Name: quantification of circular rnas using digital droplet pcr
Uploaded: 2022-09-16T14:50:00
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Diese Arbeit wurde durch interne Mittel des Institute of Life Sciences, das DBT-Forschungsstipendium (BT / PR27622 / MED / 30 / 1961 / 2018) und das Wellcome Trust / DBT India Alliance Fellowship [IA / I / 18 / 2 / 504017] unterstützt, das an Amaresh C. Panda vergeben wurde. Wir danken anderen Labormitgliedern für das Korrekturlesen des Artikels.

RNA ist empfindlich gegenüber RNasen; Daher sollten alle Reagenzien, Instrumente und Arbeitsbereiche RNase-frei sein und mit Sorgfalt behandelt werden.
1. Divergentes Primerdesign für circRNA (siehe Abbildung 1)
<ol><li>Rufen Sie die reife Sequenz aus circRNA-Annotationsdaten mit BEDTools oder aus dem UCSC-Genombrowser ab, indem Sie die Exon/Intron-Sequenz zwischen den Backspleißverbindungskoordinaten18,19</...

<ol>
	<li>Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+the+predominant+transcript+isoform+from+hundreds+of+human+genes+in+diverse+cell+types.">Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types.</a> PLoS One. 7 (2), 30733 (2012).</li><li>Chen, L. L., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+circRNA+biogenesis.">Regulation of circRNA biogenesis.</a> RNA Biology. 12 (4), 381-388 (2015).</li><li>Kristensen, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biogenesis,+biology+and+characterization+of+circular+RNAs.">The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs.</a> Nature Reviews Genetics. 20 (11), 675-691 (2019).</li><li>Chen, X., Zhou, M., Yant, L., Huang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNA+in+disease:+Basic+properties+and+biomedical+relevance.">Circular RNA in disease: Basic properties and biomedical relevance.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. , (2022).</li><li>Sinha, T., Panigrahi, C., Das, D., Chandra Panda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNA+translation,+a+path+to+hidden+proteome.">Circular RNA translation, a path to hidden proteome.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 13 (1), 1685 (2022).</li><li>Panda, A. C., Xiao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+Act+as+miRNA+Sponges.">Circular RNAs Act as miRNA Sponges.</a> Circular RNAs: Biogenesis and Functions. , 67-79 (2018).</li><li>Das, A., Sinha, T., Shyamal, S., Panda, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+role+of+circular+RNA-protein+interactions.">Emerging role of circular RNA-protein interactions.</a> Non-Coding RNA. 7 (3), 48 (2021).</li><li>Verduci, L., Tarcitano, E., Strano, S., Yarden, Y., Blandino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CircRNAs:+Role+in+human+diseases+and+potential+use+as+biomarkers.">CircRNAs: Role in human diseases and potential use as biomarkers.</a> Cell Death &amp; Disease. 12 (5), 468 (2021).</li><li>Pandey, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+analysis+of+circular+RNAs.">Methods for analysis of circular RNAs.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 11 (1), 1566 (2020).</li><li>Das, A., Das, D., Panda, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+circular+RNAs+by+PCR.">Validation of circular RNAs by PCR.</a> PCR Primer Design. Methods in Molecular Biology. 2392, 103-114 (2022).</li><li>Jeck, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+abundant,+conserved,+and+associated+with+ALU+repeats.">Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats.</a> RNA. 19 (2), 141-157 (2013).