Name: agarose fluid gels formed by shear processing during gelation for suspended 3d bioprinting
Uploaded: 2023-05-26T14:40:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Agarose Fluid Gels Formed by Shear Processing During Gelation for Suspended 3D Bioprinting at JoVE.com

Författarna vill tacka EPSRC (EP/L016346/1), MRC och Doctoral Training Alliance Biosciences for Health för finansiering och stöd till detta arbete.

OBS: Se materialförteckningen för detaljer relaterade till alla material, reagens, utrustning och programvara som används i detta protokoll.
1. Beredning av suspensionsbädden för vätskegel
<ol><li>Bered 1 000 ml dispergerad agaros (0,5 % vikt/volym) genom att tillsätta 5 g agarospulver till 1 000 ml ultrarent vatten (typ 1, >18 mΩ · cm-1) i en 2 000 ml glasflaska.</li>
	<li>Tillsätt en 70 mm magnetomrörare till vattenblandningen och säkra flasklocket genom att först dra åt helt och sedan lossa ett kvarts varv.</li>
	<li>Lös upp och sterilisera blandningen genom att placera glasflaskan i autoklavens korg, stäng locket och kör en cykel i 15 minuter vid 121 °C och 1 Bar. OBS: Detta protokoll används alltid för autoklaveringslösningar i ytterligare steg.</li>
	<li>Ta ut flaskan ur autoklaven när autoklaven har svalnat till 80 °C och placera den på en magnetomrörare (ouppvärmd) med omrörningen inställd på 800 varv/min. VARNING: Flaskan och vätskan förblir varma.</li>
	<li>Kyl solen under omgivande förhållanden under konstant omrörning tills temperaturen är lägre än T-gelen (gelningspunkten), 32 °C.</li>
	<li>Ta ut flaskan ur omröraren och förvara den vid 4 °C. OBS: Vätskegelen kan förvaras tills den behövs.</li>
</ol>2. Beredning av biobläck
<ol><li>Bered ett gellanbaserat biobläck med en 1 % (w/w) sol med lågt acyl gellangummi i ultrarent vatten (typ 1, >18 mΩ·cm-1).<ol><li>Väg upp 0,5 g gellanpulver i en vägningsbåt.</li>
		<li>Tillsätt 49,5 g ultrarent vatten i en 100 ml glasflaska, tillsammans med en magnetomrörare.</li>
		<li>Vik vågbåten som innehåller gellankraft på mitten och tillsätt pulvret långsamt i vattnet under konstant omrörning.</li>
		<li>Lös upp och sterilisera solen med en autoklav och låt den svalna till 20 °C.</li>
		<li>Förvara biobläcket vid 4 °C tills vidare användning.</li>
	</ol></li>
	<li>Bered ett pektin-kollagenblandat biobläck i ultrarent vatten (typ 1, >18 mΩ·cm-1).<ol><li>Bered 5 % (vikt/volym) pektinlösningar med låg metoxihalt genom att väga upp 2,5 g pektinpulver i en vågbåt.</li>
		<li>Tillsätt 50 ml ultrarent vatten i en 100 ml glasflaska, tillsammans med en magnetomrörare.</li>
		<li>Vik vågbåten som innehåller pektinkraft i hälften och tillsätt pulvret långsamt i vattnet under konstant omrörning.</li>
		<li>Autoklav vattenblandningen och låt svalna till 20 °C.</li>
		<li>Bered 1:1 och 2:1 pektin-kollagenblandningar genom att antingen tillsätta 3 ml pektinlösning till 3 ml kollagenlösning eller genom att tillsätta 4 ml pektinlösning till 2 ml kollagenlösning. Blanda försiktigt blandningarna med en pipett genom att dra upp och fördela blandningen 10x. OBS: Denna procedur utförs bäst med kalla material på is för att förhindra för tidig gelering av kollagenet. Förkylning av pektin och kollagen kan uppnås genom lagring vid 4 °C före blandning.</li>
		<li>Förvaras vid 4 °C tills vidare användning.</li>
	</ol></li>
	<li>Bered ett alginat-kollagenblandat biobläck i ultrarent vatten (typ 1, >18 mΩ·cm-1).<ol><li>Väg upp 2 g alginatpulver i en vägningsbåt.</li>
		<li>Tillsätt 50 ml ultrarent vatten i en 100 ml glasflaska, tillsammans med en magnetomrörare.</li>
		<li>Vik vågbåten som innehåller alginatkraft i hälften och tillsätt pulvret långsamt i vattnet under konstant omrörning.</li>
		<li>Värm dispersionen till 60 °C under konstant omrörning tills alginatet är helt upplöst (klar, lätt brun vätska) och låt sedan svalna till 20 °C.</li>
		<li>Späd alginatlösningen med cellodlingsmedium såsom Dulbeccos modifierade örnmedium (DMEM) genom att tillsätta 25 ml alginatlösning till 25 ml DMEM.</li>
		<li>Bered alginat-kollagenblandningar (1:1) genom att tillsätta 3 ml alginat/DMEM-lösning till 3 ml kollagenlösning. Blanda försiktigt blandningarna med en pipett genom att dra upp och fördela blandningen 10x och förvara vid 4 °C. OBS: Denna procedur utförs bäst med kalla material på is för att förhindra för tidig gelering av kollagenet. Förkylning av pektin och kollagen kan uppnås genom lagring vid 4 °C före blandning.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Reologisk karakterisering av biobläck
<ol><li>Slå på reometern, sätt in 40 mm tandade geometrier och låt stå i 30 minuter.</li>
	<li>Nollställ reometerns gaphöjd med nollgapshöjdsfunktionen.</li>
	<li>Tillsätt ~ 2 ml prov på bottenplattan och sänk den övre geometrin för att skapa en gaphöjd på 1 mm.</li>
	<li>Putsa provet genom att avlägsna överflödigt material som avlägsnats mellan plattorna. För att göra detta, använd en platt, icke-slipande kant för att dra överflödig vätska bort från gapet och suga upp med silkespapper. Steg 3.2-3.4 upprepas för att ändra exemplet före vart och ett av följande steg.</li>
	<li>Genomföra viskometriprofiler för att bestämma biobläckets injicerbarhet.<ol><li>Välj viskometritest bland användaralternativen .</li>
		<li>Ange parametrarna för ett skjuvhastighetskontrollerat ramptest: 0,1 till 500 s-1, med en ramptid på 1 minut.</li>
		<li>Upprepa viskometriramptestet på nya provexemplar under spänningskontroll med användning av de övre och nedre spänningar som bestämts från det skjuvhastighetsstyrda ramptestet i steg 3.5.2.</li>
	</ol></li>
	<li>Utför små deformationstester för att bestämma biobläckets gelningsegenskaper.<ol><li>Välj oscillerande testning från användaralternativen .</li>
		<li>Mata in parametrar i ett enda frekvenstest under konstant belastning: frekvens 1 Hz, sil 0,5% över 1 h, medan bläckgelerna.</li>
	</ol></li>
	<li>Utför amplitud- och frekvensmätningar in situ på gelade prover.<ol><li>Välj oscillerande test från användaralternativen .</li>
		<li>Välj amplitudsvep och mata in parametrarna för ett amplitudsveptest som är töjningskontrollerat: 0,01 till 500 % vid en konstant frekvens på 1 Hz .</li>
		<li>Läs in ett nytt prov och välj oscillerande test från användaralternativen . Välj sedan frekvenstest och ingångsfrekvensparametrar mellan 0,01 och 10 Hz och en töjning som ligger inom spektras linjära viskoelastiska område (LVR) bestämt från amplitudsvepdata erhållna i steg 3.7.2 (vanligtvis ett värde mellan 50% och 80% av LVR).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Designa och skriva ut 3D-strukturer med en 3D-bioprinter
<ol><li>Starta CAD-programvara för att starta genereringen av en CAD-modell .<ol><li>Välj Verktyg | Material i CAD-programmet för att definiera utskriftsparametrarna för det valda biobläcket.</li>
		<li>Parametrar för inmatning av utskrift som är relevanta för den skrivare som används. till exempel, för 3D-upptäckt, mata in den uppskattade filamentdiametern (~ 200-500 μm för de flesta biobläck) på tjockleksfliken för att bestämma Z-tjockleken för varje lager. OBS: Delaminering av den slutliga konstruktionen indikerar ett behov av att öka tjockleksvärdet, medan förlust av upplösning belyser behovet av att minska tjockleken.</li>
		<li>Designa önskad struktur lager för lager med hjälp av flikarna Lager i programvaran. Gruppera lagren med hjälp av fliken Gruppera och tilldela varje lager till en nivå på Z-planet med hjälp av fliken Nivå .<ol><li>Till exempel, för att generera en gitterstruktur (med användning av ett alginat-kollagenblandat biobläck framställt i steg 2.3), skapa ett lager med filamenten längs x-axeln och ett andra lager med filamenten längs y-axeln. Tilldela båda till en separat nivå.</li>
