Name: agarose fluid gels formed by shear processing during gelation for suspended 3d bioprinting
Uploaded: 2023-05-26T14:40:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Agarose Fluid Gels Formed by Shear Processing During Gelation for Suspended 3D Bioprinting at JoVE.com

Los autores desean agradecer al EPSRC (EP / L016346 / 1), MRC y la Alianza de Formación Doctoral Biosciences for Health por financiar y apoyar este trabajo.

NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, reactivos, equipos y software utilizados en este protocolo.
1. Preparación del lecho de suspensión de gel fluido
<ol><li>Prepare 1,000 ml de agarosa dispersa (0.5% p/v) agregando 5 g de agarosa en polvo a 1,000 ml de agua ultrapura (Tipo 1, >18 mΩ·cm-1) en una botella de vidrio de 2,000 ml.</li>
	<li>Agregue una barra agitadora magnética de 70 mm a la mezcla acuosa y asegure la tapa de la botella apretando primero completamente y luego aflojando un cuarto de vuelta.</li>
	<li>Disuelva y esterilice la mezcla colocando la botella de vidrio en la cesta del autoclave, cerrando la tapa y ejecutando un ciclo durante 15 minutos a 121 °C y 1 bar. NOTA: Este protocolo siempre se utiliza para soluciones de autoclave en pasos posteriores.</li>
	<li>Retire la botella del autoclave una vez que el autoclave se haya enfriado a 80 °C y colóquela en un agitador magnético (sin calentar), con la agitación ajustada a 800 rpm. PRECAUCIÓN: La botella y el líquido permanecen calientes.</li>
	<li>Enfriar el sol en condiciones ambientales, manteniendo una agitación constante, hasta que la temperatura sea inferior a su gel T (punto de gelificación), 32 °C.</li>
	<li>Retirar el frasco del agitador y conservarlo a 4 °C. NOTA: El gel líquido se puede almacenar hasta que sea necesario.</li>
</ol>2. Preparación de biotintas
<ol><li>Prepare una biotinta a base de gelan utilizando un sol al 1% (p/p) de goma gellan baja en acil en agua ultrapura (Tipo 1, >18 mΩ·cm-1).<ol><li>Pesar 0,5 g de polvo de gellan en un bote de pesaje.</li>
		<li>Agregue 49.5 g de agua ultrapura en una botella de vidrio de 100 ml, junto con un agitador magnético.</li>
		<li>Dobla el bote de pesaje que contiene gellan power por la mitad y agrega el polvo al agua lentamente, mientras revuelves constantemente.</li>
		<li>Disolver y esterilizar el sol con un autoclave y dejar enfriar a 20 °C.</li>
		<li>Conservar la biotinta a 4 °C hasta su uso posterior.</li>
	</ol></li>
	<li>Prepare una biotinta mezclada de pectina y colágeno en agua ultrapura (Tipo 1, >18 mΩ·cm-1).<ol><li>Preparar soluciones de pectina baja en metoxi al 5% (p/v) pesando 2,5 g de pectina en polvo en un bote de pesaje.</li>
		<li>Agregue 50 ml de agua ultrapura en una botella de vidrio de 100 ml, junto con un agitador magnético.</li>
		<li>Doble el bote de pesaje que contiene pectina por la mitad y agregue el polvo al agua lentamente, mientras revuelve constantemente.</li>
		<li>Autoclave la mezcla acuosa y enfriar a 20 °C.</li>
		<li>Prepare mezclas de pectina y colágeno 1:1 y 2:1 agregando 3 ml de la solución de pectina a 3 ml de solución de colágeno o agregando 4 ml de la solución de pectina a 2 ml de solución de colágeno, respectivamente. Mezclar suavemente las mezclas con una pipeta, retirando y dispensando la mezcla 10x. NOTA: Este procedimiento se realiza mejor utilizando materiales fríos sobre hielo para prevenir la gelificación prematura del colágeno. El enfriamiento previo de la pectina y el colágeno se puede lograr almacenando a 4 °C antes de mezclar.</li>
		<li>Conservar a 4 °C hasta su nuevo uso.</li>
	</ol></li>
	<li>Prepare una biotinta mezclada con alginato y colágeno en agua ultrapura (Tipo 1, >18 mΩ·cm-1).<ol><li>Pesar 2 g de polvo de alginato en un bote de pesaje.</li>
		<li>Agregue 50 ml de agua ultrapura en una botella de vidrio de 100 ml, junto con un agitador magnético.</li>
		<li>Doble el bote de pesaje que contiene el poder de alginato por la mitad y agregue el polvo al agua lentamente, mientras revuelve constantemente.</li>
		<li>Calentar la dispersión a 60 °C, bajo agitación constante, hasta que el alginato esté completamente disuelto (líquido claro, ligeramente marrón), y luego enfriar a 20 °C.</li>
		<li>Diluir la solución de alginato con medio de cultivo celular como el medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) agregando 25 ml de la solución de alginato a 25 ml de DMEM.</li>