</li><li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+droplet+digital+polymerase+chain+reaction+format+for+DNA+copy+number+quantification.">Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification.</a> Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).</li><li>Hayden, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+droplet+digital+PCR+to+real-time+PCR+for+quantitative+detection+of+cytomegalovirus.">Comparison of droplet digital PCR to real-time PCR for quantitative detection of cytomegalovirus.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (2), 540-546 (2013).</li><li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets:+From+variable+nonsense+to+publication+quality+data.">Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: From variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7, 2409 (2017).</li><li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number.">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li><li>Ishak, A., AlRawashdeh, M. M., Esagian, S. M., Nikas, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic,+prognostic,+and+therapeutic+value+of+droplet+digital+PCR+(ddPCR)+in+COVID-19+patients:+A+systematic+review.">Diagnostic, prognostic, and therapeutic value of droplet digital PCR (ddPCR) in COVID-19 patients: A systematic review.</a> Journal of Clinical Medicine. 10 (23), 5712 (2021).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+droplet+digital+PCR+to+detect+the+pathogens+of+infectious+diseases.">Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases.</a> Bioscience Reports. 38 (6), (2018).</li><li>Lee, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+UCSC+genome+browser+database:+2022+update.">The UCSC genome browser database: 2022 update.</a> Nucleic Acids Research. 50, 1115-1122 (2022).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+A+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li><li>Untergasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer3--new+capabilities+and+interfaces.">Primer3--new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Research. 40 (15), 115 (2012).</li><li>Das, A., Das, D., Das, A., Panda, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quick+and+cost-effective+method+for+DNA-free+total+RNA+isolation+using+magnetic+silica+beads.">A quick and cost-effective method for DNA-free total RNA isolation using magnetic silica beads.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Oberacker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Synthesis+of+Functionalized+Paramagnetic+Beads+for+Nucleic+Acid+Purification+and+Manipulation.">Simple Synthesis of Functionalized Paramagnetic Beads for Nucleic Acid Purification and Manipulation.</a> Bio-protocol. 9 (20), 3394 (2019).</li><li>Ra&#269;ki, N., Dreo, T., Gutierrez-Aguirre, I., Blejec, A., Ravnikar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+transcriptase+droplet+digital+PCR+shows+high+resilience+to+PCR+inhibitors+from+plant,+soil+and+water+samples.">Reverse transcriptase droplet digital PCR shows high resilience to PCR inhibitors from plant, soil and water samples.</a> Plant Methods. 10 (1), 42 (2014).</li><li>Taylor, S. C., Carbonneau, J., Shelton, D. N., Boivin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+droplet+digital+PCR+from+RNA+and+DNA+extracts+with+direct+comparison+to+RT-qPCR:+Clinical+implications+for+quantification+of+Oseltamivir-resistant+subpopulations.">Optimization of droplet digital PCR from RNA and DNA extracts with direct comparison to RT-qPCR: Clinical implications for quantification of Oseltamivir-resistant subpopulations.</a> Journal of Virological Methods. 224, 58-66 (2015).</li></ol>

