Name: quantification of circular rnas using digital droplet pcr
Uploaded: 2022-09-16T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af intramural finansiering fra Institute of Life Sciences, DBT-forskningsbevillingen (BT / PR27622 / MED / 30/1961/2018) og Wellcome Trust / DBT India Alliance Fellowship [IA / I / 18/2/504017] tildelt Amaresh C. Panda. Vi takker andre laboratoriemedlemmer for korrekturlæsning af artiklen.

RNA er følsomt over for RNaser; derfor bør alle reagenser, instrumenter og arbejdsområder være RNase-fri og håndteres med omhu.
1. Divergerende primerdesign til circRNA (se figur 1)
<ol><li>Hent den modne sekvens fra circRNA-annotationsdata ved hjælp af BEDTools eller fra UCSC-genombrowseren ved at slutte sig til exon / intron-sekvensen, der er til stede mellem backsplice-forbindelseskoordinaterne18,19</s...

<ol>
	<li>Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+the+predominant+transcript+isoform+from+hundreds+of+human+genes+in+diverse+cell+types.">Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types.</a> PLoS One. 7 (2), 30733 (2012).</li><li>Chen, L. L., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+circRNA+biogenesis.">Regulation of circRNA biogenesis.</a> RNA Biology. 12 (4), 381-388 (2015).</li><li>Kristensen, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biogenesis,+biology+and+characterization+of+circular+RNAs.">The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs.</a> Nature Reviews Genetics. 20 (11), 675-691 (2019).</li><li>Chen, X., Zhou, M., Yant, L., Huang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNA+in+disease:+Basic+properties+and+biomedical+relevance.">Circular RNA in disease: Basic properties and biomedical relevance.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. , (2022).</li><li>Sinha, T., Panigrahi, C., Das, D., Chandra Panda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNA+translation,+a+path+to+hidden+proteome.">Circular RNA translation, a path to hidden proteome.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 13 (1), 1685 (2022).</li><li>Panda, A. C., Xiao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+Act+as+miRNA+Sponges.">Circular RNAs Act as miRNA Sponges.</a> Circular RNAs: Biogenesis and Functions. , 67-79 (2018).</li><li>Das, A., Sinha, T., Shyamal, S., Panda, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+role+of+circular+RNA-protein+interactions.">Emerging role of circular RNA-protein interactions.</a> Non-Coding RNA. 7 (3), 48 (2021).</li><li>Verduci, L., Tarcitano, E., Strano, S., Yarden, Y., Blandino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CircRNAs:+Role+in+human+diseases+and+potential+use+as+biomarkers.">CircRNAs: Role in human diseases and potential use as biomarkers.</a> Cell Death &amp; Disease. 12 (5), 468 (2021).</li><li>Pandey, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+analysis+of+circular+RNAs.">Methods for analysis of circular RNAs.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 11 (1), 1566 (2020).</li><li>Das, A., Das, D., Panda, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+circular+RNAs+by+PCR.">Validation of circular RNAs by PCR.</a> PCR Primer Design. Methods in Molecular Biology. 2392, 103-114 (2022).</li><li>Jeck, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+abundant,+conserved,+and+associated+with+ALU+repeats.">Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats.</a> RNA. 19 (2), 141-157 (2013).</li><li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+droplet+digital+polymerase+chain+reaction+format+for+DNA+copy+number+quantification.">Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification.</a> Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).</li><li>Hayden, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+droplet+digital+PCR+to+real-time+PCR+for+quantitative+detection+of+cytomegalovirus.">Comparison of droplet digital PCR to real-time PCR for quantitative detection of cytomegalovirus.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (2), 540-546 (2013).</li><li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets:+From+variable+nonsense+to+publication+quality+data.">Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: From variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7, 2409 (2017).</li><li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number.">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li><li>Ishak, A., AlRawashdeh, M. M., Esagian, S. M., Nikas, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic,+prognostic,+and+therapeutic+value+of+droplet+digital+PCR+(ddPCR)+in+COVID-19+patients:+A+systematic+review.">Diagnostic, prognostic, and therapeutic value of droplet digital PCR (ddPCR) in COVID-19 patients: A systematic review.</a> Journal of Clinical Medicine. 10 (23), 5712 (2021).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+droplet+digital+PCR+to+detect+the+pathogens+of+infectious+diseases.">Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases.</a> Bioscience Reports. 38 (6), (2018).</li><li>Lee, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+UCSC+genome+browser+database:+2022+update.">The UCSC genome browser database: 2022 update.</a> Nucleic Acids Research. 50, 1115-1122 (2022).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+A+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li><li>Untergasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer3--new+capabilities+and+interfaces.">Primer3--new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Research. 40 (15), 115 (2012).</li><li>Das, A., Das, D., Das, A., Panda, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quick+and+cost-effective+method+for+DNA-free+total+RNA+isolation+using+magnetic+silica+beads.">A quick and cost-effective method for DNA-free total RNA isolation using magnetic silica beads.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Oberacker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Synthesis+of+Functionalized+Paramagnetic+Beads+for+Nucleic+Acid+Purification+and+Manipulation.">Simple Synthesis of Functionalized Paramagnetic Beads for Nucleic Acid Purification and Manipulation.</a> Bio-protocol. 9 (20), 3394 (2019).</li><li>Ra&#269;ki, N., Dreo, T., Gutierrez-Aguirre, I., Blejec, A., Ravnikar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+transcriptase+droplet+digital+PCR+shows+high+resilience+to+PCR+inhibitors+from+plant,+soil+and+water+samples.">Reverse transcriptase droplet digital PCR shows high resilience to PCR inhibitors from plant, soil and water samples.</a> Plant Methods. 10 (1), 42 (2014).</li><li>Taylor, S. C., Carbonneau, J., Shelton, D. N., Boivin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+droplet+digital+PCR+from+RNA+and+DNA+extracts+with+direct+comparison+to+RT-qPCR:+Clinical+implications+for+quantification+of+Oseltamivir-resistant+subpopulations.">Optimization of droplet digital PCR from RNA and DNA extracts with direct comparison to RT-qPCR: Clinical implications for quantification of Oseltamivir-resistant subpopulations.</a> Journal of Virological Methods. 224, 58-66 (2015).</li></ol>