		<li>Prepare mezclas de alginato y colágeno (1:1) agregando 3 ml de la solución de alginato/DMEM a 3 ml de solución de colágeno. Mezclar suavemente las mezclas con una pipeta retirando y dispensando la mezcla 10 veces y almacenar a 4 °C. NOTA: Este procedimiento se realiza mejor utilizando materiales fríos sobre hielo para prevenir la gelificación prematura del colágeno. El enfriamiento previo de la pectina y el colágeno se puede lograr almacenando a 4 °C antes de mezclar.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Caracterización reológica de biotintas
<ol><li>Encienda el reómetro, inserte geometrías dentadas de 40 mm y deje reposar durante 30 min.</li>
	<li>Ponga a cero la altura de separación del reómetro utilizando la función de altura de separación cero.</li>
	<li>Agregue ~ 2 ml de muestra en la placa inferior y baje la geometría superior para crear una altura de espacio de 1 mm.</li>
	<li>Recorte la muestra eliminando el exceso de material expulsado de entre las placas. Para hacer esto, use un borde plano y no abrasivo para alejar el exceso de líquido del espacio y empápese con papel de seda. NOTA: Los pasos 3.2-3.4 se repiten para cambiar la muestra antes de cada uno de los pasos siguientes.</li>
	<li>Realizar perfiles de viscometría para determinar la inyectabilidad de la biotinta.<ol><li>Seleccione la prueba de viscometría de las opciones de usuario .</li>
		<li>Introduzca los parámetros para una prueba de rampa controlada por velocidad de cizallamiento: 0,1 a 500 s-1, con un tiempo de rampa de 1 minuto.</li>
		<li>Repetir el ensayo de rampa de viscometría en muestras nuevas bajo control de tensión, utilizando las tensiones superior e inferior determinadas a partir del ensayo de rampa controlado por velocidad de cizallamiento en el paso 3.5.2.</li>
	</ol></li>
	<li>Realice pequeñas pruebas de deformación para determinar las características gelificantes de la biotinta.<ol><li>Seleccione pruebas oscilatorias en las opciones de usuario .</li>
		<li>Parámetros de entrada en una sola prueba de frecuencia bajo deformación constante: frecuencia 1 Hz, deformación 0,5% sobre 1 h, mientras la tinta se gelifica.</li>
	</ol></li>
	<li>Realizar mediciones in situ de amplitud y frecuencia en muestras gelificadas.<ol><li>Seleccione prueba oscilatoria en las opciones de usuario .</li>
		<li>Seleccione el barrido de amplitud e introduzca los parámetros para una prueba de barrido de amplitud controlada por deformación: 0,01 a 500%, a una frecuencia constante de 1 Hz .</li>
		<li>Cargue una nueva muestra y seleccione prueba oscilatoria de las opciones de usuario . Luego, seleccione la prueba de frecuencia y los parámetros de frecuencia de entrada entre 0.01 y 10 Hz y una deformación que se encuentre dentro de la región viscoelástica lineal (LVR) de los espectros determinados a partir de los datos de barrido de amplitud obtenidos en el paso 3.7.2 (típicamente un valor entre 50% y 80% del LVR).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Diseño e impresión de estructuras 3D utilizando una bioimpresora 3D
<ol><li>Inicie el software CAD para iniciar la generación de un modelo CAD.<ol><li>Seleccionar herramientas | Materiales en el software CAD para definir los parámetros de impresión para la biotinta elegida.</li>
		<li>Introducir parámetros de impresión relevantes para la impresora que se está utilizando; por ejemplo, para el descubrimiento 3D, ingrese el diámetro estimado del filamento (~ 200-500 μm para la mayoría de las biotintas) en la pestaña de espesor para determinar el grosor Z de cada capa. NOTA: La delaminación de la construcción final es indicativa de la necesidad de aumentar el valor del espesor, mientras que la pérdida de resolución resalta la necesidad de reducir el espesor.</li>
		<li>Diseñe la estructura deseada capa por capa utilizando las pestañas Capa del software. Agrupe las capas mediante la ficha Grupo y asigne cada capa a un nivel en el plano Z mediante la ficha Nivel.<ol><li>Por ejemplo, para generar una estructura reticular (utilizando una biotinta mezclada de alginato y colágeno preparada en el paso 2.3), cree una capa con los filamentos a lo largo del eje x y una segunda capa con los filamentos a lo largo del eje y. Asigne ambos a un nivel separado.</li>
		</ol></li>
		<li>En la pestaña Grupo , determine la altura de compilación seleccionando el número de unidades repetidas en la estructura.</li>
		<li>Haga clic en la herramienta Generar para crear un código G para el diseño y ver una representación 3D de la estructura.</li>
	</ol></li>
	<li>Cierre BioCAD e inicie el software de interfaz hombre-máquina (HMI) 3D Discovery para iniciar el proceso de impresión.<ol><li>Monte el cabezal de impresión de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Monte la microválvula en el cabezal de impresión y atornille la boquilla de extrusión elegida.</li>
		<li>Haga clic en la función Medición de longitud de aguja para calibrar el cabezal de impresión.</li>
