarose Fluid Gels Formed by Shear Processing During Gelation for Suspended 3D Bioprinting

Обработка сдвигом во время образования гидрогеля приводит к образованию микрогелевых суспензий, которые тонкие, но быстро реструктурируются после снятия сил сдвига. Такие материалы были использованы в качестве опорной матрицы для биопечатных сложных, нагруженных клетками структур. Здесь описаны методы, используемые для изготовления опорного слоя и совместимых биочернил.

Агарозные жидкие гели, образованные сдвиговой обработкой во время гелеобразования для суспензионной 3D-биопечати

The use of granular matrices to support parts during the bioprinting process was first reported by Bhattacharjee et al. in 2015, and since then, several ...

Возможность использования различных биочернил имеет первостепенное значение для успешной разработки биопечатных структур, и эта технология облегчает использование материалов, которые, как правило, несовместимы с традиционными методами печати. Суспендирующая среда предотвращает разрушение биочернил с низкой вязкостью при нанесении и позволяет интегрировать различные биочернила в единую конструкцию для создания региональных вариаций химических и механических свойств, которые больше похожи на нативную ткань. Продемонстрацией процедуры будут доктор Том Робертсон, научный сотрудник из Бирмингемского университета, и доктор Джессика Сениор, научный сотрудник из Университета Хаддерсфилда.Для начала включите реометр и вставьте 40-миллиметровую зубчатую геометрию, дав ему постоять 30 минут. Обнулите высоту зазора реометра с помощью функции высоты нулевого зазора. Добавьте примерно два миллилитра образца на нижнюю пластину и уменьшите верхнюю геометрию, чтобы создать высоту зазора в один миллиметр.Обрежьте образец, удалив лишний материал, вытесненный между пластинами, используя плоский неабразивный край, чтобы удалить лишнюю жидкость из зазора, и пропитайте его папиросной бумагой. Чтобы определить инъекционность биочернил, выполните профили вискометрии, выбрав тест на вискометрию в пользовательских параметрах. Введите параметры для испытания на линейное изменение скорости сдвига со скоростью от 0,1 до 500 в секунду с минутным временем нарастания.Загрузите новый образец и повторите процесс, чтобы обеспечить воспроизводимость. Чтобы определить гелеобразующие характеристики биочернил, были проведены испытания на небольшую деформацию, выбрав «Колебательное тестирование» из пользовательских опций. Ввод параметров в один частотный тест при постоянной деформации, как частота в один герц, деформация 0,5% в течение одного часа, пока чернила гелеобразны.Повторите вискометрическое испытание на новых образцах, находящихся под контролем напряжения, используя верхнее и нижнее напряжения, определенные в ходе линейного испытания с регулируемой скоростью сдвига, как показано ранее. Чтобы выполнить измерения амплитуды и частоты in situ на гелеобразных образцах, выберите колебательный тест из пользовательских опций. После выбора амплитудной развертки введите параметры для испытания на амплитудную развертку, которая контролируется деформацией от 0,01 до 500% при постоянной частоте в один герц.После завершения теста проанализируйте спектры, чтобы определить линейную вязкоупругую область. Загрузите новый образец на реометр и дайте ему загустеть. Затем выберите колебательный тест из пользовательских параметров.Выбор параметров частотного теста и входной частоты в диапазоне от 0,01 до 10 Гц и деформации в линейной вязкоупругой области спектров, определяемой по полученным ранее данным амплитудной развертки. Чтобы запустить программное обеспечение САПР и начать создание модели САПР, выберите параметр «Инструменты», а затем нажмите «Материалы» в программном обеспечении САПР, чтобы определить параметры печати для выбранных биочернил. Введите предполагаемый диаметр нити на вкладке «Толщина», чтобы определить z-толщину каждого слоя.Чтобы спроектировать структуру слой за слоем, используйте вкладки «Слой» в программном обеспечении, сгруппируйте слои с помощью вкладки «Группа» и назначьте каждому слою уровень на z-плоскости с помощью вкладки «Уровень». Создайте решетчатую структуру, создав один слой с нитями вдоль оси x и второй слой вдоль оси y, и назначьте оба на отдельный уровень. На вкладке «Группа» определите высоту сборки, выбрав количество повторяющихся единиц в структуре.Затем нажмите кнопку Создать инструмент, чтобы создать G-код для проекта и просмотреть 3D-рендеринг конструкции. В биопринтере аликвотируйте биочернила в печатный картридж и ввинчивайте их в печатающую головку над микроклапаном. Затем нажмите функцию измерения длины иглы, чтобы откалибровать печатающую головку.Затем подключите собранную печатающую головку к пневматической системе давления и загрузите сосуд для культуры на печатную платформу. После того, как соответствующее давление было выбрано, откройте G-код, сгенерированный ранее, и нажмите «Выполнить», чтобы начать процесс печати. После завершения печати сонной артерии используйте шприц и иглу, чтобы ввести два миллилитра 200 миллимолярного дигидрата хлорида кальция вокруг конструкции.Как минимум через три часа снимите слой жидкого геля вокруг конструкции и аккуратно промойте его в PBS. Затем снимите конструкцию с опорной ванны с помощью шпателя. Наблюдалось адаптация разрешения печати альгинатных и коллагеновых решеток в зависимости от диаметра нити путем экструзии при 30, 60 и 120 килопаскалях, и результаты показали, что разрешение напрямую настраивается с изменениями давления экструзии.Для достижения градиента механических свойств, сходных с теми, которые обнаружены в коже, в дермальном и подкожном слоях использовались различные пропорции пектина и коллагена, в результате чего получалась структура без признаков расслаивания. Высокий уровень жизнеспособности клеток наблюдался по всей структуре после 14 дней культивирования, в течение которых материалы затвердели, что указывает на ремоделирование материала. Для реологии важно, чтобы образец был загружен правильно, чтобы обеспечить воспроизводимость данных, а для биопечати важно, чтобы структура была полностью сшита перед ее удалением из опорного слоя.Культивирование крупномасштабных тканевых конструкций в течение длительных периодов времени помогает исследовать реакцию встроенных клеток на физические и химические раздражители.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Инженерные 3D Cellularized Коллаген Гели для сосудистой регенерации ткани