		</ol></li>
		<li>Under fliken Grupp bestämmer du bygghöjden genom att välja antalet upprepade enheter i strukturen.</li>
		<li>Klicka på verktyget Generera om du vill skapa en G-kod för designen och visa en 3D-rendering av strukturen.</li>
	</ol></li>
	<li>Stäng BioCAD och starta programvaran 3D Discovery human-machine interface (HMI) för att initiera utskriftsprocessen.<ol><li>Montera skrivhuvudet enligt tillverkarens instruktioner. Montera mikroventilen på skrivhuvudet och skruva in det valda extruderingsmunstycket.</li>
		<li>Klicka på funktionen Nållängdsmätning för att kalibrera skrivhuvudet.</li>
		<li>Lasta ett odlingskärl (t.ex. en 6-brunnsplatta) på tryckplattformen.</li>
		<li>Alikvotera biobläcket i bläckpatronen och skruva fast i skrivhuvudet ovanför mikroventilen.</li>
		<li>Anslut det monterade skrivhuvudet till det pneumatiska trycksystemet och välj skrivhuvudet på HMI för att aktivera.</li>
		<li>Klicka på kontrolltrycket för att tillåta inställning av extruderingstrycket.</li>
		<li>När ett lämpligt tryck har valts (~ 30-120 kPa beroende på önskad upplösning), öppna G-koden som genererades tidigare och klicka på Kör för att starta utskriftsprocessen.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Beredning av hudanaloger
<ol><li>Odla humana dermala fibroblaster (HDF) och fetthärledda stamceller (ADSC) i DMEM kompletterat med fetalt bovint serum (FBS) (10%), HEPES-buffert (2,5%) och penicillin/streptomycin (1%) i T75-kolvar tills 90% sammanflöde uppnås. Odla humana epidermala keratinocyter (HEK) i keratinocyttillväxtmedier (KGM) tills 70% -80% sammanflöde uppnås. Håll alla celler under förhållanden på 37 °C, 5%CO2 och 95% luft i en inkubator under odlingen.</li>
	<li>För beredning av HDF och ADSC för hud- och fettbiobläck, tvätta cellerna genom att försiktigt pipettera 3 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i kolvar, luta kolven för att virvla PBS över cellerna och aspirera, var försiktig så att de bifogade cellerna inte störs.<ol><li>För att lyfta cellerna, pipettera 3 ml 1x celldissociationsenzym i kolven för att täcka cellerna och placera kolven i en inkubator i 3 minuter, knacka kolven ordentligt mot handflatan för att lossa cellerna. Neutralisera enzymets verkan med 6 ml komplett DMEM. OBS: Inkubera i ytterligare 2 minuter om cellerna förblir fästa efter knackning.</li>
		<li>För beredning av hud- och fettbiobläck, pipettera cellsuspensionerna i separata 15 ml rör och ta 10 μl från var och en för cellräkning med hjälp av en hemocytometer. Centrifugera de återstående cellsuspensionerna vid 300 × g i 5 minuter för att pellet cellerna.</li>
		<li>Aspirera supernatanten, var försiktig så att pelleten inte störs, tillsätt lämplig polymerlösning (beredd i steg 2.2) och blanda med försiktig stimulering genom pipettering med följande densiteter:<ol><li>För fettskiktet, pipettera 5 × 105 ADSCs ml-1 per 1:1 kollagen till pektinblandning.</li>
			<li>För papillärskiktet, pipettera 3 × 106 HDF ml-1 per 2: 1 kollagen till pektinblandning.</li>
			<li>För det retikulära skiktet, pipettera 1,5 × 106 HDF ml-1 per 2: 1 kollagen till pektinblandning.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>För att skriva ut, ladda varje biobläck i en separat patron och skriv ut konstruktionen i stödvätskegelen i en petriskål av glas enligt instruktionerna i avsnitt 4.<ol><li>När utskriften är klar injiceras 2 ml 200 mM CaCl2∙2H2Orunt konstruktionen och 3 ml adipogent medium (komplett DMEM kompletterat med 500 μM isobutylmetylxantin [IBMX], 50 μM indometacin och 1 μM dexametason) i vätskegelen med en spruta och nål. Placera i en inkubator över natten.</li>
		<li>Följande dag, ta bort konstruktionen från stödbadet med en spatel, tvätta försiktigt i PBS och odla i 14 dagar i adipogent medium i en 6-brunnsplatta.</li>
		<li>Efter 14 dagar, ta bort tillräckligt med medium för att skapa ett luft-vätskegränssnitt vid ytan av konstruktionen och frö 2 × 106 keratinocyter ovanpå konstruktionen för att skapa ett epidermalt skikt.</li>
		<li>Kultur vidare i 1 vecka före analys.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Beredning av halspulsådermodell
<ol><li>Fyll på biobläcklösningen med gellangummi (enligt beredningen i steg 2.1) i en skrivarkassett.</li>
	<li>Skriv ut halspulsådermodellen i en petriskål som innehåller stödmaterialet för vätskegelen enligt tryckanvisningarna i avsnitt 4.</li>
	<li>När utskriften är klar, injicera 2 ml 200 mM CaCl2∙2H2Orunt konstruktionen med en spruta och nål.</li>
	<li>Efter minst 3 timmar, ta bort konstruktionen från stödbadet med en spatel och tvätta försiktigt i PBS.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lee, K. Y., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+for+tissue+engineering.">Hydrogels for tissue engineering.</a> Chemical Reviews. 101 (7), 1869-1880 (2001).</li><li>Caliari, S. R., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+hydrogels+for+cell+culture.">A practical guide to hydrogels for cell culture.</a> Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).</li><li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics+for+3D+cell+culture.">Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture.</a> Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).</li><li>Drury, J. L., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+for+tissue+engineering:+scaffold+design+variables+and+applications.">Hydrogels for tissue engineering: scaffold design variables and applications.</a> Biomaterials. 24 (24), 4337-4351 (2003).</li><li>Iordachescu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+model+for+the+development+of+mature+bone+containing+an+osteocyte+network.">An in vitro model for the development of mature bone containing an osteocyte network.</a> Advanced Biosystems. 2 (2), 1700156 (2018).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel+cryopreservation+system:+an+effective+method+for+cell+storage.">Hydrogel cryopreservation system: an effective method for cell storage.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (11), 3330 (2018).</li><li>McCormack, A., Highley, C. B., Leslie, N. R., Melchels, F. P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printing+in+suspension+baths:+keeping+the+promises+of+bioprinting+afloat.">3D printing in suspension baths: keeping the promises of bioprinting afloat.</a> Trends in Biotechnology. 38 (6), 584-593 (2020).</li><li>Cheng, W., Zhang, J., Liu, J., Yu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granular+hydrogels+for+3D+bioprinting+applications.">Granular hydrogels for 3D bioprinting applications.</a> View. 1 (3), 20200060 (2020).</li><li>Lieben, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+3D+printing+of+human+tissues+is+taking+shape.">The future of 3D printing of human tissues is taking shape.</a> Nature Reviews Rheumatology. 12 (4), 191 (2016).</li><li>Bhattacharjee, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Writing+in+the+granular+gel+medium.">Writing in the granular gel medium.</a> Science Advances. 1 (8), 1500655 (2015).</li><li>Hinton, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+printing+of+complex+biological+structures+by+freeform+reversible+embedding+of+suspended+hydrogels.">Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels.</a> Science Advances. 1 (9), 1500758 (2015).</li><li>Zarrintaj, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose-based+biomaterials+for+tissue+engineering.">Agarose-based biomaterials for tissue engineering.</a> Carbohydrate Polymers. 187, 66-84 (2018).</li><li>te Nijenhuis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Thermoreversible Networks: Viscoelastic Properties and Structure of Gels. , 194-202 (1997).