		<li>Cargue un recipiente de cultivo (por ejemplo, una placa de 6 pocillos) en la plataforma de impresión.</li>
		<li>Alícuota la biotinta en el cartucho de impresión y atorníllela al cabezal de impresión por encima de la microválvula.</li>
		<li>Conecte el cabezal de impresión ensamblado al sistema de presión neumática y seleccione el cabezal de impresión en la HMI para acoplarlo.</li>
		<li>Haga clic en comprobar presión para permitir el ajuste de la presión de extrusión.</li>
		<li>Una vez que se haya seleccionado una presión adecuada (~ 30-120 kPa dependiendo de la resolución deseada), abra el código G generado anteriormente y haga clic en Ejecutar para iniciar el proceso de impresión.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Preparación de análogos cutáneos
<ol><li>Cultivar fibroblastos dérmicos humanos (HDF) y células madre derivadas de tejido adiposo (ADSC) en DMEM suplementados con suero fetal bovino (FBS) (10%), tampón HEPES (2,5%) y penicilina/estreptomicina (1%) en matraces T75 hasta alcanzar una confluencia del 90%. Cultive queratinocitos epidérmicos humanos (HEK) en medios de crecimiento de queratinocitos (KGM) hasta alcanzar una confluencia del 70% al 80%. Mantener todas las células en condiciones de 37 °C, 5% deCO2 y 95% de aire en una incubadora durante el cultivo.</li>
	<li>Para la preparación de HDF y ADSC para biotintas dérmicas y adiposas, lavar las células pipeteando suavemente 3 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) en matraces de aluminio, inclinar el matraz para girar el PBS sobre las células y aspirar, teniendo cuidado de no perturbar las células adheridas.<ol><li>Para levantar las células, pipetear 3 ml de enzima de disociación celular 1x en el matraz para cubrir las células y colocar el matraz en una incubadora durante 3 minutos, golpeando firmemente el matraz contra la palma de la mano para desalojar las células. Neutralizar la acción de la enzima utilizando 6 mL de DMEM completo. NOTA: Incubar durante otros 2 minutos si las células permanecen unidas después de golpear.</li>
		<li>Para la preparación de las biotintas dérmicas y adiposas, pipetear las suspensiones celulares en tubos separados de 15 ml y tomar 10 μL de cada uno para el recuento de células utilizando un hemocitómetro. Centrifugar las suspensiones celulares restantes a 300 × g durante 5 min para granular las células.</li>
		<li>Aspirar el sobrenadante, teniendo cuidado de no alterar el pellet, añadir la solución polimérica adecuada (preparada en la etapa 2.2) y mezclar con una estimulación suave pipeteando a las siguientes densidades:<ol><li>Para la capa adiposa, pipetear 5 × 105 ADSC mL-1 por 1:1 colágeno a mezcla de pectina.</li>
			<li>Para la capa papilar, pipetear 3 × 106 HDFs mL-1 por 2:1 colágeno a mezcla de pectina.</li>
			<li>Para la capa reticular, pipetear 1,5 × 106 HDFs mL-1 por 2:1 colágeno a mezcla de pectina.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Para imprimir, cargue cada biotinta en un cartucho separado e imprima la construcción en el gel fluido de soporte en una placa de Petri de vidrio de acuerdo con las instrucciones de la sección 4.<ol><li>Una vez completada la impresión, inyecte 2 ml de 200 mM de CaCl2∙2H2Oalrededor de la construcción y 3 ml de medios adipogénicos (DMEM completo suplementado con 500 μM de isobutil-metilxantina [IBMX], 50 μM de indometacina y 1 μM de dexametasona) en el gel fluido con una jeringa y una aguja. Coloque en una incubadora durante la noche.</li>
		<li>Al día siguiente, retire la construcción del baño de soporte con una espátula, lave suavemente en PBS y cultive durante 14 días en medio adipogénico en una placa de 6 pocillos.</li>
		<li>Después de 14 días, retire suficiente medio para crear una interfaz aire-líquido en la superficie del constructo y siembre 2 × 106 queratinocitos encima del constructo para crear una capa epidérmica.</li>
		<li>Cultivo adicional durante 1 semana antes del análisis.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Preparación del modelo de arteria carótida
<ol><li>Cargue la solución de biotinta de goma gellan (tal como se preparó en el paso 2.1) en un cartucho de impresora.</li>
	<li>Imprimir el modelo de arteria carótida dentro de una placa de Petri que contenga el material de soporte de gel líquido de acuerdo con las instrucciones de impresión de la sección 4.</li>
	<li>Una vez completada la impresión, inyecte 2 ml de 200 mM CaCl2∙2H2Oalrededor del constructo con una jeringa y una aguja.</li>
	<li>Después de un mínimo de 3 h, retire la construcción del baño de soporte con una espátula y lave suavemente en PBS.</li>
</ol>

