Name: quantification of circular rnas using digital droplet pcr
Uploaded: 2022-09-16T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR at JoVE.com

Ces travaux ont été soutenus par un financement intra-muros de l’Institut des sciences de la vie, la subvention de recherche DBT (BT/PR27622/MED/30/1961/2018) et la bourse Wellcome Trust/DBT India Alliance [IA/I/18/2/504017] attribuée à Amaresh C. Panda. Nous remercions les autres membres du laboratoire d’avoir relu l’article.

L’ARN est sensible aux RNases; par conséquent, tous les réactifs, instruments et espaces de travail doivent être exempts de RNase et manipulés avec soin.
1. Conception divergente de l’amorce pour l’ARNcirc (voir la figure 1)
<ol><li>Récupérer la séquence mature à partir des données d’annotation circRNA à l’aide de BEDTools ou du navigateur de génome UCSC en joignant la séquence exon/intron présente entre l...

<ol>
	<li>Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+the+predominant+transcript+isoform+from+hundreds+of+human+genes+in+diverse+cell+types.">Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types.</a> PLoS One. 7 (2), 30733 (2012).</li><li>Chen, L. L., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+circRNA+biogenesis.">Regulation of circRNA biogenesis.</a> RNA Biology. 12 (4), 381-388 (2015).</li><li>Kristensen, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biogenesis,+biology+and+characterization+of+circular+RNAs.">The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs.</a> Nature Reviews Genetics. 20 (11), 675-691 (2019).</li><li>Chen, X., Zhou, M., Yant, L., Huang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNA+in+disease:+Basic+properties+and+biomedical+relevance.">Circular RNA in disease: Basic properties and biomedical relevance.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. , (2022).</li><li>Sinha, T., Panigrahi, C., Das, D., Chandra Panda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNA+translation,+a+path+to+hidden+proteome.">Circular RNA translation, a path to hidden proteome.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 13 (1), 1685 (2022).</li><li>Panda, A. C., Xiao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+Act+as+miRNA+Sponges.">Circular RNAs Act as miRNA Sponges.</a> Circular RNAs: Biogenesis and Functions. , 67-79 (2018).</li><li>Das, A., Sinha, T., Shyamal, S., Panda, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+role+of+circular+RNA-protein+interactions.">Emerging role of circular RNA-protein interactions.</a> Non-Coding RNA. 7 (3), 48 (2021).</li><li>Verduci, L., Tarcitano, E., Strano, S., Yarden, Y., Blandino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CircRNAs:+Role+in+human+diseases+and+potential+use+as+biomarkers.">CircRNAs: Role in human diseases and potential use as biomarkers.</a> Cell Death &amp; Disease. 12 (5), 468 (2021).</li><li>Pandey, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+analysis+of+circular+RNAs.">Methods for analysis of circular RNAs.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 11 (1), 1566 (2020).</li><li>Das, A., Das, D., Panda, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+circular+RNAs+by+PCR.">Validation of circular RNAs by PCR.</a> PCR Primer Design. Methods in Molecular Biology. 2392, 103-114 (2022).</li><li>Jeck, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+abundant,+conserved,+and+associated+with+ALU+repeats.">Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats.</a> RNA. 19 (2), 141-157 (2013).</li><li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+droplet+digital+polymerase+chain+reaction+format+for+DNA+copy+number+quantification.">Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification.</a> Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).</li><li>Hayden, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+droplet+digital+PCR+to+real-time+PCR+for+quantitative+detection+of+cytomegalovirus.">Comparison of droplet digital PCR to real-time PCR for quantitative detection of cytomegalovirus.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (2), 540-546 (2013).</li><li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets:+From+variable+nonsense+to+publication+quality+data.">Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: From variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7, 2409 (2017).</li><li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number.">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li><li>Ishak, A., AlRawashdeh, M. M., Esagian, S. M., Nikas, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic,+prognostic,+and+therapeutic+value+of+droplet+digital+PCR+(ddPCR)+in+COVID-19+patients:+A+systematic+review.">Diagnostic, prognostic, and therapeutic value of droplet digital PCR (ddPCR) in COVID-19 patients: A systematic review.</a> Journal of Clinical Medicine. 10 (23), 5712 (2021).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+droplet+digital+PCR+to+detect+the+pathogens+of+infectious+diseases.">Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases.</a> Bioscience Reports. 38 (6), (2018).</li><li>Lee, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+UCSC+genome+browser+database:+2022+update.">The UCSC genome browser database: 2022 update.</a> Nucleic Acids Research. 50, 1115-1122 (2022).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+A+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li><li>Untergasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer3--new+capabilities+and+interfaces.">Primer3--new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Research. 40 (15), 115 (2012).</li><li>Das, A., Das, D., Das, A., Panda, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quick+and+cost-effective+method+for+DNA-free+total+RNA+isolation+using+magnetic+silica+beads.">A quick and cost-effective method for DNA-free total RNA isolation using magnetic silica beads.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Oberacker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Synthesis+of+Functionalized+Paramagnetic+Beads+for+Nucleic+Acid+Purification+and+Manipulation.">Simple Synthesis of Functionalized Paramagnetic Beads for Nucleic Acid Purification and Manipulation.</a> Bio-protocol. 9 (20), 3394 (2019).</li><li>Ra&#269;ki, N., Dreo, T., Gutierrez-Aguirre, I., Blejec, A., Ravnikar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+transcriptase+droplet+digital+PCR+shows+high+resilience+to+PCR+inhibitors+from+plant,+soil+and+water+samples.">Reverse transcriptase droplet digital PCR shows high resilience to PCR inhibitors from plant, soil and water samples.</a> Plant Methods. 10 (1), 42 (2014).</li><li>Taylor, S. C., Carbonneau, J., Shelton, D. N., Boivin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+droplet+digital+PCR+from+RNA+and+DNA+extracts+with+direct+comparison+to+RT-qPCR:+Clinical+implications+for+quantification+of+Oseltamivir-resistant+subpopulations.">Optimization of droplet digital PCR from RNA and DNA extracts with direct comparison to RT-qPCR: Clinical implications for quantification of Oseltamivir-resistant subpopulations.</a> Journal of Virological Methods. 224, 58-66 (2015).</li></ol>