</li><li>Norton, I. T., Jarvis, D. A., Foster, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+model+for+the+formation+and+properties+of+fluid+gels.">A molecular model for the formation and properties of fluid gels.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 26 (4), 255-261 (1999).</li><li>Fern&#225;ndez Farr&#233;s, I., Moakes, R. J. A., Norton, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+biopolymer+fluid+gels:+A+microstructural+approach.">Designing biopolymer fluid gels: A microstructural approach.</a> Food Hydrocolloids. 42, 362-372 (2014).</li><li>Cooke, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structuring+of+hydrogels+across+multiple+length+scales+for+biomedical+applications.">Structuring of hydrogels across multiple length scales for biomedical applications.</a> Advanced Materials. 30 (14), 1705013 (2018).</li><li>Foster, N. C., Allen, P., El Haj, A. J., Grover, L. M., Moakes, R. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+therapeutic+responses+via+engineering+microenvironments+with+a+novel+synthetic+fluid+gel.">Tailoring therapeutic responses via engineering microenvironments with a novel synthetic fluid gel.</a> Advanced Healthcare Materials. 10 (16), 2100622 (2021).</li><li>Ellis, A. L., Norton, A. B., Mills, T. B., Norton, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilisation+of+foams+by+agar+gel+particles.">Stabilisation of foams by agar gel particles.</a> Food Hydrocolloids. 73, 222-228 (2017).</li><li>Ghebremedhin, M., Seiffert, S., Vilgis, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physics+of+agarose+fluid+gels:+Rheological+properties+and+microstructure.">Physics of agarose fluid gels: Rheological properties and microstructure.</a> Current Research in Food Science. 4, 436-448 (2021).</li><li>Garrec, D. A., Norton, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+fluid+gel+formation+and+properties.">Understanding fluid gel formation and properties.</a> Journal of Food Engineering. 112 (3), 175-182 (2012).</li><li>Garrec, D. A., Guthrie, B., Norton, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kappa+carrageenan+fluid+gel+material+properties.+Part+1:+Rheology.">Kappa carrageenan fluid gel material properties. Part 1: Rheology.</a> Food Hydrocolloids. 33 (1), 151-159 (2013).</li><li>Adams, S., Frith, W. J., Stokes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+particle+modulus+on+the+rheological+properties+of+agar+microgel+suspensions.">Influence of particle modulus on the rheological properties of agar microgel suspensions.</a> Journal of Rheology. 48 (6), 1195-1213 (2004).</li><li>Senior, J. J., Cooke, M. E., Grover, L. M., Smith, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+complex+hydrogel+structures+using+suspended+layer+additive+manufacturing+(SLAM).">Fabrication of complex hydrogel structures using suspended layer additive manufacturing (SLAM).</a> Advanced Functional Materials. 29 (49), 1904845 (2019).</li><li>Moakes, R. J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+suspended+layer+additive+manufacturing+approach+to+the+bioprinting+of+tri-layered+skin+equivalents.">A suspended layer additive manufacturing approach to the bioprinting of tri-layered skin equivalents.</a> APL Bioengineering. 5 (4), 046103 (2021).</li><li>Moxon, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suspended+manufacture+of+biological+structures.">Suspended manufacture of biological structures.</a> Advanced Materials. 29 (13), 1605594 (2017).</li><li>Noor, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Printing+of+personalized+thick+and+perfusable+cardiac+patches+and+hearts.">3D Printing of personalized thick and perfusable cardiac patches and hearts.</a> Advanced Science. 6 (11), 1900344 (2019).</li><li>Compaan, A. M., Song, K., Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gellan+fluid+gel+as+a+versatile+support+bath+material+for+fluid+extrusion+bioprinting.">Gellan fluid gel as a versatile support bath material for fluid extrusion bioprinting.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 11 (6), 5714-5726 (2019).</li><li>Moxon, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blended+alginate/collagen+hydrogels+promote+neurogenesis+and+neuronal+maturation.">Blended alginate/collagen hydrogels promote neurogenesis and neuronal maturation.</a> Materials Science and Engineering: C. 104, 109904 (2019).</li><li>H&#246;lzl, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioink+properties+before,+during+and+after+3D+bioprinting.">Bioink properties before, during and after 3D bioprinting.</a> Biofabrication. 8 (3), 032002 (2016).</li><li>Chimene, D., Lennox, K. K., Kaunas, R. R., Gaharwar, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+bioinks+for+3D+printing:+a+materials+science+perspective.">Advanced bioinks for 3D printing: a materials science perspective.</a> Annals of Biomedical Engineering. 44 (6), 2090-2102 (2016).</li><li>Schwab, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printability+and+shape+fidelity+of+bioinks+in+3D+bioprinting.">Printability and shape fidelity of bioinks in 3D bioprinting.</a> Chemical Reviews. 120 (19), 11028-11055 (2020).</li><li>Rutz, A. L., Lewis, P. L., Shah, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+next-generation+bioinks:+Tuning+material+properties+pre-+and+post-printing+to+optimize+cell+viability.">Toward next-generation bioinks: Tuning material properties pre- and post-printing to optimize cell viability.</a> MRS Bulletin. 42 (8), 563-570 (2017).</li><li>Mosadegh, B., Xiong, G., Dunham, S., Min, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+progress+in+3D+printing+for+cardiovascular+tissue+engineering.">Current progress in 3D printing for cardiovascular tissue engineering.</a> Biomedical Materials. 10 (3), 034002 (2015).</li><li>Zhou, K., Sun, Y., Yang, J., Mao, H., Gu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+for+3D+embedded+bioprinting:+a+focused+review+on+bioinks+and+support+baths.">Hydrogels for 3D embedded bioprinting: a focused review on bioinks and support baths.</a> Journal of Materials Chemistry B. 10 (12), 1897-1907 (2022).</li><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+bioprinting+of+collagen+to+rebuild+components+of+the+human+heart.">3D bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart.</a> Science. 365 (6452), 482-487 (2019).</li><li>Kyle, S., Jessop, Z. M., Al-Sabah, A., Whitaker, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printability'+of+candidate+biomaterials+for+extrusion+based+3D+printing:+state-of-the-art.">Printability' of candidate biomaterials for extrusion based 3D printing: state-of-the-art.</a> Advanced Healthcare Materials. 6 (16), 1700264 (2017).</li><li>Hinton, T. J., Lee, A., Feinberg, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+bioprinting+from+the+micrometer+to+millimeter+length+scales:+Size+does+matter.">3D bioprinting from the micrometer to millimeter length scales: Size does matter.</a> Current Opinion in Biomedical Engineering. 1, 31-37 (2017).</li><li>Seoane-Via&#241;o, I., Trenfield, S. J., Basit, A. W., Goyanes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+3D+printed+pharmaceuticals:+From+hype+to+real-world+clinical+applications.">Translating 3D printed pharmaceuticals: From hype to real-world clinical applications.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 174, 553-575 (2021).</li><li>Jovic, T. H., Combellack, E. J., Jessop, Z. M., Whitaker, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+bioprinting+and+the+future+of+surgery.">3D bioprinting and the future of surgery.</a> Frontiers in Surgery. 7, 609836 (2020).</li></ol>