<ol>
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Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Consideración de la selección de materiales utilizados para la cama de soporte Durante la etapa de desarrollo, se requirieron varias características de la cama de soporte. Estas características incluían: i) mantener una estructura suficiente para suspender el material extruido; ii) capacidad de adelgazamiento por cizallamiento para permitir que el cabezal de impresión se mueva libremente a través del material de soporte; iii) reestructuración rápida (propiedades autocurativas), formando soporte alrededor de la biotinta depositada; iv) térmicamente estable tanto a temperatura ambiente como a temperatura fisiológica; v) material neutro (es decir, sin carga) que es relativamente bioinerte, a través de un rango de pH y electrolitos (especies iónicas y concentraciones), evitando interacciones con células y biotintas cargadas; vi) no tóxico; y, vii) preferiblemente de una fuente no animal.
Aunque hay muchos materiales biopolímeros que mantienen varias de estas características inherentes, con una capacidad para realizar la fabricación aditiva 3D suspendida sin ajustarse a todas estas características 11,26,27, la intención aquí era producir una cama de soporte que superara ciertos problemas prácticos asociados con otros materiales de soporte. Debido a las propiedades químicas de la agarosa y, en particular, cuando se formula como un gel fluido de partículas, se pueden obtener todas estas características. Esto permitió una cama de soporte que podría usarse en una amplia variedad de biotintas23,24,25,28. De hecho, la naturaleza bioinerte del material proporcionó el potencial de mantener la estructura impresa in situ durante todo el cultivo, permitiendo escalas de tiempo suficientes para que muchas biotintas diferentes se desarrollen completamente, sin cambios en la biología. Además, la naturaleza particulada y adelgazante permitió una fácil eliminación de la construcción impresa final, mientras que el origen no tóxico y no animal permite el potencial de una rápida traducción hacia la clínica, superando las barreras relacionadas con los requisitos éticos y reglamentarios.
Consideraciones en la selección de materiales para las biotintas En la bioimpresión por extrusión directa, las biotintas se depositan en una cama de impresión 2D. Es beneficioso que las soluciones de biotinta monómera tengan un comportamiento de adelgazamiento por cizallamiento; Sin embargo, para producir construcciones de alta fidelidad con dimensiones fisiológicamente relevantes, deben tener baja tixotropía y recuperarse a viscosidades suficientemente altas para formar filamentos sólidos al deposición 29,30,31. Con el aumento de la viscosidad, la presión requerida para la extrusión es mucho mayor, a menudo influyendo negativamente en la viabilidad de la célula encapsulada31,32. La bioimpresión en suspensión elimina esta limitación, ya que el material extruido es soportado por el baño de suspensión durante toda la reticulación. Este desarrollo aumenta enormemente la gama de formulaciones de biotinta que se pueden utilizar. Por ejemplo, trabajos recientes han demostrado el uso de soluciones de colágeno de baja concentración que se imprimen en geometrías altamente complejas análogas a la estructura interna del corazón33,34,35. En las aplicaciones mencionadas en este método, la impresión incrustada permitió elegir las tintas de biomateriales para replicar mejor el entorno fisiológico para el que estaban destinadas, en lugar de por su capacidad de impresión.
Limitaciones en el tamaño de la estructura A lo largo de la literatura de biofabricación, se ha demostrado que diferentes tipos de bioimpresoras, impulsadas por tecnologías alternativas de cabezales de impresión, pueden incorporarse a las técnicas de fabricación integradas. La tecnología aquí demostrada no es diferente, con ejemplos que incluyen una bioimpresora neumática basada en microextrusión (INKREDIBLE), como lo demuestran Senior et al., y bioimpresoras basadas en extrusión con microválvulas controlables (3D Discovery)23. Aunque esto hace que la tecnología sea accesible para una gama de usuarios que ya poseen una bioimpresora, las limitaciones en el tamaño alcanzable de la estructura dependen en última instancia de las especificaciones de la bioimpresora en cuestión. Inicialmente, la principal restricción sobre la generación de grandes estructuras se define por el tamaño del lecho de impresión, los límites de las trayectorias X, Y y Z, y también el tamaño del recipiente en el que está contenido el gel fluido de soporte.
Limitaciones en la resolución Cuando se fabrican estructuras complejas de tamaño micrométrico, la resolución resultante depende en gran medida de la precisión de la impresora (control sobre el tamaño del paso, el grado de extrusión), el diámetro interno de la boquilla de impresión y una gama de parámetros de software ajustables, incluida la velocidad de impresión, la presión de impresión y la velocidad de flujo36. Además, el control sobre el tamaño de la gota parece ser fundamental para facilitar la generación de estructuras de alta resolución, con los mejores resultados observados en impresoras de extrusión con una microválvula controlable. En última instancia, cuando se optimizan todos los parámetros, se pueden lograr resoluciones de impresión para igualar, o incluso ser menores que, el diámetro interior de las boquillas de extrusión, con el filamento depositado del orden de la escala micrométrica37. Sin embargo, esto depende de la optimización de todos los parámetros de impresión mencionados anteriormente, y la resolución puede verse considerablemente limitada por el mecanismo de impresión y la precisión. La extrusión neumática, por ejemplo, no parece permitir la misma resolución de impresión que la extrusión con una microválvula controlable. Por lo tanto, existe una posible implicación en el costo de lograr la máxima resolución de impresión, ya que dichos sistemas incurren en un gasto significativamente mayor para el usuario.
Perspectivas futuras y potencial En este momento, existe un gran interés en torno al uso de procesos de fabricación suspendidos para permitir la producción de estructuras blandas complejas que contienen células incrustadas, y sin duda habrá avances significativos en los próximos años. Se da un avance continuo en la mejora de la resolución de impresión, aunque queda por ver cuán necesario será, dado que la mayoría de los sistemas biológicos son capaces de reorganizarse a nivel molecular. Si bien el foco de interés en los medios de comunicación gira en torno al uso de tejidos impresos en 3D para reemplazar directamente los tejidos humanos después de una lesión o enfermedad, cualquier procedimiento médico robusto habilitado por estos procesos está a algunos años de distancia38,39. Es más probable que el impacto de estos complejos sistemas de cultivo sea en la detección de fármacos o incluso utilizados como herramientas, para mejorar nuestra comprensión de los procesos biológicos38. En particular, la biología del desarrollo podría beneficiarse enormemente aquí, donde el control preciso sobre la deposición especial de moléculas permitirá a los investigadores explorar el papel de los sistemas multifactoriales en los procesos de desarrollo de tejidos.

