Name: quantification of circular rnas using digital droplet pcr
Uploaded: 2022-09-16T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR at JoVE.com

تم دعم هذا العمل بتمويل داخلي من معهد علوم الحياة ، ومنحة أبحاث DBT (BT / PR27622 / MED / 30/1961/2018) ، وزمالة Wellcome Trust / DBT India Alliance [IA / I / 18/2/504017] الممنوحة لأماريش سي باندا. نشكر أعضاء المختبر الآخرين على تدقيق المقال.

الحمض النووي الريبي حساس ل RNases. لذلك ، يجب أن تكون جميع الكواشف والأدوات ومساحات العمل خالية من RNase ويتم التعامل معها بعناية.
1. تصميم التمهيدي المتباعد ل circRNA (انظر الشكل 1)
<ol><li>استرجع التسلسل الناضج من بيانات التعليقات التوضيحية circRNA باستخ...

<ol>
	<li>Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+the+predominant+transcript+isoform+from+hundreds+of+human+genes+in+diverse+cell+types.">Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types.</a> PLoS One. 7 (2), 30733 (2012).</li><li>Chen, L. L., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+circRNA+biogenesis.">Regulation of circRNA biogenesis.</a> RNA Biology. 12 (4), 381-388 (2015).</li><li>Kristensen, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biogenesis,+biology+and+characterization+of+circular+RNAs.">The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs.</a> Nature Reviews Genetics. 20 (11), 675-691 (2019).</li><li>Chen, X., Zhou, M., Yant, L., Huang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNA+in+disease:+Basic+properties+and+biomedical+relevance.">Circular RNA in disease: Basic properties and biomedical relevance.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. , (2022).</li><li>Sinha, T., Panigrahi, C., Das, D., Chandra Panda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNA+translation,+a+path+to+hidden+proteome.">Circular RNA translation, a path to hidden proteome.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 13 (1), 1685 (2022).</li><li>Panda, A. C., Xiao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+Act+as+miRNA+Sponges.">Circular RNAs Act as miRNA Sponges.</a> Circular RNAs: Biogenesis and Functions. , 67-79 (2018).</li><li>Das, A., Sinha, T., Shyamal, S., Panda, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+role+of+circular+RNA-protein+interactions.">Emerging role of circular RNA-protein interactions.</a> Non-Coding RNA. 7 (3), 48 (2021).</li><li>Verduci, L., Tarcitano, E., Strano, S., Yarden, Y., Blandino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CircRNAs:+Role+in+human+diseases+and+potential+use+as+biomarkers.">CircRNAs: Role in human diseases and potential use as biomarkers.</a> Cell Death &amp; Disease. 12 (5), 468 (2021).</li><li>Pandey, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+analysis+of+circular+RNAs.">Methods for analysis of circular RNAs.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 11 (1), 1566 (2020).</li><li>Das, A., Das, D., Panda, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+circular+RNAs+by+PCR.">Validation of circular RNAs by PCR.</a> PCR Primer Design. Methods in Molecular Biology. 2392, 103-114 (2022).</li><li>Jeck, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+abundant,+conserved,+and+associated+with+ALU+repeats.">Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats.</a> RNA. 19 (2), 141-157 (2013).</li><li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+droplet+digital+polymerase+chain+reaction+format+for+DNA+copy+number+quantification.">Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification.</a> Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).</li><li>Hayden, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+droplet+digital+PCR+to+real-time+PCR+for+quantitative+detection+of+cytomegalovirus.">Comparison of droplet digital PCR to real-time PCR for quantitative detection of cytomegalovirus.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (2), 540-546 (2013).</li><li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets:+From+variable+nonsense+to+publication+quality+data.">Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: From variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7, 2409 (2017).</li><li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number.">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li><li>Ishak, A., AlRawashdeh, M. M., Esagian, S. M., Nikas, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic,+prognostic,+and+therapeutic+value+of+droplet+digital+PCR+(ddPCR)+in+COVID-19+patients:+A+systematic+review.">Diagnostic, prognostic, and therapeutic value of droplet digital PCR (ddPCR) in COVID-19 patients: A systematic review.</a> Journal of Clinical Medicine. 10 (23), 5712 (2021).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+droplet+digital+PCR+to+detect+the+pathogens+of+infectious+diseases.">Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases.</a> Bioscience Reports. 38 (6), (2018).</li><li>Lee, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+UCSC+genome+browser+database:+2022+update.">The UCSC genome browser database: 2022 update.</a> Nucleic Acids Research. 50, 1115-1122 (2022).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+A+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li><li>Untergasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer3--new+capabilities+and+interfaces.">Primer3--new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Research. 40 (15), 115 (2012).</li><li>Das, A., Das, D., Das, A., Panda, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quick+and+cost-effective+method+for+DNA-free+total+RNA+isolation+using+magnetic+silica+beads.">A quick and cost-effective method for DNA-free total RNA isolation using magnetic silica beads.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Oberacker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Synthesis+of+Functionalized+Paramagnetic+Beads+for+Nucleic+Acid+Purification+and+Manipulation.">Simple Synthesis of Functionalized Paramagnetic Beads for Nucleic Acid Purification and Manipulation.</a> Bio-protocol. 9 (20), 3394 (2019).</li><li>Ra&#269;ki, N., Dreo, T., Gutierrez-Aguirre, I., Blejec, A., Ravnikar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+transcriptase+droplet+digital+PCR+shows+high+resilience+to+PCR+inhibitors+from+plant,+soil+and+water+samples.">Reverse transcriptase droplet digital PCR shows high resilience to PCR inhibitors from plant, soil and water samples.</a> Plant Methods. 10 (1), 42 (2014).</li><li>Taylor, S. C., Carbonneau, J., Shelton, D. N., Boivin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+droplet+digital+PCR+from+RNA+and+DNA+extracts+with+direct+comparison+to+RT-qPCR:+Clinical+implications+for+quantification+of+Oseltamivir-resistant+subpopulations.">Optimization of droplet digital PCR from RNA and DNA extracts with direct comparison to RT-qPCR: Clinical implications for quantification of Oseltamivir-resistant subpopulations.</a> Journal of Virological Methods. 224, 58-66 (2015).</li></ol>