Författarna har inga intressekonflikter att deklarera.

Övervägande av valet av material som används för stödbädden Under utvecklingsstadiet krävdes olika egenskaper av stödbädden. Dessa egenskaper innefattade: i) upprätthålla tillräcklig struktur för att suspendera det extruderade materialet; ii) skjuvningskapacitet så att skrivhuvudet kan röra sig fritt genom underlaget, iii) snabb omstrukturering (självläkande egenskaper), bildande stöd runt det deponerade biobläcket; iv) termiskt stabil vid både rumstemperatur och fysiologiska temperaturer; v) neutralt (dvs. oladdat) material som är relativt bioinert, över ett intervall av pH och elektrolyter (joniska arter och koncentrationer), vilket förhindrar interaktioner med celler och laddade biobläck; vi) giftfri, vii) helst från en källa utan djurförsök.
Även om det finns många biopolymermaterial som bibehåller flera av dessa inneboende egenskaper, med kapacitet att utföra suspenderad 3D-additiv tillverkning utan att överensstämma med alla dessa egenskaper 11,26,27, var avsikten här att producera en stödbädd som skulle övervinna vissa praktiska problem i samband med andra stödmaterial. På grund av de kemiska egenskaperna hos agaros och i synnerhet när den formulerades som en partikelformig vätskegel kunde alla dessa egenskaper erhållas. Detta möjliggjorde en stödbädd som kunde användas över en mängd olika biobläck23,24,25,28. Faktum är att materialets bioinerta natur gav möjlighet att bibehålla den tryckta strukturen in situ under hela kulturen, vilket möjliggjorde tillräckliga tidsramar för många olika biobläck att utvecklas fullt ut, utan förändringar i biologin. Dessutom möjliggjorde den partikelformiga, tunnare naturen enkel borttagning från den slutliga tryckta konstruktionen, medan det giftfria, icke-animaliska ursprunget möjliggör potential för snabb översättning till kliniken och övervinner hinder relaterade till etiska och regulatoriska krav.
Överväganden vid val av material för biobläck Vid bioprinting med direktextrudering deponeras biobläck på en 2D-utskriftsbädd. Det är fördelaktigt att monomer biobläcklösningar har skjuvningsförtunnande beteende; För att producera hifi-konstruktioner med fysiologiskt relevanta dimensioner måste de emellertid ha låg tixotropi och återhämta sig till tillräckligt höga viskositeter så att de bildar fasta filament vid deponering 29,30,31. Med ökad viskositet är trycket som krävs för extrudering mycket högre, vilket ofta påverkar den inkapslade cellviabiliteten31,32 negativt. Suspensionsbioprinting tar bort denna begränsning, eftersom det extruderade materialet stöds av suspensionsbadet under tvärbindningen. Denna utveckling ökar enormt utbudet av biobläckformuleringar som kan användas. Till exempel har nyligen arbete visat användningen av kollagenlösningar med låg koncentration som skrivs ut i mycket komplexa geometrier analoga med hjärtans inre struktur33,34,35. I de applikationer som nämns i denna metod tillät inbäddad utskrift att biomaterialfärger valdes för att bäst replikera den fysiologiska miljön som de var avsedda för, istället för att deras förmåga skulle kunna skrivas ut.
Begränsningar i strukturstorlek Genom hela biofabricationslitteraturen har det visats att olika typer av bioprinters, drivna av alternativa skrivhuvudtekniker, kan införlivas i inbyggda tillverkningstekniker. Den teknik som demonstreras här är inte annorlunda, med exempel som inkluderar en pneumatisk mikroextruderingsbaserad bioprinter (INKREDIBLE), som demonstrerats av Senior et al., och extruderingsbaserade bioprinters med kontrollerbara mikroventiler (3D Discovery)23. Även om detta gör tekniken tillgänglig för en rad användare som kanske redan äger en bioprinter, är begränsningar av strukturens uppnåeliga storlek i slutändan beroende av bioprinterspecifikationerna i fråga. Ursprungligen definieras huvudbegränsningen för generering av stora strukturer av storleken på tryckbädden, gränserna för X-, Y- och Z-banor och även storleken på kärlet i vilket den stödjande vätskegelen finns.
Begränsningar i upplösning Vid tillverkning av invecklade strukturer i mikrometerstorlek är den resulterande upplösningen starkt beroende av skrivarens precision (kontroll över stegstorlek, extruderingsgrad), utskriftsmunstyckets innerdiameter och en rad justerbara programvaruparametrar, inklusive utskriftshastighet, utskriftstryck och flödeshastighet36. Dessutom verkar kontroll över droppstorleken vara avgörande för att underlätta genereringen av högupplösta strukturer, med de bästa resultaten observerade i extruderingsskrivare med en kontrollerbar mikroventil. I slutändan, när alla parametrar är optimerade, kan utskriftsupplösningar uppnås för att matcha, eller till och med vara mindre än, den inre diametern hos extruderingsmunstycken, med det avsatta filamentet i storleksordningen mikrometerskala37. Detta är dock beroende av optimering av alla tidigare nämnda utskriftsparametrar, och upplösningen kan begränsas avsevärt av tryckmekanismen och precisionen. Pneumatisk extrudering verkar till exempel inte tillåta samma utskriftsupplösning som extrudering med en kontrollerbar mikroventil. Det finns därför en potentiell kostnadskonsekvens för att uppnå maximal utskriftsupplösning, eftersom sådana system medför en avsevärt ökad kostnad för användaren.
Framtidsutsikter och potential För närvarande finns det ett stort intresse kring användningen av suspenderade tillverkningsprocesser för att möjliggöra produktion av komplexa mjuka strukturer som innehåller inbäddade celler, och det kommer utan tvekan att ske betydande framsteg under de kommande åren. Kontinuerliga framsteg när det gäller att förbättra utskriftsupplösningen ges, även om det återstår att se hur nödvändigt detta kommer att vara, med tanke på att de flesta biologiska system kan omorganisera sig på molekylär nivå. Medan fokus för intresse i media är kring användningen av 3D-tryckta vävnader för att direkt ersätta mänskliga vävnader efter skada eller sjukdom, är alla robusta medicinska procedurer som möjliggörs av dessa processer några år borta38,39. Det är mer troligt att effekterna av dessa komplexa odlingssystem kommer att vara i screening av droger eller till och med användas som verktyg för att förbättra vår förståelse av biologiska processer38. I synnerhet kan utvecklingsbiologi vara till stor nytta här, där exakt kontroll över den speciella avsättningen av molekyler gör det möjligt för forskare att utforska multifaktoriella systems roll på vävnadsutvecklingsprocesser.