CircRNA-forskning er vokset i det sidste årti med opdagelsen af high-throughput sekventeringsteknologier. Som et resultat er det blevet betragtet som et potentielt molekyle til fremtidige RNA-terapier. Derudover er det kendt for at fungere som en biomarkør i flere sygdomme, herunder kræft og hjerte-kar-sygdomme 4,8. Imidlertid er identifikationen af circRNA vanskelig på grund af dens lave overflod, og den har kun en specifik backsplice-krydssekvens, der adski...

Nylige fremskridt inden for RNA-sekventeringsteknologier og nye beregningsalgoritmer har opdaget et nyt medlem af den voksende familie af ikke-kodende RNA'er, kaldet cirkulært RNA (circRNA)1. Som navnet antyder, er circRNA'er en familie af enkeltstrengede RNA-molekyler uden frie ender. De er dannet ved ikke-kanonisk head-to-tail splejsning kaldet back-splejsning, hvor det opstrøms splejsningsacceptorsted forbinder kovalent med det nedstrøms splejsningsdonorsted for at danne en stabil RNA-cirkel 1,2. Denne proces kan medieres af flere faktorer, herunder inverterede Alu gentagne elementer, der er til stede i opstrøms og nedstrøms for cirkulariserede exoner, eller kan medieres af nogle splejsningsfaktorer eller RNA-bindende proteiner (RBP'er)2,3. Cirkulære RNA'er, der udelukkende genereres fra exonic eller intronic-sekvensen, klassificeres som exonic circRNA og cirkulære intronic RNA'er eller ci-RNA'er, mens nogle exonic circRNA'er bevarer intron og kaldes exon-intron circRNA'er (EIcircRNA'er)3,4. Funktionerne i circRNA'er er mangefacetterede, herunder sponging miRNA og / eller RBP, regulering af transkription og regulering af cellulær funktion ved at oversætte til peptider 3,5,6,7. Flere rapporter har fremhævet betydningen af circRNA'er i forskellige sygdomme og fysiologiske processer8. Desuden gør vævsspecifikke ekspressionsmønstre og resistens over for exonukleasefordøjelse det til en funktionel biomarkør til sygdomsdiagnose, og det kan også bruges som et passende terapeutisk mål8. I betragtning af dets betydning for regulering af sundhed og sygdomme er den nøjagtige kvantificering af circRNA-ekspression timens behov.
Flere biokemiske metoder er blevet udviklet til kvantificering af circRNA'er i biologiske prøver9. En af de mest bekvemme og bredt accepterede metoder til circRNA-kvantificering er omvendt transkription efterfulgt af kvantitativ polymerasekædereaktion (RT-qPCR) ved anvendelse af divergerende primerpar10. Imidlertid er størstedelen af circRNA'er i lav overflod sammenlignet med lineære mRNA'er, hvilket gør det udfordrende at kvantificere dem11. For at løse dette problem forsøgte vi at bruge digital dråbe-PCR (dd-PCR) til at kvantificere antallet af circRNA'er i en given prøve nøjagtigt. dd-PCR er en avanceret PCR-teknologi, der følger mikrofluidikprincippet; det genererer flere vandige dråber i olie, og PCR forekommer i hver dråbe som en individuel reaktion12. Reaktionen forekommer i individuelle dråber og analyseres ved hjælp af en dråbelæser, som giver antallet af positive eller negative dråber for genet af interesse12. Det er den mest følsomme teknik til nøjagtigt at kvantificere et gen af interesse, selvom der kun er en enkelt kopi i en given prøve. Nedsat følsomhed over for hæmmere, bedre præcision og udeladelse af referencegenet til kvantificering gør det mere fordelagtigt end konventionel qPCR13,14,15. Det er blevet brugt i vid udstrækning som et forsknings- og diagnostisk værktøj til absolut kvantificering af et gen af interesse16,17. Her beskriver vi den detaljerede dd-PCR-protokol til circRNA-kvantificering ved differentiering af mus C2C12 myorør og prolifererende mus C2C12 myoblaster ved hjælp af divergerende primere.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >1.5 ml microcentifuge tube</td>
			<td >Tarson</td>
			<td >500010</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.2 ml tube strips with cap</td>
			<td >Tarson</td>
			<td >610020, 510073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filter Tips</td>
			<td >Tarson</td>
			<td >528104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >10977023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell scrapper</td>
			<td >HiMedia</td>
			<td >TCP223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chloroform</td>
			<td >SRL</td>
			<td >96764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA diluent</td>
			<td >HiMedia</td>
			<td >MB228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Random primers</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >48190011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >dNTP set</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >R0181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Murine RNase inhibitor</td>
			<td >NEB</td>
			<td >M0314S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Maxima reverse transcriptase</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >EP0743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 dd-PCR Evagreen Supermix</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Droplet generation oil for Evagreen</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1814040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DG8 Cartridges and Gaskets</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DG8 Cartridge holder</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1863051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 Droplet Generator</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ddPCR 96-Well Plates</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >12001925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PX1 PCR Plate Sealer</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1814000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C1000 Touch Thermal Cycler with 96&#8211;Deep Well Reaction Module</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1851197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 Droplet Reader</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Quantasoft Software</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silica column</td>
			<td >Umbrella Life Science</td>
			<td >38220090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UCSC Genome Browser</td>
			<td ></td>
			<td >https://genome.ucsc.edu/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primer 3</td>
			<td ></td>
			<td >https://primer3.ut.ee/</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of circular rnas using digital droplet pcr