نمت أبحاث CircRNA في العقد الماضي مع اكتشاف تقنيات التسلسل عالية الإنتاجية. نتيجة لذلك ، تم اعتباره جزيئا محتملا لعلاجات الحمض النووي الريبي المستقبلية. بالإضافة إلى ذلك ، من المعروف أنه يعمل كمؤشر حيوي في العديد من الأمراض ، بما في ذلك السرطان وأمراض القلب والأوعية الدموية 4,8...

اكتشفت التطورات الحديثة في تقنيات تسلسل الحمض النووي الريبي والخوارزميات الحسابية الجديدة عضوا جديدا في العائلة المتنامية من الحمض النووي الريبي غير المشفر ، يسمى الحمض النووي الريبي الدائري (circRNA)1. كما يوحي الاسم ، فإن circRNAs هي عائلة من جزيئات الحمض النووي الريبي أحادية الشريط بدون نهايات حرة. يتم تشكيلها عن طريق الربط غير المتعارف عليه من الرأس إلى الذيل يسمى الربط الخلفي ، حيث ينضم موقع مستقبل لصق المنبع تساهميا مع موقع مانح لصق المصب لتشكيل دائرة RNA مستقرة 1,2. يمكن التوسط في هذه العملية من خلال عدة عوامل ، بما في ذلك عناصر Alu المتكررة المقلوبة الموجودة في المنبع والمصب من exons الدائرية ، أو يمكن التوسط فيها بواسطة بعض عوامل الربط أو بروتينات ربط الحمض النووي الريبي (RBPs)2,3. تصنف الحمض النووي الريبي الدائري المتولد حصريا من التسلسل الخارجي أو التسلسل الحلقي على أنه سيرك رنان خارجي و الحمض النووي الريبي الدائري أو الحمض النووي الريبي الدائري ، في حين أن بعض الحمض النووي الريبي الحلقي (EIcircRNAs)3,4. وظائف circRNAs متعددة الأوجه ، بما في ذلك الإسفنجة miRNA و / أو RBP ، وتنظيم النسخ ، وتنظيم الوظيفة الخلوية عن طريق الترجمة إلى الببتيدات3،5،6،7. أبرزت العديد من التقارير أهمية circRNAs في مختلف الأمراض والعمليات الفسيولوجية8. علاوة على ذلك ، فإن أنماط التعبير الخاصة بالأنسجة ومقاومة الهضم بالإكسونوكلياز تجعله علامة حيوية وظيفية لتشخيص المرض ويمكن استخدامه أيضا كهدف علاجي مناسب8. بالنظر إلى أهميتها في تنظيم الصحة والأمراض ، فإن القياس الكمي الدقيق لتعبير circRNA هو حاجة الساعة.
تم تطوير العديد من الطرق البيوكيميائية لتحديد كمية circRNAs في العينات البيولوجية9. واحدة من أكثر الطرق ملاءمة ومقبولة على نطاق واسع لقياس كمية circRNA هي النسخ العكسي متبوعا بتفاعل البلمرة المتسلسل الكمي (RT-qPCR) باستخدام أزواج أولية متباينة10. ومع ذلك ، فإن غالبية circRNAs منخفضة الوفرة مقارنة ب mRNAs الخطية ، مما يجعل من الصعب تحديدها كميا11. للتغلب على هذه المشكلة ، سعينا إلى استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل بالقطرات الرقمية (dd-PCR) لتحديد عدد circRNAs في عينة معينة بدقة. DD-PCR هي تقنية PCR متقدمة تتبع مبدأ الموائع الدقيقة. يولد قطرات مائية متعددة في الزيت ، ويحدث تفاعل البوليميراز المتسلسل في كل قطرة كتفاعل فردي12. يحدث التفاعل في قطرات فردية ويتم تحليله باستخدام قارئ قطرات ، والذي يعطي عدد القطرات الإيجابية أو السلبية للجين محل الاهتمام12. إنها التقنية الأكثر حساسية لتحديد الجين محل الاهتمام بدقة ، حتى لو كانت هناك نسخة واحدة فقط في عينة معينة. انخفاض الحساسية تجاه المثبطات ، وتحسين الدقة ، وحذف الجين المرجعي للقياس الكمي يجعله أكثر فائدة من qPCRالتقليدي 13،14،15. لقد تم استخدامه على نطاق واسع كأداة بحث وتشخيص للقياس الكمي المطلق للجين محل الاهتمام16,17. هنا ، نصف بروتوكول dd-PCR المفصل لقياس كمية circRNA في التمييز بين الأنابيب العضلية للفأر C2C12 وتكاثر الأرومات العضلية للفأر C2C12 باستخدام البادئات المتباينة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >1.5 ml microcentifuge tube</td>
			<td >Tarson</td>
			<td >500010</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.2 ml tube strips with cap</td>
			<td >Tarson</td>
			<td >610020, 510073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filter Tips</td>
			<td >Tarson</td>
			<td >528104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >10977023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell scrapper</td>
			<td >HiMedia</td>
			<td >TCP223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chloroform</td>
			<td >SRL</td>
			<td >96764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA diluent</td>
			<td >HiMedia</td>
			<td >MB228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Random primers</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >48190011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >dNTP set</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >R0181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Murine RNase inhibitor</td>
			<td >NEB</td>
			<td >M0314S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Maxima reverse transcriptase</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >EP0743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 dd-PCR Evagreen Supermix</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Droplet generation oil for Evagreen</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1814040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DG8 Cartridges and Gaskets</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DG8 Cartridge holder</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1863051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 Droplet Generator</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ddPCR 96-Well Plates</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >12001925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PX1 PCR Plate Sealer</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1814000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C1000 Touch Thermal Cycler with 96&#8211;Deep Well Reaction Module</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1851197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 Droplet Reader</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Quantasoft Software</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silica column</td>
			<td >Umbrella Life Science</td>
			<td >38220090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UCSC Genome Browser</td>
			<td ></td>
			<td >https://genome.ucsc.edu/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primer 3</td>
			<td ></td>
			<td >https://primer3.ut.ee/</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of circular rnas using digital droplet pcr