La recherche sur l’ARNcirc s’est développée au cours de la dernière décennie avec la découverte de technologies de séquençage à haut débit. En conséquence, il a été considéré comme une molécule potentielle pour les futurs traitements à ARN. En outre, il est connu pour agir comme biomarqueur dans plusieurs maladies, y compris le cancer et les maladies cardiovasculaires 4,8. Cependant, l’identification du circRNA est délicate en raison de sa ...

Les progrès récents dans les technologies de séquençage de l’ARN et de nouveaux algorithmes de calcul ont permis de découvrir un nouveau membre de la famille croissante des ARN non codants, appelé ARN circulaire (circRNA)1. Comme leur nom l’indique, les circRNA sont une famille de molécules d’ARN simple brin sans extrémités libres. Ils sont formés par épissage tête à queue non canonique appelé épissage arrière, où le site accepteur d’épissage en amont se joint de manière covalente avec le site donneur d’épissage en aval pour former un cercle d’ARN stable 1,2. Ce processus pourrait être médié par plusieurs facteurs, y compris les éléments répétitifs Alu inversés présents en amont et en aval des exons circularisés, ou peut être médié par certains facteurs d’épissage ou protéines de liaison à l’ARN (RBP)2,3. Les ARN circulaires générés exclusivement à partir de la séquence exonique ou intronique sont classés comme circRNA exonique et ARN intronique circulaire ou ARN-ci, tandis que certains circRNA exoniques conservent l’intron et sont appelés circRNAs exon-intron (EIcircRNAs)3,4. Les fonctions des circRNA sont multiformes, y compris l’éponge des miARN et / ou RBP, la régulation de la transcription et la régulation de la fonction cellulaire en traduisant en peptides 3,5,6,7. Plusieurs rapports ont mis en évidence l’importance des circRNAs dans diverses maladies et processus physiologiques8. De plus, les schémas d’expression spécifiques aux tissus et la résistance à la digestion des exonucléases en font un biomarqueur fonctionnel pour le diagnostic de la maladie et il peut également être utilisé comme cible thérapeutique appropriée8. Compte tenu de son importance dans la régulation de la santé et des maladies, la quantification précise de l’expression de l’ARNcirc est le besoin de l’heure.
Plusieurs méthodes biochimiques ont été développées pour quantifier les circRNA dans des échantillons biologiques9. L’une des méthodes les plus pratiques et les plus largement acceptées pour la quantification de l’ARNcirc est la transcription inverse suivie d’une réaction en chaîne par polymérase quantitative (RT-qPCR) utilisant des paires d’amorces divergentes10. Cependant, la majorité des circRNA sont en faible abondance par rapport aux ARNm linéaires, ce qui rend difficile leur quantification11. Pour surmonter ce problème, nous avons cherché à utiliser la PCR numérique par gouttelettes (dd-PCR) pour quantifier avec précision le nombre de circRNA dans un échantillon donné. La dd-PCR est une technologie de PCR avancée qui suit le principe de la microfluidique; il génère plusieurs gouttelettes aqueuses dans l’huile, et la PCR se produit dans chaque gouttelette comme une réaction individuelle12. La réaction se produit dans des gouttelettes individuelles et est analysée à l’aide d’un lecteur de gouttelettes, ce qui donne le nombre de gouttelettes positives ou négatives pour le gène d’intérêt12. C’est la technique la plus sensible pour quantifier avec précision un gène d’intérêt, même s’il n’y a qu’une seule copie dans un échantillon donné. La diminution de la sensibilité aux inhibiteurs, une meilleure précision et l’omission du gène de référence pour la quantification le rendent plus avantageux que la qPCRconventionnelle 13,14,15. Il a été largement utilisé comme outil de recherche et de diagnostic pour la quantification absolue d’un gène d’intérêt16,17. Ici, nous décrivons le protocole détaillé de dd-PCR pour la quantification circRNA dans la différenciation des myotubes C2C12 de souris et des myoblastes C2C12 de souris proliférants à l’aide d’amorces divergentes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >1.5 ml microcentifuge tube</td>
			<td >Tarson</td>
			<td >500010</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.2 ml tube strips with cap</td>