Digital dråbepolymerasekædereaktion (dd-PCR) er en af de mest følsomme kvantificeringsmetoder; det opdeler reaktionen i næsten 20.000 vand-i-olie-dråber, og PCR forekommer i de enkelte dråber. dd-PCR har flere fordele i forhold til konventionel qPCR i realtid, herunder øget nøjagtighed ved påvisning af mål med lav forekomst, udeladelse af referencegener til kvantificering, eliminering af tekniske replikater for prøver og viser høj modstandsdygtighed over for hæmmere i prøverne. For nylig er dd-PCR blevet en af de mest populære metoder til nøjagtig kvantificering af mål-DNA eller RNA til genekspressionsanalyse og diagnostik. Cirkulære RNA'er (circRNA'er) er en stor familie af nyligt opdagede kovalent lukkede RNA-molekyler, der mangler 5 'og 3' ender. De har vist sig at regulere genekspression ved at fungere som svampe for RNA-bindende proteiner og mikroRNA'er. Desuden udskilles circRNA'er i kropsvæsker, og deres modstand mod exonukleaser får dem til at fungere som biomarkører til sygdomsdiagnose. Denne artikel har til formål at vise, hvordan man udfører divergerende primerdesign, RNA-ekstraktion, cDNA-syntese og dd-PCR-analyse for nøjagtigt at kvantificere specifikke cirkulære RNA (circRNA) niveauer i celler. Afslutningsvis demonstrerer vi den nøjagtige kvantificering af circRNA'er ved hjælp af dd-PCR.

Det absolutte antal circRNA'er i hver prøve kan udledes af de eksporterede dd-PCR-data. Kvantitativ PCR-analyse i realtid foreslog differentiel ekspression af circBnc2 i de differentierede C2C12 myotuber (data ikke vist). Her ønskede vi at kontrollere det absolutte kopinummer af circBnc2 i prolifererende C2C12 myoblaster og myotubes. Da ekspressionen af circBnc2 sammenlignes under to betingelser, er det virkelig vigtigt at behandle alle prøver til RNA-isolering, cDNA-syntese og PCR samtidigt...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR at JoVE.com

Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR

Denne protokol beskriver den detaljerede metode til digital dråbe PCR (dd-PCR) til præcis kvantificering af cirkulære RNA (circRNA) niveauer i celler ved hjælp af divergerende primere.

Kvantificering af cirkulære RNA'er ved hjælp af digital dråbe-PCR

Digital droplet polymerase chain reaction (dd-PCR) is one of the most sensitive quantification methods; it fractionates the reaction into nearly 20,000 ...