يعد تفاعل البوليميراز المتسلسل للقطرات الرقمية (dd-PCR) أحد أكثر طرق القياس الكمي حساسية. يقسم التفاعل إلى ما يقرب من 20000 قطرة ماء في زيت ، ويحدث تفاعل البوليميراز المتسلسل في القطرات الفردية. يتميز تفاعل البوليميراز المتسلسل dd-PCR بالعديد من المزايا مقارنة ب qPCR التقليدي في الوقت الفعلي ، بما في ذلك زيادة الدقة في اكتشاف الأهداف منخفضة الوفرة ، وحذف الجينات المرجعية للقياس الكمي ، والقضاء على التكرارات التقنية للعينات ، وإظهار مرونة عالية للمثبطات في العينات. في الآونة الأخيرة ، أصبح dd-PCR أحد أكثر الطرق شيوعا لتحديد كمية الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي المستهدف بدقة لتحليل التعبير الجيني والتشخيص. الحمض النووي الريبي الدائري (circRNAs) هي عائلة كبيرة من جزيئات الحمض النووي الريبي المغلقة تساهميا المكتشفة مؤخرا والتي تفتقر إلى نهايات 5 'و 3'. لقد ثبت أنها تنظم التعبير الجيني من خلال العمل كإسفنج للبروتينات المرتبطة بالحمض النووي الريبي والحمض النووي الريبي الميكروي. علاوة على ذلك ، يتم إفراز circRNAs في سوائل الجسم ، ومقاومتها للإكسونوكلياز تجعلها بمثابة مؤشرات حيوية لتشخيص المرض. تهدف هذه المقالة إلى توضيح كيفية إجراء تصميم التمهيدي المتباعد ، واستخراج الحمض النووي الريبي ، وتوليف الحمض النووي المكمل ، وتحليل dd-PCR لتحديد مستويات الحمض النووي الريبي الدائري المحدد (circRNA) بدقة في الخلايا. في الختام ، نوضح التحديد الكمي الدقيق ل circRNAs باستخدام dd-PCR.

يمكن اشتقاق العدد المطلق ل circRNAs في كل عينة من بيانات dd-PCR المصدرة. اقترح تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي التعبير التفاضلي ل circBnc2 في الأنابيب العضلية المتمايزة C2C12 (البيانات غير معروضة). هنا ، أردنا التحقق من عدد النسخ المطلق ل circBnc2 في تكاثر الأرومات العضلية C...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR at JoVE.com

Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR

يصف هذا البروتوكول الطريقة التفصيلية لتفاعل البوليميراز المتسلسل بالقطرات الرقمية (dd-PCR) من أجل التحديد الكمي الدقيق لمستويات الحمض النووي الريبي الدائري (circRNA) في الخلايا باستخدام بادئات متباينة.

القياس الكمي للحمض النووي الريبي الدائري باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل بالقطرات الرقمية

Digital droplet polymerase chain reaction (dd-PCR) is one of the most sensitive quantification methods; it fractionates the reaction into nearly 20,000 ...