Hydrogeler är perfekta material att använda som stöd för celltillväxt1. Beroende på vilket material som används gelar de via skonsamma mekanismer som inte äventyrar cellviabiliteten 2,3. Den höga vattenhalten (vanligtvis >90%) innebär att näringsämnen och syre lätt kan diffundera in i materialet och avfallsprodukter från cellmetabolism diffunderar ut4. Som sådan har cellviabilitet visat sig bevaras under perioder över 1 år5, och det finns nu exempel på hydrogeler som används för att lagra eller "pausa" celler för framtida terapeutisk användning6. De har använts i stor utsträckning inom vävnadsteknik för produktion av vävnadsliknande strukturer, men deras användning tenderar att begränsas av svårigheten att kontrollera både materialets struktur och sammansättning. Historiskt sett är hydrogelstyrkan relativt låg (i förhållande till många hårda vävnader) på grund av den höga vattenhalten och låga volymer som upptas av polymermatrisen som bildar strukturen. Dessutom erbjuder många vägar till gelering (termisk, jonotrop, fibrillogenes) ganska långsam kinetik, vilket innebär att deras mekaniska egenskaper tenderar att utvecklas stadigt med tiden. Med undantag för interpenetrerande nätverk resulterar låg mekanisk styvhet och långsamma härdningstider ofta i biobläck som inte kan stå fritt vid deponering, vilket tenderar att "sjunka" och förlora definitionen när de initialt extruderas.
I ett försök att övervinna denna nyckelfråga har inbäddade trycktekniker utvecklats som ger stöd under utskrift, medan konstruktionens mekaniska egenskaper utvecklar 7,8. När gelens mikrostruktur har utvecklats fullt ut och de mekaniska egenskaperna når ett optimalt kan stödmatrisen avlägsnas, vanligtvis genom försiktig tvättning eller smältning av stödfasen. Inledande arbete med detta tillvägagångssätt använde en viskös plurondispersion i vilken sekundärfasen fördelades9. På senare tid använde Bhattacharjee et al. geler i form av granulerad karbopol för att visa att matriser av celler kunde suspenderas i stödgelen10. Därefter rapporterade Hinton et al. om extrudering av gelbaserade material innehållande celler i en stödbädd som bestod av en mikrogelsuspension bildad av granulärt gelatin11. Efter extrudering av den cellinnehållande hydrogelen och dess efterföljande härdning avlägsnades gelatinet genom försiktig uppvärmning av stödbadet, vilket möjliggjorde smältning av gelatinet. Tyvärr har denna process fortfarande flera begränsningar. Till exempel är den kemiska strukturen hos gelatin i jämförelse med kollagen (följaktligen att det är en hydrolyserad form av kollagen) sådan att många kemiska delar över dess ryggrad kan interagera med biologiska enheter; Således kan en kvarvarande stödmatris störa nedströms biologiska processer. Dessutom utgör produkter av animaliskt ursprung en restriktiv användning när man ser till en tekniks översättbarhet. Detta skapar utmaningar om den tillverkade delen är avsedd att användas kliniskt, eller till och med om den ska användas för att svara på grundläggande biologiska frågor, där denna ytkontaminering kan orsaka ett betydande problem.
Vi har därefter skapat en förfinad process som möjliggör suspenderad tillverkning av hydrogeler, inom en stödjande matris, som inte har någon laddning under fysiologiska förhållanden och bildas av icke-animaliska material. Även om processen kan användas med en rad biopolymera stöd, ger agaros ett material som är inert mot biologiska interaktioner eftersom det är sockerbaserat och neutralt laddat vid fysiologiskt pH12,13. I stället för att fragmentera en redan existerande gel bildas stödmaterialet genom applicering av skjuvning under gelering14,15,16. Detta ger en matris av partiklar som uppvisar dendronliknande egenskaper vid ytan och dispergeras i en sekundär matris av ogelad polymer17,18. Resultatet är ett material med intressanta materialegenskaper 19,20,21,22 som kan skjuvtunna på liknande sätt som tidigare rapporterade granulära geler, men tenderar att återvinna viskositeten snabbare när skjuvningen avlägsnas 23. När det cellbärande materialet som extruderats in i stödmatrisen har mognat fullt ut kan stödmatrisen avlägsnas genom försiktig omrörning innan den placeras i odling. Det har visats att det är möjligt att använda denna process för att producera material med komplexa strukturer och rekapitulera de biologiska strukturerna i både huden och osteokondrala regionen23,24,25. Detta metodpapper beskriver i detalj hur man tillverkar stödmaterialet och belyser lämpliga biobläck som används inom en mängd komplexa strukturer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D Discovery Bioprinter</td>
			<td>RegenHU</td>
			<td>BIOFACTORY</td>
			<td>Microvalve extrusion bioprinter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>9012-36-6</td>
			<td>Material used to create fluid gel support baths&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop autoclave</td>
			<td>Prestige Medical</td>
			<td>B8L75814</td>
			<td>Classic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Blue G</td>
			<td>Merck</td>
			<td>6104-58-1</td>
			<td>Dye used to stain structures&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>10035-04-8</td>
			<td>Used to reticulate printed structures&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>D4902-25MG</td>
			<td>Used in adipogenic media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Merck</td>
			<td>D6429</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duran&#160; bottle&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z305219</td>
			<td>glass bottle&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS XL Core Imaging System</td>
			<td>EVOS&#8482;</td>
			<td>AMEX1000</td>
			<td>Brightfield microscope with phase contrast</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10500-064</td>
			<td>Cell culture media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gellan gum</td>
			<td>Special Ingredients</td>
			<td>5060341112638</td>
			<td>Low Acyl Gellan gum used to make the bioink for the corotid artery model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H9897-10PAK</td>
			<td>Buffer for cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>I7378</td>
			<td>Used in adipogenic media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isobutyl-methylxanthine (IBMX)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>I7018-100MG</td>
			<td>Used in adipogenic media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte growth medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>00192060</td>
			<td>Used as media to culture keratinocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Methoxy Pectin</td>
			<td>CP Kelco</td>
			<td>LM-5CS</td>
			<td>Pectin used to make pectin/collagen blends</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td>Used to inhibit bacterial growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureCol EZ Gel solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>5074</td>
			<td>Collagen solution used to make alginate/collagen blends</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Alginate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>9005-38-3</td>
			<td>Alginate powder used to make alginate/collagen blends&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE select&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12563011</td>
			<td>cell dissociation enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Flasks</td>
			<td>StarLab</td>
			<td>CC7682-4175</td>
			<td>Used for culturing cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

