Name: quantification of circular rnas using digital droplet pcr
Uploaded: 2022-09-16T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door intramurale financiering van het Institute of Life Sciences, de DBT-onderzoeksbeurs (BT / PR27622 / MED / 30/1961/2018) en de Wellcome Trust / DBT India Alliance Fellowship [IA / I / 18/2/ 504017] toegekend aan Amaresh C. Panda. We bedanken andere lableden voor het proeflezen van het artikel.

RNA is gevoelig voor RN's; daarom moeten alle reagentia, instrumenten en werkruimten RNase-vrij zijn en met zorg worden behandeld.
1. Divergent primerontwerp voor circRNA (zie figuur 1)
<ol><li>Haal de volwassen sequentie op uit circRNA-annotatiegegevens met BEDTools of uit de UCSC-genoombrowser door de exon/intron-sequentie samen te voegen die aanwezig is tussen de backsplice-junctiecoördinaten18,19<sup...

<ol>
	<li>Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+the+predominant+transcript+isoform+from+hundreds+of+human+genes+in+diverse+cell+types.">Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types.</a> PLoS One. 7 (2), 30733 (2012).</li><li>Chen, L. L., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+circRNA+biogenesis.">Regulation of circRNA biogenesis.</a> RNA Biology. 12 (4), 381-388 (2015).</li><li>Kristensen, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biogenesis,+biology+and+characterization+of+circular+RNAs.">The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs.</a> Nature Reviews Genetics. 20 (11), 675-691 (2019).</li><li>Chen, X., Zhou, M., Yant, L., Huang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNA+in+disease:+Basic+properties+and+biomedical+relevance.">Circular RNA in disease: Basic properties and biomedical relevance.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. , (2022).</li><li>Sinha, T., Panigrahi, C., Das, D., Chandra Panda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNA+translation,+a+path+to+hidden+proteome.">Circular RNA translation, a path to hidden proteome.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 13 (1), 1685 (2022).</li><li>Panda, A. C., Xiao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+Act+as+miRNA+Sponges.">Circular RNAs Act as miRNA Sponges.</a> Circular RNAs: Biogenesis and Functions. , 67-79 (2018).</li><li>Das, A., Sinha, T., Shyamal, S., Panda, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+role+of+circular+RNA-protein+interactions.">Emerging role of circular RNA-protein interactions.</a> Non-Coding RNA. 7 (3), 48 (2021).</li><li>Verduci, L., Tarcitano, E., Strano, S., Yarden, Y., Blandino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CircRNAs:+Role+in+human+diseases+and+potential+use+as+biomarkers.">CircRNAs: Role in human diseases and potential use as biomarkers.</a> Cell Death &amp; Disease. 12 (5), 468 (2021).</li><li>Pandey, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+analysis+of+circular+RNAs.">Methods for analysis of circular RNAs.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 11 (1), 1566 (2020).</li><li>Das, A., Das, D., Panda, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+circular+RNAs+by+PCR.">Validation of circular RNAs by PCR.</a> PCR Primer Design. Methods in Molecular Biology. 2392, 103-114 (2022).</li><li>Jeck, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+abundant,+conserved,+and+associated+with+ALU+repeats.">Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats.</a> RNA. 19 (2), 141-157 (2013).</li><li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+droplet+digital+polymerase+chain+reaction+format+for+DNA+copy+number+quantification.">Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification.</a> Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).</li><li>Hayden, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+droplet+digital+PCR+to+real-time+PCR+for+quantitative+detection+of+cytomegalovirus.">Comparison of droplet digital PCR to real-time PCR for quantitative detection of cytomegalovirus.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (2), 540-546 (2013).</li><li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets:+From+variable+nonsense+to+publication+quality+data.">Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: From variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7, 2409 (2017).</li><li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number.">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li><li>Ishak, A., AlRawashdeh, M. M., Esagian, S. M., Nikas, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic,+prognostic,+and+therapeutic+value+of+droplet+digital+PCR+(ddPCR)+in+COVID-19+patients:+A+systematic+review.">Diagnostic, prognostic, and therapeutic value of droplet digital PCR (ddPCR) in COVID-19 patients: A systematic review.</a> Journal of Clinical Medicine. 10 (23), 5712 (2021).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+droplet+digital+PCR+to+detect+the+pathogens+of+infectious+diseases.">Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases.</a> Bioscience Reports. 38 (6), (2018).</li><li>Lee, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+UCSC+genome+browser+database:+2022+update.">The UCSC genome browser database: 2022 update.</a> Nucleic Acids Research. 50, 1115-1122 (2022).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+A+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li><li>Untergasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer3--new+capabilities+and+interfaces.">Primer3--new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Research. 40 (15), 115 (2012).</li><li>Das, A., Das, D., Das, A., Panda, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quick+and+cost-effective+method+for+DNA-free+total+RNA+isolation+using+magnetic+silica+beads.">A quick and cost-effective method for DNA-free total RNA isolation using magnetic silica beads.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Oberacker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Synthesis+of+Functionalized+Paramagnetic+Beads+for+Nucleic+Acid+Purification+and+Manipulation.">Simple Synthesis of Functionalized Paramagnetic Beads for Nucleic Acid Purification and Manipulation.</a> Bio-protocol. 9 (20), 3394 (2019).</li><li>Ra&#269;ki, N., Dreo, T., Gutierrez-Aguirre, I., Blejec, A., Ravnikar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+transcriptase+droplet+digital+PCR+shows+high+resilience+to+PCR+inhibitors+from+plant,+soil+and+water+samples.">Reverse transcriptase droplet digital PCR shows high resilience to PCR inhibitors from plant, soil and water samples.</a> Plant Methods. 10 (1), 42 (2014).</li><li>Taylor, S. C., Carbonneau, J., Shelton, D. N., Boivin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+droplet+digital+PCR+from+RNA+and+DNA+extracts+with+direct+comparison+to+RT-qPCR:+Clinical+implications+for+quantification+of+Oseltamivir-resistant+subpopulations.">Optimization of droplet digital PCR from RNA and DNA extracts with direct comparison to RT-qPCR: Clinical implications for quantification of Oseltamivir-resistant subpopulations.</a> Journal of Virological Methods. 224, 58-66 (2015).</li></ol>

