Name: quantification of circular rnas using digital droplet pcr
Uploaded: 2022-09-16T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מימון תוך-מוחי מהמכון למדעי החיים, מענק המחקר DBT (BT/PR27622/MED/30/1961/2018), ומלגת Wellcome Trust/DBT India Alliance [IA/I/18/2/504017] שהוענקה לאמארש ג. פנדה. אנו מודים לחברי מעבדה אחרים על הגהת המאמר.

רנ"א רגיש ל-RNases; לכן, כל הריאגנטים, המכשירים וסביבות העבודה צריכים להיות נטולי RNase ומטופלים בזהירות.
1. תכנון פריימר מסתעף עבור circRNA (ראו איור 1)
<ol><li>אחזר את הרצף הבוגר מנתוני ביאור circRNA באמצעות BEDTools או מדפדפן הגנום של UCSC על ידי צירוף רצף האקסו...

<ol>
	<li>Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+the+predominant+transcript+isoform+from+hundreds+of+human+genes+in+diverse+cell+types.">Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types.</a> PLoS One. 7 (2), 30733 (2012).</li><li>Chen, L. L., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+circRNA+biogenesis.">Regulation of circRNA biogenesis.</a> RNA Biology. 12 (4), 381-388 (2015).</li><li>Kristensen, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biogenesis,+biology+and+characterization+of+circular+RNAs.">The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs.</a> Nature Reviews Genetics. 20 (11), 675-691 (2019).</li><li>Chen, X., Zhou, M., Yant, L., Huang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNA+in+disease:+Basic+properties+and+biomedical+relevance.">Circular RNA in disease: Basic properties and biomedical relevance.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. , (2022).</li><li>Sinha, T., Panigrahi, C., Das, D., Chandra Panda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNA+translation,+a+path+to+hidden+proteome.">Circular RNA translation, a path to hidden proteome.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 13 (1), 1685 (2022).</li><li>Panda, A. C., Xiao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+Act+as+miRNA+Sponges.">Circular RNAs Act as miRNA Sponges.</a> Circular RNAs: Biogenesis and Functions. , 67-79 (2018).</li><li>Das, A., Sinha, T., Shyamal, S., Panda, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+role+of+circular+RNA-protein+interactions.">Emerging role of circular RNA-protein interactions.</a> Non-Coding RNA. 7 (3), 48 (2021).</li><li>Verduci, L., Tarcitano, E., Strano, S., Yarden, Y., Blandino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CircRNAs:+Role+in+human+diseases+and+potential+use+as+biomarkers.">CircRNAs: Role in human diseases and potential use as biomarkers.</a> Cell Death &amp; Disease. 12 (5), 468 (2021).</li><li>Pandey, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+analysis+of+circular+RNAs.">Methods for analysis of circular RNAs.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 11 (1), 1566 (2020).</li><li>Das, A., Das, D., Panda, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+circular+RNAs+by+PCR.">Validation of circular RNAs by PCR.</a> PCR Primer Design. Methods in Molecular Biology. 2392, 103-114 (2022).</li><li>Jeck, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+abundant,+conserved,+and+associated+with+ALU+repeats.">Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats.</a> RNA. 19 (2), 141-157 (2013).</li><li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+droplet+digital+polymerase+chain+reaction+format+for+DNA+copy+number+quantification.">Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification.</a> Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).</li><li>Hayden, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+droplet+digital+PCR+to+real-time+PCR+for+quantitative+detection+of+cytomegalovirus.">Comparison of droplet digital PCR to real-time PCR for quantitative detection of cytomegalovirus.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (2), 540-546 (2013).</li><li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets:+From+variable+nonsense+to+publication+quality+data.">Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: From variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7, 2409 (2017).</li><li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number.">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li><li>Ishak, A., AlRawashdeh, M. M., Esagian, S. M., Nikas, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic,+prognostic,+and+therapeutic+value+of+droplet+digital+PCR+(ddPCR)+in+COVID-19+patients:+A+systematic+review.">Diagnostic, prognostic, and therapeutic value of droplet digital PCR (ddPCR) in COVID-19 patients: A systematic review.</a> Journal of Clinical Medicine. 10 (23), 5712 (2021).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+droplet+digital+PCR+to+detect+the+pathogens+of+infectious+diseases.">Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases.</a> Bioscience Reports. 38 (6), (2018).</li><li>Lee, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+UCSC+genome+browser+database:+2022+update.">The UCSC genome browser database: 2022 update.</a> Nucleic Acids Research. 50, 1115-1122 (2022).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+A+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li><li>Untergasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer3--new+capabilities+and+interfaces.">Primer3--new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Research. 40 (15), 115 (2012).</li><li>Das, A., Das, D., Das, A., Panda, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quick+and+cost-effective+method+for+DNA-free+total+RNA+isolation+using+magnetic+silica+beads.">A quick and cost-effective method for DNA-free total RNA isolation using magnetic silica beads.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Oberacker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Synthesis+of+Functionalized+Paramagnetic+Beads+for+Nucleic+Acid+Purification+and+Manipulation.">Simple Synthesis of Functionalized Paramagnetic Beads for Nucleic Acid Purification and Manipulation.</a> Bio-protocol. 9 (20), 3394 (2019).</li><li>Ra&#269;ki, N., Dreo, T., Gutierrez-Aguirre, I., Blejec, A., Ravnikar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+transcriptase+droplet+digital+PCR+shows+high+resilience+to+PCR+inhibitors+from+plant,+soil+and+water+samples.">Reverse transcriptase droplet digital PCR shows high resilience to PCR inhibitors from plant, soil and water samples.</a> Plant Methods. 10 (1), 42 (2014).</li><li>Taylor, S. C., Carbonneau, J., Shelton, D. N., Boivin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+droplet+digital+PCR+from+RNA+and+DNA+extracts+with+direct+comparison+to+RT-qPCR:+Clinical+implications+for+quantification+of+Oseltamivir-resistant+subpopulations.">Optimization of droplet digital PCR from RNA and DNA extracts with direct comparison to RT-qPCR: Clinical implications for quantification of Oseltamivir-resistant subpopulations.</a> Journal of Virological Methods. 224, 58-66 (2015).</li></ol>