dd-PCR er en meget følsom og nøjagtig metode til absolut kvantificering af mål-DNA eller RNA. Det er blevet brugt til sygdomsdiagnose, hvor andre konventionelle metoder ikke giver nøjagtige resultater. dd-PCR er den mest følsomme teknik til påvisning af meget lave rigelige nukleinsyremolekyler.I modsætning til kvantitativ PCR kræver dd-PCR ingen husholdningsgenkontrol til kvantificering. På grund af dets følsomhed og nøjagtighed kan dd-PCR bruges som et værktøj til molekylær diagnostik og forskning, der involverer lavabundant RNA-molekyler som mikro-RNA'er og cirkulære RNA'er. Før man bruger dd-PCR, skal man udføre RT-PCR eller RT-qPCR for at bekræfte, at primerne forstærker deres målgener uden nogen ikke-specifik PCR-forstærkning.Til at begynde med skal du forberede en PCR-skabelonsekvens af 200 nukleotider i længden ved at forbinde de sidste 100 nukleotider af den samlede cirkulære RNA-sekvenslængde til de første 100 nukleotider af den cirkulære RNA-sekvens. Brug skabelonsekvensen til primer, designet af Primer 3-webværktøjet. Tag en 10 centimeter skål, der indeholder ca. 5 millioner prolifererende C2C12 myoblastceller og en fire-dages differentieret C2C12 myotube til RNA-isolering.Cellerne vaskes med 10 ml 1X PBS tre gange, og PBS kasseres ved hjælp af en pipette. Tilsæt en milliliter RNA-isolationsreagens og lys cellerne ved kraftig pipettering. Derefter tilsættes 200 mikroliter chloroform og hvirvel i 15 sekunder.Centrifuge røret ved fire grader Celsius i 10 minutter ved 12.000 G.Tag 400 mikroliter af det øvre vandige lag, læg det på en silicakolonne og centrifuge i et minut ved 12.000 G ved stuetemperatur. Tag strømmen igennem til et nyt rør og tilsæt 600 mikroliter 100% ethanol. Tilsæt 20 mikroliter magnetiske silicaperler og læg røret på en termomixer, indstillet til 25 grader Celsius og 1.200 o / min i fem minutter.Placer derefter røret på et magnetisk stativ i 30 sekunder, eller indtil opløsningen bliver klar. Resuspender de magnetiske silicaperler i 500 mikroliter vaskebuffer indeholdende 90% ethanol. Når røret er placeret på magnetstativet i 30 sekunder, skal du lade perlerne sætte sig mod magneten og kassere bufferen ved hjælp af en pipette.Lufttør røret ved 50 grader Celsius i tre minutter på en termomixer og holder låget åbent. Tilsæt 20 mikroliter nukleasefrit vand og suspender perlerne igen. Det opløste RNA samles i et nyt rør til kvantitets- og kvalitetsvurdering ved hjælp af et spektrofotometer.Mål RNA-koncentrationen ved hjælp af et spektrofotometer og tag et mikrogram RNA til cDNA-syntese. Bland et mikrogram total RNA med en mikroliter dNTP-blanding, fire mikroliter 5X omvendt transkriptasebuffer, to mikroliter 10X omvendt transkriptase tilfældig primer, 0,25 mikroliter omvendt transkriptaseenzym og 0,5 mikroliter RNase-hæmmer. Fyld volumenet op til 20 mikroliter ved hjælp af nukleasefrit vand.Placer røret ved 25 grader Celsius i 10 minutter efterfulgt af 50 grader Celsius i en time. Placer derefter røret ved 85 grader Celsius i fem minutter for at inaktivere enzymet. Indstil PCR-reaktionen på 22 mikroliter i 0,2 milliliter PCR-rør eller strimler sammen med et negativt kontrolrør og ikke-skabelonkontrolrør.Tilsæt 