CircRNA-onderzoek is het afgelopen decennium gegroeid met de ontdekking van high-throughput sequencing-technologieën. Als gevolg hiervan is het beschouwd als een potentieel molecuul voor toekomstige RNA-therapeutica. Bovendien is bekend dat het fungeert als een biomarker bij verschillende ziekten, waaronder kanker en hart- en vaatziekten 4,8. De identificatie van circRNA is echter lastig vanwege de lage abundantie en het heeft slechts één specifieke backsplice...

Recente ontwikkelingen in RNA-sequencingtechnologieën en nieuwe computationele algoritmen hebben een nieuw lid ontdekt van de groeiende familie van niet-coderende RNA's, genaamd circulair RNA (circRNA)1. Zoals de naam al doet vermoeden, zijn circRNA's een familie van enkelstrengs RNA-moleculen zonder vrije uiteinden. Ze worden gevormd door niet-canonieke head-to-tail splicing genaamd back-splicing, waarbij de upstream splice acceptor site covalent aansluit op de downstream splice donor site om een stabiele RNA cirkel 1,2 te vormen. Dit proces kan worden gemedieerd door verschillende factoren, waaronder omgekeerde Alu-repetitieve elementen die aanwezig zijn in de upstream en downstream van gecirculeerde exonen, of kan worden gemedieerd door sommige splicingfactoren of RNA-bindende eiwitten (RBPs)2,3. Circulaire RNA's die uitsluitend uit de exonische of intronische sequentie worden gegenereerd, worden geclassificeerd als exonische circRNA en circulaire intronische RNA's of ci-RNA's, terwijl sommige exonische circRNA's het intron behouden en exon-intron circRNA's (EIcircRNA's) worden genoemd(EIcircRNA's)3,4. De functies van circRNA's zijn veelzijdig, waaronder het sponzen van miRNA en/of RBP, het reguleren van transcriptie en het reguleren van de cellulaire functie door te vertalen in peptiden 3,5,6,7. Verschillende rapporten hebben het belang van circRNA's in verschillende ziekten en fysiologische processen benadrukt8. Bovendien maken weefselspecifieke expressiepatronen en resistentie tegen exonucleasevertering het een functionele biomarker voor ziektediagnose en kan het ook worden gebruikt als een geschikt therapeutisch doelwit8. Gezien het belang ervan bij het reguleren van gezondheid en ziekten, is de nauwkeurige kwantificering van circRNA-expressie de behoefte van het uur.
Er zijn verschillende biochemische methoden ontwikkeld om cirkelRNA's in biologische monsters te kwantificeren9. Een van de handigste en meest geaccepteerde methoden voor circRNA-kwantificering is reverse transcriptie gevolgd door kwantitatieve polymerasekettingreactie (RT-qPCR) met behulp van divergente primerparen10. De meerderheid van de circRNA's is echter in lage abundantie in vergelijking met lineaire mRNA's, waardoor het een uitdaging is om ze te kwantificeren11. Om dit probleem op te lossen, hebben we geprobeerd om digitale druppel-PCR (dd-PCR) te gebruiken om het aantal cirkel-RNA's in een bepaald monster nauwkeurig te kwantificeren. De dd-PCR is een geavanceerde PCR-technologie die het microfluïdica-principe volgt; het genereert meerdere waterige druppels in olie en de PCR komt in elke druppel voor als een individuele reactie12. De reactie treedt op in individuele druppels en wordt geanalyseerd met behulp van een druppellezer, die het aantal positieve of negatieve druppels voor het gen van belang geeft12. Het is de meest gevoelige techniek om een gen van belang nauwkeurig te kwantificeren, zelfs als er slechts één kopie in een bepaald monster is. Verminderde gevoeligheid voor remmers, betere precisie en het weglaten van het referentiegen voor kwantificering maken het voordeliger dan conventionele qPCR 13,14,15. Het is op grote schaal gebruikt als een onderzoeks- en diagnostisch hulpmiddel voor de absolute kwantificering van een gen van belang16,17. Hier beschrijven we het gedetailleerde dd-PCR-protocol voor circRNA-kwantificering bij het differentiëren van muis C2C12-myotubes en prolifererende muis C2C12-myoblasten met behulp van divergente primers.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >1.5 ml microcentifuge tube</td>
			<td >Tarson</td>
			<td >500010</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.2 ml tube strips with cap</td>
			<td >Tarson</td>
			<td >610020, 510073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filter Tips</td>
			<td >Tarson</td>
			<td >528104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >10977023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell scrapper</td>
			<td >HiMedia</td>
			<td >TCP223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chloroform</td>
			<td >SRL</td>
			<td >96764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA diluent</td>
			<td >HiMedia</td>
			<td >MB228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Random primers</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >48190011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >dNTP set</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >R0181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Murine RNase inhibitor</td>
			<td >NEB</td>
			<td >M0314S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Maxima reverse transcriptase</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >EP0743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 dd-PCR Evagreen Supermix</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Droplet generation oil for Evagreen</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1814040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DG8 Cartridges and Gaskets</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DG8 Cartridge holder</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1863051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 Droplet Generator</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ddPCR 96-Well Plates</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >12001925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PX1 PCR Plate Sealer</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1814000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C1000 Touch Thermal Cycler with 96&#8211;Deep Well Reaction Module</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1851197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 Droplet Reader</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Quantasoft Software</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silica column</td>
			<td >Umbrella Life Science</td>
			<td >38220090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UCSC Genome Browser</td>
			<td ></td>
			<td >https://genome.ucsc.edu/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primer 3</td>
			<td ></td>
			<td >https://primer3.ut.ee/</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of circular rnas using digital droplet pcr