Los hidrogeles son materiales perfectos para usar como soportes para el crecimiento celular1. Dependiendo del material utilizado, se gelifican a través de mecanismos suaves que no comprometen la viabilidad celular 2,3. El alto contenido de agua (típicamente >90%) significa que los nutrientes y el oxígeno pueden difundirse fácilmente en el material y los productos de desecho del metabolismo celular se difunden4. Como tal, se ha demostrado que la viabilidad celular se conserva por períodos superiores a 1 año5, y ahora hay ejemplos de hidrogeles que se utilizan para almacenar o "pausar" células para uso terapéutico futuro6. Han sido ampliamente utilizados en ingeniería de tejidos para la producción de estructuras similares a tejidos, pero su uso tiende a estar limitado por la dificultad de controlar tanto la estructura como la composición del material. Históricamente, la resistencia del hidrogel es comparativamente baja (en relación con muchos tejidos duros), debido al alto contenido de agua y los bajos volúmenes ocupados por la matriz polimérica que forma la estructura. Además, muchas rutas de gelificación (térmica, ionotrópico, fibrilogénesis) ofrecen una cinética razonablemente lenta, lo que significa que sus propiedades mecánicas tienden a desarrollarse constantemente con el tiempo. Con la excepción de las redes interpenetrantes, la baja rigidez mecánica y los tiempos de curado lentos a menudo dan como resultado biotintas que no pueden resistir libremente en la deposición, tendiendo a "hundirse" y perder definición cuando se extruyen inicialmente.
En un intento por superar este problema clave, se han desarrollado técnicas de impresión integradas que proporcionan soporte durante la impresión, mientras que las propiedades mecánicas de la construcción se están desarrollando 7,8. Una vez que la microestructura del gel se ha desarrollado completamente y las propiedades mecánicas alcanzan un óptimo, la matriz de soporte se puede eliminar, generalmente mediante un lavado suave o la fusión de la fase de soporte. El trabajo inicial sobre este enfoque utilizó una dispersión plurónica viscosa en la que se distribuyó la fase secundaria9. Más recientemente, Bhattacharjee et al. utilizaron geles en forma de carbunol granulado para demostrar que las matrices de células podrían suspenderse en el gel de soporte10. Posteriormente, Hinton et al. informaron sobre la extrusión de materiales a base de gel que contenían células en un lecho de soporte que consistía en una suspensión de microgel formada a partir de gelatina granular11. Después de la extrusión del hidrogel que contiene células y su posterior curado, la gelatina se eliminó mediante un calentamiento suave del baño de soporte, lo que permitió la fusión de la gelatina. Desafortunadamente, este proceso todavía presenta varias limitaciones. Por ejemplo, la estructura química de la gelatina en comparación con el colágeno (por lo tanto, al ser una forma hidrolizada de colágeno) es tal que muchas partes químicas a través de su columna vertebral pueden interactuar con entidades biológicas; Por lo tanto, una matriz de soporte residual podría interferir con los procesos biológicos posteriores. Además, los productos derivados de animales plantean un uso restrictivo cuando se mira hacia la traducibilidad de una tecnología. Esto crea desafíos si la pieza fabricada está destinada a ser utilizada clínicamente, o incluso si se va a utilizar para responder preguntas biológicas fundamentales, donde esta contaminación de la superficie puede causar un problema importante.
Posteriormente hemos creado un proceso refinado que permite la fabricación suspendida de hidrogeles, dentro de una matriz de soporte, que no tiene carga en condiciones fisiológicas y está formada por materiales no animales. Aunque el proceso se puede utilizar con una gama de soportes biopoliméricos, la agarosa proporciona un material que es inerte a las interacciones biológicas, ya que es a base de azúcar y se carga de forma neutra a pH fisiológico12,13. En lugar de fragmentar un gel ya existente, el material de soporte se forma mediante la aplicación de cizallamiento durante la gelificación14,15,16. Esto produce una matriz de partículas que exhiben características similares al dendrón en su superficie y se dispersan en una matriz secundaria de polímero no gelificado17,18. El resultado es un material con propiedades de material interesantes 19,20,21,22 que puede adelgazarse de manera similar a los geles granulares previamente reportados, pero tiende a recuperar la viscosidad más rápidamente cuando se elimina el cizallamiento 23. Una vez que el material portador de células extruido en la matriz de soporte ha madurado completamente, la matriz de soporte se puede eliminar mediante una agitación suave antes de colocarse en cultivo. Se ha demostrado que es posible utilizar este proceso para producir materiales con estructuras complejas y recapitular las estructuras biológicas tanto de la piel como de la región osteocondral23,24,25. Este documento de métodos describe en detalle cómo fabricar el material de soporte y destaca las biotintas apropiadas utilizadas dentro de una variedad de estructuras complejas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D Discovery Bioprinter</td>
			<td>RegenHU</td>
			<td>BIOFACTORY</td>
			<td>Microvalve extrusion bioprinter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>9012-36-6</td>
			<td>Material used to create fluid gel support baths&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop autoclave</td>
			<td>Prestige Medical</td>
			<td>B8L75814</td>
			<td>Classic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Blue G</td>
			<td>Merck</td>
			<td>6104-58-1</td>
			<td>Dye used to stain structures&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>10035-04-8</td>
			<td>Used to reticulate printed structures&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>D4902-25MG</td>
			<td>Used in adipogenic media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Merck</td>
			<td>D6429</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duran&#160; bottle&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z305219</td>
			<td>glass bottle&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS XL Core Imaging System</td>
			<td>EVOS&#8482;</td>
			<td>AMEX1000</td>
			<td>Brightfield microscope with phase contrast</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10500-064</td>
			<td>Cell culture media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gellan gum</td>
			<td>Special Ingredients</td>
			<td>5060341112638</td>
			<td>Low Acyl Gellan gum used to make the bioink for the corotid artery model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H9897-10PAK</td>
			<td>Buffer for cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>I7378</td>
			<td>Used in adipogenic media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isobutyl-methylxanthine (IBMX)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>I7018-100MG</td>
			<td>Used in adipogenic media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte growth medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>00192060</td>
			<td>Used as media to culture keratinocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Methoxy Pectin</td>
			<td>CP Kelco</td>
			<td>LM-5CS</td>
			<td>Pectin used to make pectin/collagen blends</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td>Used to inhibit bacterial growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureCol EZ Gel solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>5074</td>
			<td>Collagen solution used to make alginate/collagen blends</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Alginate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>9005-38-3</td>
			<td>Alginate powder used to make alginate/collagen blends&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE select&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12563011</td>
			<td>cell dissociation enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Flasks</td>
			<td>StarLab</td>
			<td>CC7682-4175</td>
			<td>Used for culturing cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