DD-PCR هي طريقة حساسة ودقيقة للغاية للقياس الكمي المطلق للحمض النووي أو الحمض النووي الريبي المستهدف. تم استخدامه لتشخيص المرض حيث تفشل الطرق التقليدية الأخرى في إعطاء نتائج دقيقة. DD-PCR هي التقنية الأكثر حساسية للكشف عن جزيئات الحمض النووي منخفضة جدا وفيرة.على عكس تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي ، لا يتطلب DD-PCR أي تحكم جيني في التدبير المنزلي للقياس الكمي. نظرا لحساسيته ودقته ، يمكن استخدام dd-PCR كأداة للتشخيص الجزيئي والأبحاث التي تتضمن جزيئات RNA منخفضة الوفرة مثل الحمض النووي الريبي الصغير والحمض النووي الريبي الدائري. قبل استخدام dd-PCR ، يجب على المرء إجراء RT-PCR أو RT-qPCR للتأكد من أن البادئات تعمل على تضخيم جيناتها المستهدفة دون أي تضخيم PCR غير محدد.للبدء ، قم بإعداد تسلسل قالب PCR بطول 200 نيوكليوتيد من خلال ضم آخر 100 نيوكليوتيد من إجمالي طول تسلسل الحمض النووي الريبي الدائري إلى أول 100 نيوكليوتيد من تسلسل الحمض النووي الريبي الدائري. استخدم تسلسل القالب للكتاب التمهيدي ، المصمم بواسطة أداة الويب Primer 3. خذ طبقا واحدا يبلغ طوله 10 سنتيمترات يحتوي على حوالي 5 ملايين خلية عضلية C2C12 متكاثرة وأنبوب عضلي C2C12 متمايز لمدة أربعة أيام لعزل الحمض النووي الريبي.اغسل الخلايا ب 10 ملليلتر من 1X PBS ثلاث مرات وتخلص من PBS باستخدام ماصة. أضف ملليلتر واحد من كاشف عزل الحمض النووي الريبي وقم بتحليل الخلايا عن طريق ماصة قوية. ثم أضف 200 ميكرولتر من الكلوروفورم والدوامة لمدة 15 ثانية.جهاز طرد مركزي للأنبوب عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق عند 12،000 G.خذ 400 ميكرولتر من الطبقة المائية العليا ، وقم بتحميله على عمود السيليكا ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة عند 12،000 G في درجة حرارة الغرفة. خذ التدفق إلى أنبوب جديد وأضف 600 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪. أضف 20 ميكرولتر من حبات السيليكا المغناطيسية وضع الأنبوب على خلاط حراري ، مضبوط على 25 درجة مئوية و 1،200 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق.ثم ضع الأنبوب على حامل مغناطيسي لمدة 30 ثانية أو حتى يصبح المحلول واضحا. أعد تعليق حبات السيليكا المغناطيسية في 500 ميكرولتر من محلول الغسيل الذي يحتوي على 90٪ إيثانول. بعد وضع الأنبوب على الحامل المغناطيسي لمدة 30 ثانية ، اترك الحبيبات تستقر باتجاه المغناطيس وتخلص من المخزن المؤقت باستخدام ماصة.جفف الأنبوب بالهواء عند 50 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق على خلاط حراري ، مع إبقاء الغطاء مفتوحا. أضف 20 ميكرولترا من الماء الخالي من النيوكلياز وأعد تعليق الخرز. اجمع الحمض النووي الريبي المذاب في أنبوب جديد لتقييم الكمية والجودة باستخدام مقياس الطيف الضوئي.قم بقياس تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام مقياس الطيف الضوئي وخذ ميكروجراما واحدا من الحمض النووي الريبي لتخليق cDNA. امزج ميكروجراما واحدا من إجمالي الحمض النووي الريبي مع ميكرولتر واحد من مزيج dNTP ، وأربعة ميكرولتر من محلول النسخ العكسي 5X ، وميكرولتر من التمهيدي العشوائي للنسخ العكسي 10X ، و 0.25 ميكرولتر من إنزيم النسخ العكسي ، و 0.5 ميكرولتر من مثبط RNase. تشكل حجم إلى 20 ميكرولتر باستخدام المياه الحرة النيوكلياز.ضع الأنبوب عند 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، تليها 50 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. ثم ضع الأنبوب عند 85 درجة سلزية لمدة خمس دقائق لتعطيل الإنزيم. قم بإعداد تفاعل PCR البالغ 22 ميكرولترا في أنابيب أو شرائط PCR سعة 0.2 ملليلتر ، جنبا إلى جنب مع أنبوب التحكم السلبي وأنابيب التحكم غير القالب.