Digitale druppelpolymerasekettingreactie (dd-PCR) is een van de meest gevoelige kwantificeringsmethoden; het fractioneert de reactie in bijna 20.000 water-in-oliedruppels en de PCR komt voor in de individuele druppels. De dd-PCR heeft verschillende voordelen ten opzichte van conventionele real-time qPCR, waaronder verhoogde nauwkeurigheid bij het detecteren van doelen met een lage abundantie, het weglaten van referentiegenen voor kwantificering, het elimineren van technische replicaties voor monsters en het tonen van een hoge veerkracht tegen remmers in de monsters. Onlangs is dd-PCR een van de meest populaire methoden geworden voor het nauwkeurig kwantificeren van doel-DNA of RNA voor genexpressieanalyse en diagnostiek. Circulaire RNA's (circRNA's) zijn een grote familie van recent ontdekte covalent gesloten RNA-moleculen zonder 5' en 3' uiteinden. Het is aangetoond dat ze genexpressie reguleren door te fungeren als sponzen voor RNA-bindende eiwitten en microRNA's. Bovendien worden circRNA's uitgescheiden in lichaamsvloeistoffen en hun weerstand tegen exonucleasen zorgt ervoor dat ze dienen als biomarkers voor ziektediagnose. Dit artikel is bedoeld om te laten zien hoe divergent primerontwerp, RNA-extractie, cDNA-synthese en dd-PCR-analyse kunnen worden uitgevoerd om specifieke circulaire RNA (circRNA) niveaus in cellen nauwkeurig te kwantificeren. Tot slot demonstreren we de precieze kwantificering van circRNA's met behulp van dd-PCR.

Het absolute aantal cirkel-RNA's in elk monster kan worden afgeleid uit de geëxporteerde dd-PCR-gegevens. Real-time kwantitatieve PCR-analyse suggereerde differentiële expressie van circBnc2 in de gedifferentieerde C2C12-myotubes (gegevens niet getoond). Hier wilden we het absolute kopienummer van circBnc2 controleren in prolifererende C2C12-myoblasten en myotubes. Omdat de expressie van circBnc2 in twee omstandigheden wordt vergeleken, is het erg belangrijk om alle monsters voor RNA-isolatie...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR at JoVE.com

Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR

Dit protocol beschrijft de gedetailleerde methode van digitale druppel PCR (dd-PCR) voor nauwkeurige kwantificering van circulaire RNA (circRNA) niveaus in cellen met behulp van divergente primers.

Kwantificering van circulaire RNA's met behulp van digitale druppel-PCR

Digital droplet polymerase chain reaction (dd-PCR) is one of the most sensitive quantification methods; it fractionates the reaction into nearly 20,000 ...