			<td >Tarson</td>
			<td >610020, 510073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filter Tips</td>
			<td >Tarson</td>
			<td >528104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >10977023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell scrapper</td>
			<td >HiMedia</td>
			<td >TCP223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chloroform</td>
			<td >SRL</td>
			<td >96764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA diluent</td>
			<td >HiMedia</td>
			<td >MB228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Random primers</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >48190011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >dNTP set</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >R0181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Murine RNase inhibitor</td>
			<td >NEB</td>
			<td >M0314S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Maxima reverse transcriptase</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >EP0743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 dd-PCR Evagreen Supermix</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Droplet generation oil for Evagreen</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1814040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DG8 Cartridges and Gaskets</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DG8 Cartridge holder</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1863051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 Droplet Generator</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ddPCR 96-Well Plates</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >12001925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PX1 PCR Plate Sealer</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1814000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C1000 Touch Thermal Cycler with 96&#8211;Deep Well Reaction Module</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1851197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 Droplet Reader</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Quantasoft Software</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silica column</td>
			<td >Umbrella Life Science</td>
			<td >38220090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UCSC Genome Browser</td>
			<td ></td>
			<td >https://genome.ucsc.edu/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primer 3</td>
			<td ></td>
			<td >https://primer3.ut.ee/</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of circular rnas using digital droplet pcr

La réaction en chaîne par gouttelettes numériques par polymérase (dd-PCR) est l’une des méthodes de quantification les plus sensibles; il fractionne la réaction en près de 20 000 gouttelettes d’eau dans l’huile, et la PCR se produit dans les gouttelettes individuelles. La dd-PCR présente plusieurs avantages par rapport à la qPCR conventionnelle en temps réel, notamment une précision accrue dans la détection des cibles de faible abondance, l’omission des gènes de référence pour la quantification, l’élimination des réplications techniques pour les échantillons et la démonstration d’une grande résilience aux inhibiteurs dans les échantillons. Récemment, la dd-PCR est devenue l’une des méthodes les plus populaires pour quantifier avec précision l’ADN ou l’ARN cible pour l’analyse de l’expression génique et le diagnostic. Les ARN circulaires (circRNA) sont une grande famille de molécules d’ARN fermées par covalence récemment découvertes dépourvues d’extrémités 5' et 3'. Il a été démontré qu’ils régulent l’expression des gènes en agissant comme des éponges pour les protéines de liaison à l’ARN et les microARN. De plus, les circRNA sont sécrétés dans les fluides corporels et leur résistance aux exonucléases en fait des biomarqueurs pour le diagnostic des maladies. Cet article vise à montrer comment effectuer la conception d’amorces divergentes, l’extraction d’ARN, la synthèse de l’ADNc et l’analyse dd-PCR pour quantifier avec précision les niveaux spécifiques d’ARN circulaire (circRNA) dans les cellules. En conclusion, nous démontrons la quantification précise des circRNA à l’aide de la dd-PCR.