11 mikroliter dd-PCR-mastermix, 5,5 mikroliter cirkulær RNA-specifik fremadgående og omvendt primerblanding af en mikromolær koncentration og 5,5 mikroliter nukleasefrit vand for at oprette NTC-reaktionsrørene. På samme måde tilsættes 11 mikroliter dd-PCR-masterblanding for at opsætte reagensreaktionsrørene, 5,5 mikroliter cirkulær RNA-specifik fremadgående og omvendt primerblanding af en mikromolær koncentration og 5,5 mikroliter cDNA. Til dråbegenereringen overføres 20 mikroliter af PCR-blandingen fra 0,2 ml PCR-rør til prøvebrøndene i dråbegeneratorpatronen.Tilsæt 70 mikroliter dråbegenereringsolie til oliebrøndene i dråbegeneratorpatronen omhyggeligt ved hjælp af en pipette. Dæk dråbegeneratorpatronen med en gummipakning, og læg den i dråbegeneratormaskinen for at få prøveoliedråbeblandingen, der genereres i patronens dråbebrønde. Til PCR-forstærkning overføres 40 mikroliter af prøveoliedråbeblandingen fra dråbegeneratorpatronens dråbebrønde til en 96-brønds PCR-plade ved hjælp af en pipette.Forsegl PCR-pladen med 96 brønde med aluminiumsfolieforsegleren. Placer den i pladeforseglermaskinblokken, forvarmet ved 180 grader Celsius, og klik på tætning til tætning af PCR-pladen. Placer derefter pladen i dd-PCR termisk cyklist og indstil lågtemperaturen til 105 grader Celsius og en rampehastighed til to grader Celsius pr. Sekund.Når PCR er overstået, skal du placere pladen på dd-PCR-dråbetællermaskinen med pladeholderen i den rigtige position til tælling af dråberne. Åbn dråbeanalysesoftwaren, og opsæt kørslen ved at give input af eksempeloplysningerne. Klik på analyseknappen for at analysere dataene efter afslutningen af dråbeaflæsningen.Klik derefter på knappen 1D-amplitude for at se de positive og negative dråber. For at adskille de positive dråber fra de negative dråber skal du sætte en fælles tærskellinje for alle prøver med samme mål. Klik på eksportknappen for at eksportere de cirkulære RNA-tællingsdata som en csv-fil.De eksporterede data viser antallet af cirkulære RNA'er, der er til stede i hver prøve. Beregn manuelt antallet af cirkulære RNA'er i hver prøve pr. nanogram RNA ved at overveje den samlede mængde cDNA, der anvendes i hver reaktion. Dataanalysen ved hjælp af QuantaSoft Software vises her.Alle prøver undtagen MT1 viste mere end 12.000 dråbetællinger. Da det samlede dråbeantal var lavt i MT1, blev denne stikprøve ikke taget i betragtning til den endelige dataanalyse. Interessant nok var der en klar forskel i ekspressionsmønsteret for Circ B og C2 i den fire dages differentierede myotube-tilstand sammenlignet med myoblastcellerne.Analysen af Circ B og C2 overflod med hensyn til kopiantal viste, at de tre replikater af C2C12 myoblaster havde 76,8, 67 og 46 kopier pr. nanogram RNA, mens de to myotubeprøver havde 558 og 610 kopier pr. nanogram RNA. Dataene i søjlediagrammet repræsenterer den gennemsnitlige plus minus standardafvigelse på to til tre biologiske replikater. ddPCR er en af de mest avancerede metoder til at måle den nøjagtige differentielle ekspression af målcirkulært RNA.Denne metode vil være et vigtigt redskab til at fremskynde cirkulær RNA-forskning og diagnostiske industrier i det kommende år.