agarose fluid gels formed by shear processing during gelation for suspended 3d bioprinting

El uso de matrices granulares para soportar piezas durante el proceso de bioimpresión fue reportado por primera vez por Bhattacharjee et al. en 2015, y desde entonces, se han desarrollado varios enfoques para la preparación y el uso de lechos de gel de soporte en bioimpresión 3D. Este documento describe un proceso para fabricar suspensiones de microgel utilizando agarosa (conocidos como geles fluidos), en el que la formación de partículas se rige por la aplicación de cizallamiento durante la gelificación. Dicho procesamiento produce microestructuras cuidadosamente definidas, con propiedades de material posteriores que imparten distintas ventajas como la incorporación de medios de impresión, tanto química como mecánicamente. Estos incluyen comportarse como materiales sólidos viscoelásticos a cero cizallamiento, limitar la difusión de largo alcance y demostrar el comportamiento característico de adelgazamiento por cizallamiento de los sistemas floculados. 
Sin embargo, al eliminar el esfuerzo cortante, los geles fluidos tienen la capacidad de recuperar rápidamente sus propiedades elásticas. Esta falta de histéresis está directamente relacionada con las microestructuras definidas anteriormente aludidas; Debido al procesamiento, las cadenas de polímeros reactivos no gelificados en la interfaz de partículas facilitan las interacciones entre partículas, similares a un efecto Velcro. Esta rápida recuperación de las propiedades elásticas permite bioimprimir piezas de alta resolución a partir de biomateriales de baja viscosidad, ya que la rápida reforma del lecho de soporte atrapa la biotinta in situ, manteniendo su forma. Además, una ventaja de los geles fluidos de agarosa son las transiciones asimétricas de gelificación/fusión (temperatura de gelificación de ~30 °C y temperatura de fusión de ~90 °C). Esta histéresis térmica de la agarosa permite imprimir y cultivar la pieza bioimpresa in situ sin que el gel fluido de soporte se derrita. Este protocolo muestra cómo fabricar geles fluidos de agarosa y demuestra su uso para apoyar la producción de una gama de piezas complejas de hidrogel dentro de la fabricación de aditivos de capa suspendida (SLAM).