Le nombre absolu de circRNA dans chaque échantillon peut être dérivé des données dd-PCR exportées. L’analyse quantitative par PCR en temps réel a suggéré une expression différentielle de circBnc2 dans les myotubes C2C12 différenciés (données non présentées). Ici, nous voulions vérifier le nombre absolu de copies de circBnc2 dans les myoblastes et myotubes C2C12 proliférants. Puisque l’expression de circBnc2 est comparée dans deux conditions, il est vraiment important de tr...

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Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR

Ce protocole décrit la méthode détaillée de PCR par gouttelettes numériques (dd-PCR) pour une quantification précise des niveaux d’ARN circulaire (circRNA) dans les cellules à l’aide d’amorces divergentes.

Quantification d’ARN circulaires par PCR numérique

Digital droplet polymerase chain reaction (dd-PCR) is one of the most sensitive quantification methods; it fractionates the reaction into nearly 20,000 ...

La dd-PCR est une méthode très sensible et précise pour la quantification absolue de l’ADN ou de l’ARN cible. Il a été utilisé pour le diagnostic de maladies où d’autres méthodes conventionnelles ne donnent pas de résultats précis. La dd-PCR est la technique la plus sensible pour détecter les molécules d’acide nucléique très peu abondantes.Contrairement à la PCR quantitative, la dd-PCR ne nécessite aucun contrôle génétique pour la quantification. En raison de sa sensibilité et de sa précision, la dd-PCR peut être utilisée comme outil de diagnostic moléculaire et de recherche impliquant des molécules d’ARN peu abondantes comme les micro-ARN et les ARN circulaires. Avant d’utiliser la dd-PCR, il faut effectuer la RT-PCR ou la RT-qPCR pour confirmer que les amorces amplifient leurs gènes cibles sans amplification PCR non spécifique.Pour commencer, préparez une séquence modèle de PCR de 200 nucléotides en joignant les 100 derniers nucléotides de la longueur totale de la séquence d’ARN circulaire aux 100 premiers nucléotides de la séquence d’ARN circulaire. Utilisez la séquence de modèles pour l’amorce, conçue par l’outil Web Primer 3. Prenez une boîte de 10 centimètres contenant environ 5 millions de cellules myoblastiques C2C12 proliférantes et un myotube C2C12 différencié de quatre jours pour isoler l’ARN.Lavez les cellules avec 10 millilitres de 1X PBS trois fois et jetez le PBS à l’aide d’une pipette. Ajouter un millilitre de réactif d’isolement d’ARN et lyser les cellules par pipetage vigoureux. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de chloroforme et de vortex pendant 15 secondes.Centrifuger le tube à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes à 12 000 G.Prélever 400 microlitres de la couche aqueuse supérieure, le charger sur une colonne de silice et centrifuger pendant une minute à 12 000 G à température ambiante. Prenez le flux à travers un nouveau tube et ajoutez 600 microlitres d’éthanol 100%. Ajouter 20 microlitres de billes de silice magnétiques et placer le tube sur un thermomélangeur, réglé à 25 degrés Celsius et 1 200 tr / min pendant cinq minutes.Ensuite, placez le tube sur un support magnétique pendant 30 secondes ou jusqu’à ce que la solution devienne claire. Remettez en suspension les billes de silice magnétiques dans 500 microlitres de tampon de lavage contenant 90% d’éthanol. Après avoir placé le tube sur le support magnétique pendant 30 secondes, laissez les billes se déposer vers l’aimant et jetez le tampon à l’aide d’une pipette.Sécher le tube à l’air libre à 50 degrés Celsius pendant trois minutes sur un thermomélangeur, en gardant le couvercle ouvert. Ajouter 20 microlitres d’eau sans nucléase et remettre les billes en suspension. Recueillir l’ARN dissous dans un nouveau tube pour l’évaluation de la quantité et de la qualité à l’aide d’un spectrophotomètre.Mesurer la concentration d’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre et prendre un microgramme d’ARN pour la synthèse de l’ADNc. Mélanger un microgramme d’ARN total avec un microlitre de mélange dNTP, quatre microlitres de tampon transcriptase inverse 5X, deux microlitres d’amorce aléatoire de transcriptase inverse 10X, 0,25 microlitre d’enzyme transcriptase inverse et 0,5 microlitre d’inhibiteur de RNase. Porter le volume à 20 microlitres en utilisant de l’eau