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Подготовка 3D Коллаген Гели и микроканалов для изучения 3D взаимодействий<em&gt; В Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

Создание сердечной ткани, обеспечивающей механическую интеграцию сфероидов с использованием 3D-биопреобразования

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Подложке хряща и аналогов ткани кожи, используя Роман пассивного смешивания единицы техники для Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Изготовление пользовательских агарозы скважин для заполнения клеток и тканей кольцо самостоятельной сборки с использованием 3D-печатные формы

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Протоколы 3D биопечати желатина Methacryloyl Гидрогель на основе биоинков

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...

3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue

3D-биопечать мышиных кортикальные астроциты для инженерии невроходобной ткани

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also ...

Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting

Крупномасштабное автоматизированное производство сфероидов стволовых клеток, полученных из жировой ткани, для 3D-биопечати

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue ...

Ensemble Force Spectroscopy by Shear Forces

Ансамблевая силовая спектроскопия по силам сдвига

Single-molecule techniques based on fluorescence and mechanochemical principles provide superior sensitivity in biological sensing. However, due to the ...

Quantitative Characterization of Bioink Properties for Continuous DLP Printing

Quantitative Characterization of Liquid Photosensitive Bioink Properties for Continuous Digital Light Processing Based Printing

Quantitative Characterization of Liquid Photosensitive Bioink Properties for Continuous Digital Light Processing Based Printing (Video) | JoVE 

Количественная характеристика свойств жидких фоточувствительных биочернил для непрерывной цифровой обработки света

Precise printing fabrication of bioinks is a prerequisite for tissue engineering; the Jacobs working curve is the tool to determine the precise printing ...