dd-PCR is een zeer gevoelige en nauwkeurige methode voor absolute kwantificering van doel-DNA of RNA. Het is gebruikt voor ziektediagnose waar andere conventionele methoden geen nauwkeurige resultaten geven. dd-PCR is de meest gevoelige techniek voor het detecteren van zeer lage overvloedige nucleïnezuurmoleculen.In tegenstelling tot kwantitatieve PCR vereist dd-PCR geen huishoudgencontrole voor kwantificering. Vanwege de gevoeligheid en nauwkeurigheid kan dd-PCR worden gebruikt als een hulpmiddel voor moleculaire diagnostiek en onderzoek met laag overvloedige RNA-moleculen zoals micro-RNA's en circulaire RNA's. Alvorens dd-PCR te gebruiken, moet men RT-PCR of RT-qPCR uitvoeren om te bevestigen dat de primers hun doelgenen versterken zonder enige niet-specifieke PCR-amplificatie.Bereid om te beginnen een PCR-sjabloonsequentie van 200 nucleotiden in lengte voor door de laatste 100 nucleotiden van de totale circulaire RNA-sequentielengte samen te voegen met de eerste 100 nucleotiden van de circulaire RNA-sequentie. Gebruik de sjabloonvolgorde voor primer, ontworpen door de Primer 3-webtool. Neem een schaal van 10 centimeter met ongeveer 5 miljoen prolifererende C2C12-myoblastcellen en een vierdaagse gedifferentieerde C2C12-myotube voor RNA-isolatie.Was de cellen drie keer met 10 milliliter 1X PBS en gooi de PBS weg met een pipet. Voeg een milliliter RNA-isolatiereagens toe en lyseer de cellen door krachtig pipetteren. Voeg vervolgens 200 microliter chloroform en vortex toe gedurende 15 seconden.Centrifugeer de buis bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten bij 12.000 G.Neem 400 microliter van de bovenste waterige laag, laad deze op een silicakolom en centrifugeer gedurende één minuut bij 12.000 G bij kamertemperatuur. Neem de stroom door naar een nieuwe buis en voeg 600 microliter 100% ethanol toe. Voeg 20 microliter magnetische silicaparels toe en plaats de buis op een thermomixer, ingesteld op 25 graden Celsius en 1, 200 RPM gedurende vijf minuten.Plaats de buis vervolgens gedurende 30 seconden op een magnetische standaard of totdat de oplossing helder wordt. Resuspendeer de magnetische silicaparels in 500 microliter wasbuffer met 90% ethanol. Nadat u de buis gedurende 30 seconden op de magnetische standaard hebt geplaatst, laat u de kralen zich in de richting van de magneet nestelen en gooit u de buffer weg met een pipet.Droog de buis aan de lucht op 50 graden Celsius gedurende drie minuten op een thermomixer, waarbij het deksel open blijft. Voeg 20 microliter nucleasevrij water toe en resuspendeer de kralen. Verzamel het opgeloste RNA in een nieuwe buis voor kwantiteits- en kwaliteitsbeoordeling met behulp van een spectrofotometer.Meet de RNA-concentratie met behulp van een spectrofotometer en neem één microgram RNA voor cDNA-synthese. Meng één microgram totaal RNA met één microliter dNTP-mix, vier microliter 5X reverse transcriptasebuffer, twee microliter 10X reverse transcriptase random primer, 0,25 microliter reverse transcriptase-enzym en 0,5 microliter RNase-remmer. Vul het volume aan tot 20 microliter met nucleasevrij water.Plaats de buis gedurende 10 minuten op 25 graden Celsius, gevolgd door 50 graden Celsius gedurende een uur. Plaats vervolgens de buis gedurende vijf minuten op 85 graden Celsius om het enzym te inactiveren. Stel de PCR-reactie van 22 microliter in 0,2 milliliter PCR-buizen of -strips in, samen met een negatieve controlebuis en niet-sjabloonbesturingsbuizen.Voeg 11 microliter