sans nucléase.Placez le tube à 25 degrés Celsius pendant 10 minutes, suivi de 50 degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, placez le tube à 85 degrés Celsius pendant cinq minutes pour inactiver l’enzyme. Configurez la réaction PCR de 22 microlitres dans des tubes ou des bandes PCR de 0,2 millilitre, ainsi qu’un tube de contrôle négatif et des tubes de contrôle sans gabarit.Ajouter 11 microlitres de mélange maître dd-PCR, 5,5 microlitres de mélange d’amorces avant et arrière spécifique à l’ARN circulaire d’une concentration micromolaire et 5,5 microlitres d’eau sans nucléase pour mettre en place les tubes de réaction NTC. De même, pour configurer les tubes de réaction d’essai, ajoutez 11 microlitres de mélange maître dd-PCR, 5,5 microlitres de mélange d’amorces directes et inverses spécifiques à l’ARN circulaire d’une concentration micromolaire et 5,5 microlitres d’ADNc. Pour la génération de gouttelettes, transférez 20 microlitres du mélange PCR des tubes PCR de 0,2 millilitre aux puits d’échantillon de la cartouche du générateur de gouttelettes.Ajoutez soigneusement 70 microlitres d’huile de génération de gouttelettes dans les puits de pétrole de la cartouche du générateur de gouttelettes, à l’aide d’une pipette. Couvrir la cartouche du générateur de gouttelettes avec un joint en caoutchouc et la placer dans la machine génératrice de gouttelettes pour obtenir le mélange de gouttelettes d’huile échantillon, généré dans les puits de gouttelettes de la cartouche. Pour l’amplification par PCR, transférer 40 microlitres du mélange de gouttelettes d’huile de l’échantillon des puits de gouttelettes de la cartouche du générateur de gouttelettes vers une plaque PCR de 96 puits à l’aide d’une pipette.Scellez la plaque PCR à 96 puits avec le scellant en aluminium. Placez-le dans le bloc de machine d’étanchéité à plaques, préchauffé à 180 degrés Celsius, et cliquez sur le joint pour sceller la plaque PCR. Ensuite, placez la plaque dans le thermocycleur dd-PCR et réglez la température du couvercle à 105 degrés Celsius et un taux de rampe à deux degrés Celsius par seconde.Une fois la PCR terminée, placez la plaque sur le compteur de gouttelettes dd-PCR avec le porte-plaque dans la position correcte pour compter les gouttelettes. Ouvrez le logiciel d’analyse des gouttelettes et configurez l’exécution en saisissant les informations de l’échantillon. Cliquez sur le bouton Analyser pour analyser les données une fois la lecture de gouttelettes terminée.Ensuite, cliquez sur le bouton Amplitude 1D pour voir les gouttelettes positives et négatives. Pour séparer les gouttelettes positives des gouttelettes négatives, placez une ligne de seuil commune pour tous les échantillons ayant la même cible. Cliquez sur le bouton d’exportation pour exporter les données de comptage d’ARN circulaire sous forme de fichier csv.Les données exportées montrent le nombre d’ARN circulaires présents dans chaque échantillon. Calculez manuellement le nombre d’ARN circulaires dans chaque échantillon par nanogramme d’ARN en considérant la quantité totale d’ADNc utilisée dans chaque réaction. L’analyse des données à l’aide du logiciel QuantaSoft est présentée ici.Tous les échantillons, à l’exception de MT1, ont montré plus de 12 000 gouttelettes. Étant donné que le nombre total de gouttelettes était faible dans MT1, cet échantillon n’a pas été pris en compte pour l’analyse finale des données. Fait intéressant, il y avait une nette différence dans le profil d’expression de Circ B et C2 dans l’état de myotube différencié de quatre jours par rapport aux cellules myoblastiques.L’analyse de l’abondance de Circ B et C2 en termes de nombre de copies a indiqué que les trois réplicas des myoblastes C2C12 avaient 76,8, 67 et 46 copies par nanogramme d’ARN, tandis que les deux échantillons de myotubes avaient 558 et 610 copies par nanogramme d’ARN. Les données du graphique à barres représentent la moyenne plus moins l’écart-type de deux à trois répétitions biologiques. La ddPCR est l’une des méthodes les plus avancées pour mesurer l’expression différentielle précise de l’ARN circulaire cible.Cette méthode sera un outil essentiel pour accélérer la recherche et les industries de diagnostic de l’ARN circulaire au cours de l’année à venir.

Research

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