أضف 11 ميكرولترا من المزيج الرئيسي dd-PCR ، و 5.5 ميكرولتر من مزيج التمهيدي الأمامي والخلفي الدائري الخاص بالحمض النووي الريبي بتركيز ميكرومولار واحد ، و 5.5 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز لإعداد أنابيب تفاعل NTC. وبالمثل ، لإعداد أنابيب تفاعل الاختبار ، أضف 11 ميكرولترا من المزيج الرئيسي dd-PCR ، و 5.5 ميكرولتر من مزيج التمهيدي الأمامي والخلفي الدائري الخاص بالحمض النووي الريبي بتركيز ميكرومولار واحد ، و 5.5 ميكرولتر من cDNA. لتوليد القطيرات ، انقل 20 ميكرولترا من خليط PCR من أنابيب PCR 0.2 ملليلتر إلى آبار العينة لخرطوشة مولد القطيرات.أضف 70 ميكرولتر من زيت توليد القطيرات إلى آبار النفط في خرطوشة مولد القطيرات بعناية ، باستخدام ماصة. قم بتغطية خرطوشة مولد القطيرات بحشية مطاطية وضعها في آلة مولد القطيرات للحصول على عينة مزيج قطرات الزيت ، المتولدة في آبار القطيرات للخرطوشة. لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل ، انقل 40 ميكرولترا من عينة مزيج قطرات الزيت من آبار القطيرات لخرطوشة مولد القطيرات إلى لوحة PCR ذات 96 بئرا باستخدام ماصة.أغلق لوحة PCR التي تحتوي على 96 بئرا باستخدام مانع تسرب رقائق الألومنيوم. ضعه في كتلة آلة ختم الألواح ، مسخنا مسبقا عند 180 درجة مئوية ، وانقر فوق الختم لإغلاق لوحة PCR. بعد ذلك ، ضع اللوحة في دورة DD-PCR الحرارية واضبط درجة حرارة الغطاء على 105 درجة مئوية ومعدل المنحدر على درجتين مئويتين في الثانية.بمجرد انتهاء تفاعل البوليميراز المتسلسل ، ضع اللوحة على آلة عداد قطرات dd-PCR مع حامل اللوحة في الموضع الصحيح لحساب القطرات. افتح برنامج تحليل القطرات وقم بإعداد التشغيل من خلال إدخال معلومات العينة. انقر فوق الزر "تحليل" لتحليل البيانات بعد الانتهاء من قراءة القطرات.ثم ، انقر فوق الزر 1D Amplitude لرؤية القطرات الإيجابية والسالبة. لفصل القطرات الإيجابية عن القطرات السالبة ، ضع خط عتبة مشترك لجميع العينات التي لها نفس الهدف. انقر فوق زر التصدير لتصدير بيانات حساب الحمض النووي الريبي الدائري كملف csv.تظهر البيانات المصدرة عدد الحمض النووي الريبي الدائري الموجود في كل عينة. احسب يدويا عدد الحمض النووي الريبوزي الدائري في كل عينة لكل نانوجرام من الحمض النووي الريبوزي (RNA) من خلال النظر في إجمالي كمية الحمض النووي المكمل (cDNA) المستخدمة في كل تفاعل. يظهر تحليل البيانات باستخدام برنامج QuantaSoft هنا.أظهرت جميع العينات باستثناء MT1 أكثر من 12،000 قطرات. نظرا لأن إجمالي عدد القطيرات كان منخفضا في MT1 ، لم يتم النظر في هذه العينة لتحليل البيانات النهائي. ومن المثير للاهتمام ، كان هناك اختلاف واضح في نمط التعبير عن Circ B و C2 في حالة الأنبوب العضلي المتمايز لمدة أربعة أيام مقارنة بخلايا الأرومة العضلية.أشار تحليل وفرة Circ B و C2 من حيث عدد النسخ ، إلى أن النسخ المتماثلة الثلاثة للخلايا العضلية C2C12 تحتوي على 76.8 و 67 و 46 نسخة لكل نانوجرام من الحمض النووي الريبي ، بينما تحتوي عينتا الأنبوب العضلي على 558 و 610 نسخة لكل نانوجرام من الحمض النووي الريبي. تمثل البيانات الموجودة في التمثيل البياني بالأعمدة المتوسط زائد ناقص الانحراف المعياري لاثنين إلى ثلاثة مكررات بيولوجية. ddPCR هي واحدة من أكثر الطرق تقدما لقياس التعبير التفاضلي الدقيق للحمض النووي الريبي الدائري المستهدف.ستكون هذه الطريقة أداة أساسية لتسريع أبحاث الحمض النووي الريبي الدائري وصناعات التشخيص في العام المقبل.