מחקר CircRNA גדל בעשור האחרון עם גילוי טכנולוגיות ריצוף בתפוקה גבוהה. כתוצאה מכך, היא נחשבה למולקולה פוטנציאלית לטיפולי RNA עתידיים. בנוסף, ידוע כי הוא משמש כסמן ביולוגי במספר מחלות, כולל סרטן ומחלות לב וכלי דם 4,8. עם זאת, הזיהוי של circRNA הוא מסובך בגלל השפע הנמוך של...

ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיות ריצוף RNA ואלגוריתמים חישוביים חדשניים גילו חבר חדש במשפחה ההולכת וגדלה של רנ"א שאינם מקודדים, הנקראים RNA מעגלי (circRNA)1. כפי שהשם מרמז, circRNAs הם משפחה של מולקולות RNA חד-גדיליות ללא קצוות חופשיים. הם נוצרים על ידי שחבור לא-קנוני של ראש-לזנב הנקרא שחבור אחורי, שבו אתר מקבל השחבור במעלה הזרם מתחבר באופן קוולנטי עם אתר תורם השחבור במורד הזרם ויוצר מעגל RNA יציב 1,2. תהליך זה יכול להיות מתווך על ידי מספר גורמים, כולל אלמנטים חוזרים של Alu הפוכים הנמצאים במעלה הזרם ובמורד הזרם של אקסונים מעגליים, או יכול להיות מתווך על ידי כמה גורמי שחבור או חלבונים קושרי RNA (RBPs)2,3. רנ"א מעגלי שנוצר באופן בלעדי מהרצף האקסוני או האינטרוני מסווג כ-circRNA אקסוני ו-RNA אינטרוני מעגלי או ci-RNAs, בעוד שחלק מה-circRNAs האקסוניים שומרים על האינטרון ונקראים אקסון-אינטרון circRNAs (EIcircRNAs)3,4. הפונקציות של circRNA הן רבות פנים, כולל ספוג miRNA ו / או RBP, ויסות שעתוק, וויסות תפקוד התא על ידי תרגום לפפטידים 3,5,6,7. מספר דיווחים הדגישו את החשיבות של circRNAs במחלות שונות ובתהליכים פיזיולוגיים8. יתר על כן, דפוסי ביטוי ספציפיים לרקמות ועמידות לעיכול אקסונוקלאז הופכים אותו לסמן ביולוגי פונקציונלי לאבחון מחלות והוא יכול לשמש גם כיעד טיפולי מתאים8. בהתחשב בחשיבותו בוויסות הבריאות והמחלות, הכימות המדויק של ביטוי circRNA הוא צורך השעה.
מספר שיטות ביוכימיות פותחו לכימות circRNAs בדגימות ביולוגיות9. אחת השיטות הנוחות והמקובלות ביותר לכימות circRNA היא שעתוק הפוך ואחריו תגובת שרשרת פולימראז כמותית (RT-qPCR) באמצעות זוגות פריימרים מסתעפים10. עם זאת, רוב ה-circRNAs נמצאים בשפע נמוך בהשוואה ל-mRNAs ליניאריים, מה שמקשה לכמת אותם11. כדי להתגבר על בעיה זו, ביקשנו להשתמש בטיפות דיגיטליות PCR (dd-PCR) כדי לכמת את מספר ה-circRNAs בדגימה נתונה באופן מדויק. ה- dd-PCR היא טכנולוגיית PCR מתקדמת הפועלת על פי עקרון המיקרופלואידיקה; הוא מייצר טיפות מימיות מרובות בשמן, וה-PCR מופיע בכל טיפה כתגובה בודדת12. התגובה מתרחשת בטיפות בודדות ומנותחת באמצעות קורא טיפות, אשר נותן את מספר הטיפות חיוביות או שליליות עבור הגן המעניין12. זוהי הטכניקה הרגישה ביותר לכימות מדויק של גן בעל עניין, גם אם יש רק עותק אחד בדגימה נתונה. ירידה ברגישות כלפי מעכבים, דיוק טוב יותר והשמטת גן הייחוס לכימות הופכים אותו ליתרון יותר מאשר qPCR13,14,15 קונבנציונלי. הוא נמצא בשימוש נרחב ככלי מחקר ואבחון לכימות מוחלט של גן בעל עניין16,17. כאן נתאר את פרוטוקול dd-PCR המפורט לכימות circRNA בהבחנה בין מיוטובים C2C12 של עכברים לבין מיובלסטים של עכברים מתרבים C2C12 באמצעות פריימרים מסתעפים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >1.5 ml microcentifuge tube</td>
			<td >Tarson</td>
			<td >500010</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.2 ml tube strips with cap</td>
			<td >Tarson</td>
			<td >610020, 510073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filter Tips</td>
			<td >Tarson</td>
			<td >528104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >10977023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell scrapper</td>