agarose fluid gels formed by shear processing during gelation for suspended 3d bioprinting

Användningen av granulära matriser för att stödja delar under bioprintningsprocessen rapporterades först av Bhattacharjee et al. 2015, och sedan dess har flera metoder utvecklats för beredning och användning av stödjande gelbäddar i 3D-bioprinting. Detta dokument beskriver en process för att tillverka mikrogelsuspensioner med agaros (känd som flytande geler), där partikelbildning styrs av applicering av skjuvning under gelering. Sådan bearbetning producerar noggrant definierade mikrostrukturer, med efterföljande materialegenskaper som ger tydliga fördelar som inbäddningsmedia, både kemiskt och mekaniskt. Dessa inkluderar att bete sig som viskoelastiska fasta material vid nollskjuvning, vilket begränsar långdistansdiffusion och demonstrerar det karakteristiska skjuvningsförtunnande beteendet hos flockulerade system. 
Vid avlägsnande av skjuvspänning har emellertid flytande geler kapacitet att snabbt återställa sina elastiska egenskaper. Denna brist på hysteres är direkt kopplad till de definierade mikrostrukturer som tidigare hänvisats till; På grund av bearbetningen underlättar reaktiva, icke-gelerade polymerkedjor vid partikelgränssnittet interpartikelinteraktioner - liknande en kardborreeffekt. Denna snabba återvinning av elastiska egenskaper möjliggör bioprinting av högupplösta delar från biomaterial med låg viskositet, eftersom snabb reformering av stödbädden fångar biobläcket på plats och bibehåller dess form. Dessutom är en fördel med agarosvätskegeler de asymmetriska gelnings- / smältövergångarna (geleringstemperatur på ~ 30 ° C och smälttemperatur på ~ 90 ° C). Denna termiska hysteres av agaros gör det möjligt att skriva ut och odla den bioprintade delen in situ utan att den stödjande vätskegelen smälter. Detta protokoll visar hur man tillverkar agarosvätskegeler och visar deras användning för att stödja produktionen av en rad komplexa hydrogeldelar inom suspenderad skiktadditiv tillverkning (SLAM).