Alginato y biotinta de colágeno tipo I Se observó que la resolución de impresión (registrada en función del diámetro del filamento) era directamente ajustable a través de cambios en la presión de extrusión (Figura 1A-C). La presión de extrusión y la resolución de impresión se relacionaron directamente con los diámetros de filamento más pequeños generados a través de la impresión a una presión de extrusión de 30 kPa. Curiosamente, a una presión de extrusión de 30 kPa, se podían generar filamentos que coincidían con el diámetro interno de la boquilla de extrusión (diámetro medio del filamento: 323 μm ± 50 μm; diámetro de la boquilla: 300 μm), lo que sugiere que se podría lograr una "resolución máxima". Además, los parámetros de impresión para esta resolución podrían aplicarse con éxito a la generación de un tubo vascular alginato/colágeno que puede ser extraído y perfundido (Figura 1D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64458/64458fig01.jpg"> Figura 1: Generación de impresiones de alta resolución mediante SLAM. Adaptación de la resolución de impresión de celosías de alginato/colágeno en función del diámetro del filamento mediante extrusión a (A) 30 kPa, (B) 60 kPa y (C) 120 kPa. (D) Generación de un tubo vascular alginato/colágeno. Barras de escala = 400 μm (A-C), 10 mm (D). Abreviatura: SLAM = fabricación aditiva de capa suspendida. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64458/64458fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Análogos de la piel SLAM también se utilizó para crear una estructura similar a la piel (Figura 2A) utilizando una biotinta formada a partir de una mezcla de colágeno I y pectina. Para lograr un gradiente de propiedades mecánicas similares a las encontradas en la piel, se utilizaron diferentes proporciones de pectina y colágeno en las capas dérmica (5% p/p pectina mezclada a 2:1 con un stock de colágeno de 5 mg∙mL−1) e hipodérmica (5% p/p pectina mezclada a 1:1 con un stock de colágeno de 5 mg∙mL−1). La estructura resultante (Figura 2Bi-Bii) estaba bien integrada después de la inmersión en DMEM, sin signos de delaminación. Es importante destacar que hubo un alto nivel de viabilidad celular en toda la estructura (Figura 2Biii) después de un período de 14 días de cultivo. Curiosamente, durante el período de cultura, los materiales se endurecieron24, lo que indica una remodelación del material.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64458/64458fig02.jpg"> Figura 2: Producción de una estructura similar a la piel. (A) Un esquema que muestra cómo se utilizó el proceso SLAM para producir una estructura en capas incrustada con fibroblastos dérmicos humanos. El lecho suspendido aquí se fabricó a partir de partículas formadas a partir de agarosa, mientras que las capas hipodérmicas y dérmicas se formaron con proporciones variables de pectina y colágeno I. (B) La estructura en capas estaba destinada a representar la estructura tricapa de la piel (i). Con éxito en la replicación de esta estructura (ii), se observaron altos niveles de viabilidad celular en todas las muestras, como lo demuestra la tinción de calceína-AM (iii). Barra de escala = 5 mm (Bii). Abreviatura: SLAM = fabricación aditiva de capa suspendida. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64458/64458fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Carótida Para ampliar los límites del método, se produjo una selección de impresiones más complejas. En uno de estos ejemplos, se imprimió una arteria carótida bifurcada utilizando biotinta gellan al 1% (Figura 3A), que luego se reticuló mediante extrusión de 200 mM CaCl2 dentro del lecho de gel fluido (Figura 3B) y simplemente se levantó del soporte después de la gelificación (Figura 3C). A pesar de las soluciones de impresión precursoras que exhibían baja viscosidad, la cama de soporte tuvo éxito en permitir la producción de la geometría compleja. La arteria conservó su estructura durante la deposición, la reticulación y la extracción (Figura 3), sin la necesidad de modificar los códigos de impresión para incorporar andamios adicionales.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64458/64458fig03.jpg"> Figura 3: Proceso de fabricación de la arteria carótida gellan utilizando SLAM. (A) Extrusión de gellan dentro del lecho de gel fluido durante la impresión, (B) impresión completa de la arteria carótida dentro del gel fluido durante la reticulación, y (C) modelo final de la arteria carótida después de la recuperación del soporte de gel fluido. Barras de escala = 10 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64458/64458fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Agarose Fluid Gels Formed by Shear Processing During Gelation for Suspended 3D Bioprinting

El procesamiento por cizallamiento durante la formación de hidrogel da como resultado la producción de suspensiones de microgel que se adelgazan pero se reestructuran rápidamente después de la eliminación de las fuerzas de cizallamiento. Tales materiales se han utilizado como una matriz de soporte para bioimpresión compleja, estructuras cargadas de células. Aquí se describen los métodos utilizados para fabricar la cama de soporte y las biotintas compatibles.

Geles fluidos de agarosa formados por procesamiento de cizallamiento durante la gelificación para bioimpresión 3D suspendida

The use of granular matrices to support parts during the bioprinting process was first reported by Bhattacharjee et al. in 2015, and since then, several ...