dd-PCR-mastermix, 5,5 microliter circulair RNA-specifieke voor- en achterwaartse primermix van één micromolaire concentratie en 5,5 microliter nucleasevrij water toe om de NTC-reactiebuizen op te zetten. Evenzo, om de reageerbuizen op te zetten, voegt u 11 microliter dd-PCR-mastermix, 5,5 microliter circulair RNA-specifieke voorwaartse en omgekeerde primermix van één micromolaire concentratie en 5,5 microliter cDNA toe. Breng voor het genereren van druppels 20 microliter van het PCR-mengsel over van 0,2 milliliter PCR-buizen naar de monsterputten van de druppelgeneratorcartridge.Voeg 70 microliter druppelgeneratieolie voorzichtig toe aan de oliebronnen van de druppelgeneratorcartridge met behulp van een pipet. Bedek de druppelgeneratorcartridge met een rubberen pakking en plaats deze in de druppelgeneratormachine om het monsteroliedruppelmengsel te krijgen, gegenereerd in de druppelputten van de cartridge. Breng voor PCR-versterking 40 microliter van het monsteroliedruppelmengsel over van de druppelputten van de druppelgeneratorcartridge naar een 96-well PCR-plaat met behulp van een pipet.Sluit de 96-well PCR plaat af met de aluminiumfolie sealer. Plaats het in het machineblok voor plaatsealer, voorverwarmd op 180 graden Celsius, en klik op afdichting voor het afdichten van de PCR-plaat. Plaats vervolgens de plaat in de dd-PCR thermische cycler en stel de dekseltemperatuur in op 105 graden Celsius en een hellingsnelheid op twee graden Celsius per seconde.Zodra PCR voorbij is, plaatst u de plaat op de dd-PCR druppeltellermachine met de plaathouder in de juiste positie voor het tellen van de druppels. Open de druppelanalysesoftware en stel de run in door de voorbeeldinformatie in te voeren. Klik op de knop Analyseren om de gegevens te analyseren na het voltooien van de druppellezing.Klik vervolgens op de knop 1D Amplitude om de positieve en negatieve druppels te zien. Om de positieve druppels van de negatieve druppels te scheiden, plaatst u een gemeenschappelijke drempellijn voor alle monsters met hetzelfde doel. Klik op de exportknop om de circulaire RNA-tellingen als csv-bestand te exporteren.De geëxporteerde gegevens tonen het aantal circulaire RNA's dat in elk monster aanwezig is. Bereken handmatig het aantal circulaire RNA's in elk monster per nanogram RNA door rekening te houden met de totale hoeveelheid cDNA die in elke reactie wordt gebruikt. De data-analyse met QuantaSoft Software wordt hier getoond.Alle monsters behalve MT1 vertoonden meer dan 12.000 druppeltellingen. Aangezien het totale aantal druppels laag was in MT1, werd dit monster niet in aanmerking genomen voor de uiteindelijke gegevensanalyse. Interessant is dat er een duidelijk verschil was in het expressiepatroon van Circ B en C2 in de vierdaagse gedifferentieerde myotube-conditie in vergelijking met de myoblastcellen.De analyse van Circ B- en C2-abundantie in termen van kopienummer, gaf aan dat de drie replicaties van C2C12-myoblasten 76,8, 67 en 46 kopieën per nanogram RNA hadden, terwijl de twee myotube-monsters 558 en 610 kopieën per nanogram RNA hadden. De gegevens in het staafdiagram vertegenwoordigen de gemiddelde plus minus standaarddeviatie van twee tot drie biologische replicaties. ddPCR is een van de meest geavanceerde methoden om de nauwkeurige differentiële expressie van doelcirculaire RNA te meten.Deze methode zal een essentieel hulpmiddel zijn om circulair RNA-onderzoek en diagnostische industrieën in het komende jaar te versnellen.