Die CircRNA-Forschung ist in den letzten zehn Jahren mit der Entdeckung von Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologien gewachsen. Daher wurde es als potenzielles Molekül für zukünftige RNA-Therapeutika angesehen. Darüber hinaus ist bekannt, dass es als Biomarker bei mehreren Krankheiten wirkt, einschließlich Krebs und Herz-Kreislauf-Erkrankungen 4,8. Die Identifizierung von circRNA ist jedoch aufgrund ihrer geringen Häufigkeit schwierig und sie hat nur eine s...

Jüngste Fortschritte bei RNA-Sequenzierungstechnologien und neuartigen Computeralgorithmen haben ein neues Mitglied der wachsenden Familie nicht-kodierender RNAs entdeckt, die als zirkuläre RNA (circRNA)1 bezeichnet wird. Wie der Name schon sagt, sind circRNAs eine Familie von einzelsträngigen RNA-Molekülen ohne freie Enden. Sie werden durch nicht-kanonisches Kopf-zu-Schwanz-Spleißen gebildet, das als Back-Splicing bezeichnet wird, bei dem sich die vorgeschaltete Spleißakzeptorstelle kovalent mit der nachgeschalteten Spleißspenderstelle verbindet, um einen stabilen RNA-Kreis 1,2 zu bilden. Dieser Prozess könnte durch mehrere Faktoren vermittelt werden, einschließlich invertierter Alu-Repetitionselemente, die im Upstream und Downstream von zirkularisierten Exons vorhanden sind, oder kann durch einige Spleißfaktoren oder RNA-bindende Proteine (RBPs) vermittelt werden2,3. Zirkuläre RNAs, die ausschließlich aus der exonischen oder intronischen Sequenz erzeugt werden, werden als exonische circRNA und zirkuläre intronische RNAs oder ci-RNAs klassifiziert, während einige exonische circRNAs das Intron behalten und als Exon-Intron-circRNAs (EIcircRNAs) bezeichnet werden3,4. Die Funktionen von circRNAs sind vielfältig, einschließlich der Schwammbildung von miRNA und/oder RBP, der Regulierung der Transkription und der Regulierung der zellulären Funktion durch Übersetzung in Peptide 3,5,6,7. Mehrere Berichte haben die Bedeutung von circRNAs bei verschiedenen Krankheiten und physiologischen Prozessen hervorgehoben8. Darüber hinaus machen gewebespezifische Expressionsmuster und Resistenz gegen Exonuklease-Verdauung es zu einem funktionellen Biomarker für die Krankheitsdiagnostik und kann auch als geeignetes therapeutisches Ziel verwendet werden8. In Anbetracht seiner Bedeutung für die Regulierung von Gesundheit und Krankheiten ist die genaue Quantifizierung der circRNA-Expression das Gebot der Stunde.
Mehrere biochemische Methoden wurden entwickelt, um circRNAs in biologischen Proben zu quantifizieren9. Eine der bequemsten und am weitesten verbreiteten Methoden zur circRNA-Quantifizierung ist die reverse Transkription gefolgt von einer quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) unter Verwendung divergenter Primerpaare10. Die Mehrheit der circRNAs ist jedoch im Vergleich zu linearen mRNAs in geringer Häufigkeit, was es schwierig macht, sie zu quantifizieren11. Um dieses Problem zu lösen, haben wir versucht, die digitale Tröpfchen-PCR (dd-PCR) zu verwenden, um die Anzahl der circRNAs in einer bestimmten Probe genau zu quantifizieren. Die dd-PCR ist eine fortschrittliche PCR-Technologie, die dem Prinzip der Mikrofluidik folgt. es erzeugt mehrere wässrige Tröpfchen in Öl, und die PCR tritt in jedem Tröpfchen als individuelle Reaktion auf12. Die Reaktion erfolgt in einzelnen Tröpfchen und wird mit einem Tröpfchenleser analysiert, der die Anzahl der positiven oder negativen Tröpfchen für das interessierende Gen12 angibt. Es ist die empfindlichste Technik, um ein Gen von Interesse genau zu quantifizieren, auch wenn es nur eine einzige Kopie in einer bestimmten Probe gibt. Verminderte Empfindlichkeit gegenüber Inhibitoren, bessere Präzision und das Weglassen des Referenzgens für die Quantifizierung machen es vorteilhafter als herkömmliche qPCR13,14,15. Es wurde häufig als Forschungs- und Diagnosewerkzeug für die absolute Quantifizierung eines interessierenden Gensverwendet 16,17. Hier beschreiben wir das detaillierte dd-PCR-Protokoll für die circRNA-Quantifizierung bei der Differenzierung von C2C12-Myotuben der Maus und proliferierenden C2C12-Myoblasten der Maus unter Verwendung divergenter Primer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >1.5 ml microcentifuge tube</td>
			<td >Tarson</td>
			<td >500010</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.2 ml tube strips with cap</td>
			<td >Tarson</td>
			<td >610020, 510073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filter Tips</td>
			<td >Tarson</td>
			<td >528104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >10977023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell scrapper</td>
			<td >HiMedia</td>
			<td >TCP223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chloroform</td>
			<td >SRL</td>
			<td >96764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA diluent</td>
			<td >HiMedia</td>
			<td >MB228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Random primers</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >48190011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >dNTP set</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >R0181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Murine RNase inhibitor</td>
			<td >NEB</td>
			<td >M0314S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Maxima reverse transcriptase</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >EP0743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 dd-PCR Evagreen Supermix</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Droplet generation oil for Evagreen</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1814040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DG8 Cartridges and Gaskets</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DG8 Cartridge holder</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1863051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 Droplet Generator</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ddPCR 96-Well Plates</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >12001925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PX1 PCR Plate Sealer</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1814000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C1000 Touch Thermal Cycler with 96&#8211;Deep Well Reaction Module</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1851197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 Droplet Reader</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Quantasoft Software</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silica column</td>
			<td >Umbrella Life Science</td>
			<td >38220090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UCSC Genome Browser</td>
			<td ></td>
			<td >https://genome.ucsc.edu/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primer 3</td>
			<td ></td>
			<td >https://primer3.ut.ee/</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of circular rnas using digital droplet pcr