Alginat och typ I kollagen biobläck Utskriftsupplösningen (registrerad som en funktion av glödtrådens diameter) observerades vara direkt avstämbar via förändringar i extruderingstrycket (figur 1A-C). Extruderingstryck och utskriftsupplösning var direkt relaterade till de minsta filamentdiametrarna som genererades genom utskrift vid ett extruderingstryck på 30 kPa. Intressant är att vid ett extruderingstryck på 30 kPa kan filament som matchade extruderingsmunstyckets innerdiameter genereras (genomsnittlig filamentdiameter: 323 μm ± 50 μm; munstycksdiameter: 300 μm), vilket tyder på att en "maximal upplösning" kan uppnås. Dessutom kan tryckparametrarna för denna upplösning framgångsrikt tillämpas på generering av ett alginat/kollagenkärlrör som kan extraheras och perfuseras (figur 1D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64458/64458fig01.jpg"> Bild 1: Generering av högupplösta utskrifter med SLAM. Skräddarsy utskriftsupplösning av alginat/kollagengitter som en funktion av filamentdiametern via extrudering vid (A) 30 kPa, (B) 60 kPa och (C) 120 kPa. d) Generering av ett kärlrör av alginat/kollagen. Skalstänger = 400 μm (A-C), 10 mm (D). Förkortning: SLAM = suspended layer additive manufacture. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64458/64458fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
Hudanaloger SLAM användes också för att skapa en hudliknande struktur (figur 2A) med hjälp av ett biobläck bildat av en blandning av kollagen I och pektin. För att uppnå en gradient av mekaniska egenskaper liknande dem som finns i huden användes olika proportioner pektin och kollagen i dermala (5% w/w pektin blandat vid 2:1 med en 5 mg∙ml−1 kollagenstock) och hypodermalt (5% w/w pektin blandat vid 1:1 med ett 5 mg∙ml−1 kollagenlager) lager. Den resulterande strukturen (figur 2Bi-Bii) integrerades väl efter nedsänkning i DMEM, utan tecken på delaminering. Viktigt var att det fanns en hög nivå av cellviabilitet i hela strukturen (figur 2Biii) efter en period av 14 dagars odling. Intressant, under kulturperioden förstärktes materialen24, vilket indikerar en ombyggnad av materialet.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64458/64458fig02.jpg"> Figur 2: Produktion av en hudliknande struktur. a) En schematisk bild som visar hur SLAM-processen användes för att skapa en skiktad struktur inbäddad med humana dermala fibroblaster. Den suspenderande bädden här tillverkades av partiklar bildade av agaros, medan hypodermala och dermala skikt bildades av varierande proportioner pektin och kollagen I. (B) Den skiktade strukturen var avsedd att representera hudens treskiktiga struktur (i). Med framgång i replikering av denna struktur (ii) noterades höga nivåer av cellviabilitet i hela proverna, vilket visas av calcein-AM-färgning (iii). Skalstång = 5 mm (Bii). Förkortning: SLAM = suspended layer additive manufacture. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64458/64458fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
Halspulsådern För att tänja på metodens gränser producerades ett urval av mer komplexa tryck. I ett sådant exempel trycktes en förgrenad halspulsåder med 1% gellanbiobläck (figur 3A), som sedan tvärfästes genom extrudering av 200 mM CaCl2 i vätskegelbädden (figur 3B) och helt enkelt lyftes från stödet efter gelering (figur 3C). Trots att prekursorutskriftslösningar uppvisade låg viskositet lyckades stödbädden möjliggöra produktion av den komplexa geometrin. Artären behöll sin struktur under deponering, tvärbindning och extraktion (figur 3), utan att behöva ändra utskriftskoder för att införliva ytterligare byggnadsställningar.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64458/64458fig03.jpg"> Figur 3: Tillverkningsprocess av gellanhalspulsådern med SLAM . (A) Extrudering av gellan i vätskegelbädden under tryckning, (B) avslutat halspulsådertryck i vätskegelen under tvärbindning, och (C) slutlig halspulsådermodell efter hämtning från vätskegelstöd. Skalstänger = 10 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64458/64458fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Agarose Fluid Gels Formed by Shear Processing During Gelation for Suspended 3D Bioprinting at JoVE.com

Agarose Fluid Gels Formed by Shear Processing During Gelation for Suspended 3D Bioprinting

Skjuvbearbetning under hydrogelbildning resulterar i produktion av mikrogelsuspensioner som skjuvtunna men snabbt omstruktureras efter avlägsnande av skjuvkrafter. Sådana material har använts som en stödjande matris för bioprinting komplexa, cellbelastade strukturer. Här beskrivs metoder som används för att tillverka stödbädden och kompatibla biobläck.

Agarosvätskegeler bildade genom skjuvbearbetning under gelering för suspenderad 3D-bioprinting

The use of granular matrices to support parts during the bioprinting process was first reported by Bhattacharjee et al. in 2015, and since then, several ...