Research

JoVE Journal

Biology

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Rapid PCR Thermocycling using Microscale Thermal Convection

Many molecular biology assays depend in some way on the polymerase chain reaction (PCR) to amplify an initially dilute target DNA sample to a detectable ...

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

Isolering af Small noncoding RNA&#39;er fra human serum

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Enkel Bulk Udlæsning af digitale Nucleic Acid Kvantificering Analyser

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

Anvender digitale Droplet PCR til Detect BRAF V600E Mutationer i formalinfikserede paraffinindlejrede Reference Standard cellelinier

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

Using Digital Image Correlation to Characterize Local Strains on Vascular Tissue Specimens

Brug Digital Image Korrelation til Karakterisere Lokale Stammer på Vaskulære vævsprøver

Characterization of the mechanical behavior of biological and engineered soft tissues is a central component of fundamental biomedical research and ...

Genome-wide Purification of Extrachromosomal Circular DNA from Eukaryotic Cells

Hele genomet Oprensning af ekstrakromosomalt cirkulært DNA fra eukaryote celler

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs ...

Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR

Absolut kvantificering af mikroRNA plasmaniveauer i Cynomolgus aber, ved hjælp af kvantitative Real-time Reverse transkription PCR

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This ...

Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit

Hurtig Lipid Droplet Isolation protokollen ved hjælp af en almindelig Organelle isolering Kit

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral ...

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

To-trins omvendt transkriptionsdråbe digitale PCR-protokoller til SARS-CoV-2-detektion og kvantificering

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...