Die digitale Tröpfchenpolymerase-Kettenreaktion (dd-PCR) ist eine der empfindlichsten Quantifizierungsmethoden; Es fraktioniert die Reaktion in fast 20.000 Wasser-in-Öl-Tröpfchen, und die PCR tritt in den einzelnen Tröpfchen auf. Die dd-PCR hat mehrere Vorteile gegenüber der herkömmlichen real-time qPCR, einschließlich einer erhöhten Genauigkeit bei der Erkennung von Zielen mit geringer Abundanz, dem Weglassen von Referenzgenen für die Quantifizierung, der Eliminierung technischer Replikate für Proben und der hohen Widerstandsfähigkeit gegenüber Inhibitoren in den Proben. In jüngster Zeit hat sich die dd-PCR zu einer der beliebtesten Methoden zur genauen Quantifizierung von Ziel-DNA oder RNA für die Genexpressionsanalyse und -diagnostik entwickelt. Zirkuläre RNAs (circRNAs) sind eine große Familie von kürzlich entdeckten kovalent geschlossenen RNA-Molekülen ohne 5' und 3' Enden. Es wurde gezeigt, dass sie die Genexpression regulieren, indem sie als Schwämme für RNA-bindende Proteine und microRNAs fungieren. Darüber hinaus werden circRNAs in Körperflüssigkeiten sezerniert, und ihre Resistenz gegen Exonukleasen macht sie zu Biomarkern für die Krankheitsdiagnose. Dieser Artikel soll zeigen, wie divergentes Primer-Design, RNA-Extraktion, cDNA-Synthese und dd-PCR-Analyse durchgeführt werden können, um spezifische zirkuläre RNA (circRNA) -Spiegel in Zellen genau zu quantifizieren. Abschließend demonstrieren wir die genaue Quantifizierung von circRNAs mittels dd-PCR.

Die absolute Anzahl der circRNAs in jeder Probe kann aus den exportierten dd-PCR-Daten abgeleitet werden. Die quantitative PCR-Analyse in Echtzeit deutete auf eine differentielle Expression von circBnc2 in den differenzierten C2C12-Myotuben hin (Daten nicht gezeigt). Hier wollten wir die absolute Kopienzahl von circBnc2 in proliferierenden C2C12-Myoblasten und Myotuben überprüfen. Da die Expression von circBnc2 unter zwei Bedingungen verglichen wird, ist es sehr wichtig, alle Proben für RNA-...

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Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR

Dieses Protokoll beschreibt die detaillierte Methode der digitalen Tröpfchen-PCR (dd-PCR) zur präzisen Quantifizierung von zirkulären RNA (circRNA)-Spiegeln in Zellen unter Verwendung divergenter Primer.

Quantifizierung zirkulärer RNAs mittels digitaler Tröpfchen-PCR

Digital droplet polymerase chain reaction (dd-PCR) is one of the most sensitive quantification methods; it fractionates the reaction into nearly 20,000 ...