Möjligheten att använda olika biobläck är avgörande för en framgångsrik utveckling av bioprintade strukturer, och denna teknik underlättar användningen av material som i allmänhet är oförenliga med konventionella trycktekniker. Det suspenderande mediet förhindrar kollaps av biobläck med låg viskositet när de deponeras och möjliggör integration av olika biobläck i en enda konstruktion för att skapa regionala variationer i kemiska och mekaniska egenskaper som är mer besläktade med naturlig vävnad. Demonstrerar proceduren kommer att vara Dr.Tom Robertson, en forskare från University of Birmingham, och Dr.Jessica Senior, en forskare från University of Huddersfield.För att börja, slå på reometern och sätt in 40 millimeter tandade geometrier, så att den kan stå i 30 minuter. Nollställ reometerns gaphöjd med nollgapshöjdsfunktionen. Tillsätt ungefär två milliliter prov på bottenplattan och sänk den övre geometrin för att skapa en gaphöjd på en millimeter.Trimma provet genom att ta bort överflödigt material som utvisas mellan plattorna med en platt, icke-slipande kant för att dra bort överflödig vätska från gapet och blötlägg det med silkespapper. För att bestämma biobläckets injicerbarhet, gör viskometriprofiler genom att välja Viscometry test från användaralternativen. Ange parametrarna för ett skjuvhastighetskontrollerat ramptest med 0,1 till 500 per sekund med en minuts ramptid.Läs in ett nytt prov och upprepa processen för att säkerställa reproducerbarhet. För att bestämma biobläckets gelningsegenskaper utfördes små deformationstester genom att välja oscillerande testning från användaralternativen. Mata in parametrar i ett enda frekvenstest under konstant belastning, som frekvensen av en hertz, stam på 0,5% över en timme medan bläcket geler.Upprepa viskometriramptestet på nya prover under stresskontroll med hjälp av de övre och nedre spänningarna som bestämts från det skjuvhastighetskontrollerade ramptestet i steg som visats tidigare. För att utföra in situ-amplitud- och frekvensmätningar på gelade prover, välj ett oscillerande test från användaralternativen. När du har valt amplitudsvepet matar du in parametrarna för ett amplitudsveptest som är töjningskontrollerat vid 0,01 till 500% vid en konstant en hertzfrekvens.Efter avslutad test, analysera spektra för att bestämma det linjära viskoelastiska området. Ladda ett nytt prov på reometern och låt det gela. Välj sedan ett oscillerande test från användaralternativen.Välj frekvenstest och ingångsfrekvensparametrar mellan 0,01 och 10 hertz och en töjning inom spektras linjära viskoelastiska område bestämd från de amplitudsvepdata som erhållits tidigare. För att starta CAD-programvara och starta genereringen av en CAD-modell, välj alternativet Verktyg och klicka sedan på Material i CAD-programvaran för att definiera utskriftsparametrarna för det valda biobläcket. Ange den uppskattade filamentdiametern på fliken Tjocklek för att bestämma z-tjockleken för varje lager.För att designa strukturen lager för lager, använd flikarna Lager i programvaran, gruppera lagren med hjälp av fliken Gruppera och tilldela varje lager till en nivå på z-planet med hjälp av fliken Nivå. Generera en gitterstruktur genom att skapa ett lager med filamenten längs x-axeln och ett andra lager längs y-axeln och tilldela båda till en separat nivå. Under fliken Grupp bestämmer du bygghöjden genom att välja antalet upprepade enheter i strukturen.Klicka sedan på verktyget Generera för att skapa en G-kod för designen och visa en 3D-rendering av strukturen. I bioprintern alikvoterar du biobläcket i bläckpatronen och skruvar fast det i skrivhuvudet ovanför mikroventilen. Klicka sedan på nållängdsmätningsfunktionen för att kalibrera skrivhuvudet.Anslut sedan det monterade skrivhuvudet till det pneumatiska trycksystemet och ladda odlingskärlet på tryckplattformen. När ett lämpligt tryck har valts öppnar du G-koden som genererades tidigare och klickar på Kör för att starta utskriftsprocessen. När utskriften av halspulsådern är klar, använd en spruta och nål för att injicera två milliliter 200 millimolar kalciumkloriddihydrat runt konstruktionen.Efter minst tre timmar, ta bort vätskegelstödbädden från konstruktionen och tvätta den försiktigt i PBS. Ta sedan bort konstruktionen från stödbadet med en spatel. Skräddarsydd utskriftsupplösning av alginat- och kollagengitter som en funktion av filamentdiametern via extrudering vid 30, 60 och 120 kilopascal observerades och resultaten visade att upplösningen var direkt stämbar med förändringarna i extruderingstrycket.För att uppnå en gradient av mekaniska egenskaper som liknar dem som finns i huden användes olika proportioner pektin och kollagen i dermala och hypodermala skikt, vilket resulterade i en struktur utan tecken på delaminering. En hög nivå av cellviabilitet observerades i hela strukturen efter 14 dagars odling under vilken materialen stelnade, vilket indikerar ombyggnad av materialet. För reologin är det viktigt att provet laddas korrekt för att säkerställa reproducerbara data, och för bioprinting är det viktigt att strukturen är helt tvärbunden innan den tas bort från stödbädden.Odling av storskaliga vävnadskonstruktioner under längre perioder hjälper till att utforska de inbäddade cellernas svar på fysiska och kemiska stimuli.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Ingenjörs 3D Cellularized kollagengeler för kärlvävnad Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Beredning av 3D koUagengeler och mikro för studien av 3D interaktioner<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

Skapande av hjärtvävnad som visar mekanisk integration av sfäroider med 3D bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting av brosk och hud vävnad analoger utnyttja en roman passiv enhet blandningsteknik för Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Tillverkning av anpassade agaros brunnar för Cell sådd och vävnad Ring självmontering med 3D-tryckt formar

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Protokoll för 3D Bioprinning av gelatin Methacryloyl hydrogel baserade Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...

3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue

3D Bioprinting av Murine Cortical Astrocytes för engineering neural-liknande vävnad

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also ...

Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting

Storskalig, automatiserad produktion av fett-härledda stamcellsfäroider för 3D-bioprintning

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue ...

Ensemble Force Spectroscopy by Shear Forces

Ensemble Force Spektroskopi av Shear Forces

Single-molecule techniques based on fluorescence and mechanochemical principles provide superior sensitivity in biological sensing. However, due to the ...

Quantitative Characterization of Bioink Properties for Continuous DLP Printing

Quantitative Characterization of Liquid Photosensitive Bioink Properties for Continuous Digital Light Processing Based Printing

Quantitative Characterization of Liquid Photosensitive Bioink Properties for Continuous Digital Light Processing Based Printing (Video) | JoVE 

Kvantitativ karakterisering av flytande ljuskänsliga biobläckegenskaper för kontinuerlig digital ljusbearbetning baserad utskrift

Precise printing fabrication of bioinks is a prerequisite for tissue engineering; the Jacobs working curve is the tool to determine the precise printing ...