Research

JoVE Journal

Biology

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

Profilering van de Pre-micro-RNA&#39;s en microRNA&#39;s met behulp van kwantitatieve real-time PCR (qPCR) arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Rapid PCR Thermocycling using Microscale Thermal Convection

Snelle PCR thermocycling met Microscale Thermal Convectie

Many molecular biology assays depend in some way on the polymerase chain reaction (PCR) to amplify an initially dilute target DNA sample to a detectable ...

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

Isolatie van Kleine Noncoding RNA&#39;s uit humaan serum

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Eenvoudige Bulk uitlezing van Digital nucleïnezuur kwantificering Testen

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

Gebruikmakend Digital Droplet PCR om BRAF V600E Mutaties Detect in formaline gefixeerde paraffine-ingebedde Reference Standard cellijnen

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

Using Digital Image Correlation to Characterize Local Strains on Vascular Tissue Specimens

Met behulp van Digital Image Correlation Local Spanningen op vaatweefsel Monsters karakteriseren

Characterization of the mechanical behavior of biological and engineered soft tissues is a central component of fundamental biomedical research and ...

Genome-wide Purification of Extrachromosomal Circular DNA from Eukaryotic Cells

Genoom-brede Zuivering van extrachromosomale circulaire DNA van eukaryote cellen

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs ...

Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR

Absolute kwantificering van Plasma MicroRNA niveaus bij Cynomolgus apen, met behulp van kwantitatieve Real-time omgekeerde transcriptie PCR

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This ...

Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit

Snelle lipide Droplet isolatie Protocol met behulp van een gerenommeerd organel isolatie Kit

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral ...

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

Tweestaps omgekeerde transcriptiedruppel digitale PCR-protocollen voor SARS-CoV-2-detectie en kwantificering

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...