dd-PCR ist eine hochempfindliche und genaue Methode zur absoluten Quantifizierung von Ziel-DNA oder RNA. Es wurde für die Diagnose von Krankheiten verwendet, wo andere konventionelle Methoden keine genauen Ergebnisse liefern. dd-PCR ist die empfindlichste Technik zum Nachweis von sehr wenig vorkommenden Nukleinsäuremolekülen.Im Gegensatz zur quantitativen PCR erfordert die dd-PCR keine Genkontrolle für die Quantifizierung. Aufgrund seiner Empfindlichkeit und Genauigkeit kann dd-PCR als Werkzeug für die molekulare Diagnostik und Forschung mit RNA-Molekülen mit geringer Häufigkeit wie Mikro-RNAs und zirkulären RNAs verwendet werden. Vor der Verwendung von dd-PCR sollte man RT-PCR oder RT-qPCR durchführen, um zu bestätigen, dass die Primer ihre Zielgene ohne unspezifische PCR-Amplifikation amplifizieren.Um zu beginnen, bereiten Sie eine PCR-Vorlagensequenz von 200 Nukleotiden Länge vor, indem Sie die letzten 100 Nukleotide der gesamten zirkulären RNA-Sequenzlänge mit den ersten 100 Nukleotiden der zirkulären RNA-Sequenz verbinden. Verwenden Sie die Vorlagensequenz für den Primer, die vom Webtool Primer 3 entworfen wurde. Nehmen Sie eine 10-Zentimeter-Schale mit etwa 5 Millionen proliferierenden C2C12-Myoblastenzellen und eine viertägige differenzierte C2C12-Myoröhre zur RNA-Isolierung.Waschen Sie die Zellen dreimal mit 10 Milliliter 1X PBS und entsorgen Sie das PBS mit einer Pipette. Fügen Sie einen Milliliter RNA-Isolierreagenz hinzu und lysieren Sie die Zellen durch kräftiges Pipettieren. Dann fügen Sie 200 Mikroliter Chloroform und Wirbel für 15 Sekunden hinzu.Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei vier Grad Celsius für 10 Minuten bei 12.000 G.Nehmen Sie 400 Mikroliter der oberen wässrigen Schicht, laden Sie es auf eine Kieselsäuresäule und zentrifugieren Sie für eine Minute bei 12.000 G bei Raumtemperatur. Nehmen Sie den Durchfluss zu einem neuen Rohr und fügen Sie 600 Mikroliter 100% Ethanol hinzu. Fügen Sie 20 Mikroliter magnetische Kieselsäureperlen hinzu und legen Sie die Tube fünf Minuten lang auf einen Thermomixer, der auf 25 Grad Celsius und 1.200 U/min eingestellt ist.Dann legen Sie das Röhrchen für 30 Sekunden auf einen magnetischen Ständer oder bis die Lösung klar wird. Resuspendieren Sie die magnetischen Kieselsäurekügelchen in 500 Mikroliter Waschpuffer, der 90% Ethanol enthält. Nachdem Sie das Rohr 30 Sekunden lang auf den Magnetständer gelegt haben, lassen Sie die Perlen in Richtung des Magneten absetzen und entsorgen Sie den Puffer mit einer Pipette.Trocknen Sie das Rohr drei Minuten lang an der Luft auf einem Thermomixer an der Luft und halten Sie den Deckel offen. Fügen Sie 20 Mikroliter nukleasefreies Wasser hinzu und resuspendieren Sie die Perlen. Sammeln Sie die gelöste RNA in einem neuen Röhrchen zur Quantitäts- und Qualitätsbeurteilung mit einem Spektralphotometer.Messen Sie die RNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer und nehmen Sie ein Mikrogramm RNA für die cDNA-Synthese. Mischen Sie ein Mikrogramm Gesamt-RNA mit einem Mikroliter dNTP-Mix, vier Mikroliter 5X Reverse-Transkriptase-Puffer, zwei Mikroliter 10X Reverse Transkriptase Random Primer, 0,25 Mikroliter Reverse Transkriptase Enzym und 0,5 Mikroliter RNase Inhibitor. Füllen Sie das Volumen auf 20 Mikroliter mit nukleasefreiem Wasser.Stellen Sie das Röhrchen 10 Minuten lang auf 25 Grad Celsius, gefolgt von 50 Grad Celsius für eine Stunde. Dann stellen Sie das Röhrchen fünf Minuten lang auf 85 Grad Celsius, um das Enzym zu inaktivieren. Richten Sie die PCR-Reaktion von 22 Mikrolitern in 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchen oder -Streifen ein, zusammen mit einem Negativkontrollröhrchen und Nicht-Template-Kontrollröhrchen.Fügen Sie 11 Mikroliter