Research

JoVE Journal

Biology

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

من التنميط المسبق الجزئي الرناوات و microRNAs باستخدام الكمية في الوقت الحقيقي PCR (qPCR) صالحة

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Rapid PCR Thermocycling using Microscale Thermal Convection

PCR Thermocycling السريع باستخدام الحراري الحرارية الميكروسكيل

Many molecular biology assays depend in some way on the polymerase chain reaction (PCR) to amplify an initially dilute target DNA sample to a detectable ...

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

عزل الرنا غير المكودة الصغيرة من مصل الإنسان

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

قراءات السائبة بسيطة الرقمية نوكليك حمض الكمي فحوصات

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

توظيف الرقمية القطرة PCR لكشف الطفرات BRAF V600E في البارافين جزءا لا يتجزأ من خطوط الخلايا المعيار المرجعي الفورمالين الثابتة

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

Using Digital Image Correlation to Characterize Local Strains on Vascular Tissue Specimens

باستخدام ارتباط صورة رقمية لوصف سلالات المحلية على الأوعية الدموية عينات الأنسجة

Characterization of the mechanical behavior of biological and engineered soft tissues is a central component of fundamental biomedical research and ...

Genome-wide Purification of Extrachromosomal Circular DNA from Eukaryotic Cells

تنقية الجينوم على نطاق خارج الصبغي التعميم الحمض النووي من خلايا حقيقية النواة

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs ...

Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR

القياس الكمي المطلق من مستويات البلازما MicroRNA في القرود سينومولوغوس، استخدام النسخ العكسي في الوقت الحقيقي الكمي PCR

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This ...

Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit

دهن السريع الحبرية العزلة بروتوكول استخدام عدة عزل عضية الراسخة

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral ...

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

بروتوكولات تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمية لقطرات النسخ العكسي المكونة من خطوتين للكشف عن SARS-CoV-2 وقياسه

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...