La capacidad de utilizar diferentes biotintas es primordial para el desarrollo exitoso de estructuras bioimpresas, y esta tecnología facilita el uso de materiales que generalmente son incompatibles con las técnicas de impresión convencionales. El medio de suspensión evita el colapso de las biotintas de baja viscosidad cuando se depositan, y permite la integración de diferentes biotintas dentro de una sola construcción para crear variaciones regionales en las propiedades químicas y mecánicas que son más parecidas al tejido nativo. Demostrando el procedimiento estarán el Dr. Tom Robertson, investigador de la Universidad de Birmingham, y la Dra. Jessica Senior, investigadora de la Universidad de Huddersfield.Para comenzar, encienda el reómetro e inserte geometrías dentadas de 40 milímetros, dejándolo reposar durante 30 minutos. Ponga a cero la altura de separación del reómetro utilizando la función de altura de separación cero. Agregue aproximadamente dos mililitros de muestra en la placa inferior y baje la geometría superior para crear una altura de espacio de un milímetro.Recorte la muestra eliminando el exceso de material expulsado de entre las placas utilizando un borde plano y no abrasivo para alejar el exceso de líquido del espacio y empápese con papel de seda. Para determinar la inyectabilidad de la biotinta, realice perfiles de viscometría seleccionando Prueba de viscometría entre las opciones de usuario. Introduzca los parámetros para una prueba de rampa controlada por velocidad de cizallamiento de 0,1 a 500 por segundo con un tiempo de rampa de un minuto.Cargue una nueva muestra y repita el proceso para garantizar la reproducibilidad. Para determinar las características gelificantes de la biotinta, se realizaron pequeñas pruebas de deformación seleccionando las pruebas oscilatorias de las opciones de usuario. Parámetros de entrada en una sola prueba de frecuencia bajo deformación constante, como la frecuencia de un hercio, deformación del 0,5% durante una hora mientras la tinta se gelifica.Repita la prueba de rampa de viscometría en muestras nuevas bajo control de tensión utilizando las tensiones superior e inferior determinadas a partir de la prueba de rampa controlada por velocidad de cizallamiento en paso como se demostró anteriormente. Para realizar mediciones in situ de amplitud y frecuencia en muestras gelificadas, seleccione una prueba oscilatoria de las opciones de usuario. Después de seleccionar el barrido de amplitud, ingrese los parámetros para una prueba de barrido de amplitud que se controla a deformación de 0.01 a 500% a una frecuencia constante de un hercio.Después de completar la prueba, analice los espectros para determinar la región viscoelástica lineal. Cargue una nueva muestra en el reómetro y deje que se gelifique. A continuación, seleccione una prueba oscilatoria de las opciones de usuario.Seleccionar parámetros de ensayo de frecuencia y frecuencia de entrada entre 0,01 y 10 hercios y una deformación dentro de la región viscoelástica lineal de los espectros determinada a partir de los datos de barrido de amplitud obtenidos previamente. Para iniciar el software CAD e iniciar la generación de un modelo CAD, seleccione la opción Herramientas y, a continuación, haga clic en Materiales en el software CAD para definir los parámetros de impresión para la biotinta elegida. Introduzca el diámetro estimado del filamento en la ficha Espesor para determinar el grosor z de cada capa.Para diseñar la estructura capa por capa, utilice las fichas Capa del software, agrupe las capas mediante la ficha Grupo y asigne cada capa a un nivel en el plano z mediante la ficha Nivel. Genere una estructura de celosía creando una capa con los filamentos a lo largo del eje x y una segunda capa a lo largo del eje y y asigne ambos a un nivel separado. En la pestaña Grupo, determine la altura de compilación seleccionando el número de unidades repetidas en la estructura.A continuación, haga clic en la herramienta Generar para crear un código G para el diseño y ver un renderizado 3D de la estructura. En la bioimpresora, alícuota la biotinta en el cartucho de impresión y atorníllela en el cabezal de impresión por encima de la microválvula. A continuación, haga clic en la función de medición de longitud de la aguja para calibrar el cabezal de impresión.A continuación, conecte el cabezal de impresión ensamblado al sistema de presión neumática y cargue el recipiente de cultivo en la plataforma de impresión. Una vez que se haya seleccionado una presión adecuada, abra el código G generado anteriormente y haga clic en Ejecutar para iniciar el proceso de impresión. Una vez que se complete la impresión de la arteria carótida, use una jeringa y una aguja para inyectar dos mililitros de cloruro de calcio 200 milimolares dihidratados alrededor de la construcción.Después de un mínimo de tres horas, retire la cama de soporte de gel líquido de alrededor de la construcción y lávela suavemente en PBS. Luego retire la construcción del baño de soporte con una espátula. Se observó la adaptación de la resolución de impresión de las redes de alginato y colágeno en función del diámetro del filamento mediante extrusión a 30, 60 y 120 kilopascales y los resultados demostraron que la resolución era directamente ajustable con los cambios en la presión de extrusión.Para lograr un gradiente de propiedades mecánicas similares a las encontradas en la piel, se utilizaron diferentes proporciones de pectina y colágeno en las capas dérmica e hipodérmica, dando como resultado una estructura sin signos de delaminación. Se observó un alto nivel de viabilidad celular en toda la estructura después de 14 días de cultivo durante los cuales los materiales se endurecieron, lo que indica la remodelación del material. Para la reología, es importante que la muestra se cargue correctamente para garantizar datos reproducibles, y para la bioimpresión, es importante que la estructura esté completamente reticulada antes de retirarla del lecho de soporte.El cultivo de construcciones de tejido a gran escala durante períodos prolongados ayuda a explorar la respuesta de las células incrustadas a los estímulos físicos y químicos.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Ingeniería 3D Cellularized colágeno Geles para Vascular Regeneración Tisular

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Investigación

Bioingeniería

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Preparación de geles de colágeno en 3D y microcanales para el estudio de las interacciones 3D<em&gt; En Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

Creación de tejido cardiaco que exhibe la integración mecánica de esferoides usando bioprinting 3D

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting de cartílago y piel análogos de tejido utilizando un pasivo novela mezcla de unidad técnica de Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Fabricación de pozos de agarosa personalizado para la siembra de células y tejido anillo autoensamblaje con moldes impresa en 3D

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Protocolos de Bioimpresión 3D de Bioinks basados en Gelatin Methacryloyl Hydrogel

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...

3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue

Bioimpresión 3D de astrocitos corticales murinos para la ingeniería de tejido neural

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also ...

Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting

Producción automatizada a gran escala de esferoides de células madre derivadas de tejido adiposo para bioimpresión 3D

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue ...

Ensemble Force Spectroscopy by Shear Forces

Espectroscopía de fuerza de conjunto por fuerzas de cizallamiento

Single-molecule techniques based on fluorescence and mechanochemical principles provide superior sensitivity in biological sensing. However, due to the ...

Quantitative Characterization of Bioink Properties for Continuous DLP Printing

Quantitative Characterization of Liquid Photosensitive Bioink Properties for Continuous Digital Light Processing Based Printing

Quantitative Characterization of Liquid Photosensitive Bioink Properties for Continuous Digital Light Processing Based Printing (Video) | JoVE 

Caracterización cuantitativa de las propiedades de la biotinta fotosensible líquida para la impresión basada en el procesamiento digital continuo de la luz

Precise printing fabrication of bioinks is a prerequisite for tissue engineering; the Jacobs working curve is the tool to determine the precise printing ...