dd-PCR-Mastermix, 5,5 Mikroliter zirkuläre RNA-spezifische Vorwärts- und Rückwärtsprimermischung mit einer Mikromolkonzentration und 5,5 Mikroliter nukleasefreies Wasser hinzu, um die NTC-Reaktionsröhrchen einzurichten. Um die Reagenzgläser einzurichten, fügen Sie 11 Mikroliter dd-PCR-Mastermix, 5,5 Mikroliter zirkuläre RNA-spezifische Vorwärts- und Rückwärtsprimermischung mit einer Mikromolkonzentration und 5,5 Mikroliter cDNA hinzu. Für die Tröpfchenerzeugung werden 20 Mikroliter der PCR-Mischung aus 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchen in die Probentöpfe der Tröpfchengeneratorkartusche überführt.Geben Sie 70 Mikroliter Tröpfchenöl vorsichtig mit einer Pipette in die Ölquellen der Tröpfchengeneratorpatrone. Decken Sie die Tröpfchengeneratorpatrone mit einer Gummidichtung ab und legen Sie sie in die Tröpfchengeneratormaschine, um die Probenöltröpfchenmischung zu erhalten, die in den Tröpfchenmulden der Patrone erzeugt wird. Zur PCR-Amplifikation werden 40 Mikroliter der Probenöltröpfchenmischung aus den Tröpfchenquellen der Tröpfchengeneratorkartusche mit einer Pipette auf eine 96-Well-PCR-Platte übertragen.Versiegeln Sie die 96-Well-PCR-Platte mit dem Aluminiumfolienversiegeler. Legen Sie es in den auf 180 Grad Celsius vorgeheizten Maschinenblock der Plattenversiegelung und klicken Sie auf das Siegel zum Verschließen der PCR-Platte. Legen Sie dann die Platte in den dd-PCR-Thermocycler und stellen Sie die Deckeltemperatur auf 105 Grad Celsius und eine Rampenrate auf zwei Grad Celsius pro Sekunde ein.Sobald die PCR abgeschlossen ist, legen Sie die Platte auf das tt-PCR-Tröpfchenzählergerät mit dem Plattenhalter in der richtigen Position zum Zählen der Tröpfchen. Öffnen Sie die Tröpfchenanalysesoftware und richten Sie den Lauf ein, indem Sie die Probeninformationen eingeben. Klicken Sie auf die Schaltfläche Analysieren, um die Daten nach Abschluss der Tröpfchenmessung zu analysieren.Klicken Sie dann auf die Schaltfläche 1D-Amplitude, um die positiven und negativen Tröpfchen anzuzeigen. Um die positiven Tröpfchen von den negativen Tröpfchen zu trennen, setzen Sie eine gemeinsame Schwellenwertlinie für alle Proben mit demselben Ziel. Klicken Sie auf die Schaltfläche Exportieren, um die zirkulären RNA-Zähldaten als CSV-Datei zu exportieren.Die exportierten Daten zeigen die Anzahl der zirkulären RNAs, die in jeder Probe vorhanden sind. Berechnen Sie manuell die Anzahl der zirkulären RNAs in jeder Probe pro Nanogramm RNA, indem Sie die Gesamtmenge an cDNA berücksichtigen, die in jeder Reaktion verwendet wird. Die Datenanalyse mit QuantaSoft Software wird hier gezeigt.Alle Proben außer MT1 zeigten mehr als 12.000 Tröpfchenzahlen. Da die Gesamttropfenzahl in MT1 niedrig war, wurde diese Stichprobe für die abschließende Datenanalyse nicht berücksichtigt. Interessanterweise gab es einen deutlichen Unterschied im Expressionsmuster von Circ B und C2 in der viertägigen differenzierten Myotube-Erkrankung im Vergleich zu den Myoblastenzellen.Die Analyse der Circ B- und C2-Häufigkeit in Bezug auf die Kopienzahl zeigte, dass die drei Replikate von C2C12-Myoblasten 76,8, 67 und 46 Kopien pro Nanogramm RNA aufwiesen, während die beiden Myotube-Proben 558 und 610 Kopien pro Nanogramm RNA aufwiesen. Die Daten im Balkendiagramm stellen den Mittelwert plus minus Standardabweichung von zwei bis drei biologischen Replikaten dar. ddPCR ist eine der fortschrittlichsten Methoden, um die genaue differentielle Expression von zirkulärer Ziel-RNA zu messen.Diese Methode wird ein wesentliches Instrument sein, um die zirkuläre RNA-Forschung und die diagnostische Industrie im kommenden Jahr zu beschleunigen.

Research

JoVE Journal

Biology

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