			<td >HiMedia</td>
			<td >TCP223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chloroform</td>
			<td >SRL</td>
			<td >96764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA diluent</td>
			<td >HiMedia</td>
			<td >MB228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Random primers</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >48190011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >dNTP set</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >R0181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Murine RNase inhibitor</td>
			<td >NEB</td>
			<td >M0314S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Maxima reverse transcriptase</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >EP0743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 dd-PCR Evagreen Supermix</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Droplet generation oil for Evagreen</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1814040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DG8 Cartridges and Gaskets</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DG8 Cartridge holder</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1863051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 Droplet Generator</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ddPCR 96-Well Plates</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >12001925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PX1 PCR Plate Sealer</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1814000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C1000 Touch Thermal Cycler with 96&#8211;Deep Well Reaction Module</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1851197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 Droplet Reader</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Quantasoft Software</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silica column</td>
			<td >Umbrella Life Science</td>
			<td >38220090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UCSC Genome Browser</td>
			<td ></td>
			<td >https://genome.ucsc.edu/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primer 3</td>
			<td ></td>
			<td >https://primer3.ut.ee/</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of circular rnas using digital droplet pcr

תגובת שרשרת פולימראז טיפות דיגיטלית (dd-PCR) היא אחת משיטות הכימות הרגישות ביותר; הוא מחלק את התגובה לכמעט 20,000 טיפות מים בשמן, וה-PCR מתרחש בטיפות הבודדות. ל-dd-PCR יש מספר יתרונות על פני qPCR קונבנציונלי בזמן אמת, כולל דיוק מוגבר באיתור מטרות בשפע נמוך, השמטת גני ייחוס לכימות, ביטול שכפולים טכניים לדגימות והפגנת עמידות גבוהה בפני מעכבים בדגימות. לאחרונה, dd-PCR הפך לאחת השיטות הפופולריות ביותר לכימות מדויק של דנ"א מטרה או RNA לצורך ניתוח ביטוי גנים ואבחון. רנ"א מעגלי (circRNAs) הם משפחה גדולה של מולקולות RNA סגורות קוולנטיות שהתגלו לאחרונה, חסרות קצוות של 5' ו-3'. הודגם כי הם מווסתים את ביטוי הגנים על ידי כך שהם מתפקדים כספוגים עבור חלבונים קושרי RNA ומיקרו-רנ"א. יתר על כן, circRNAs מופרשים לנוזלי גוף, ועמידותם בפני אקסונוקלאזות גורמת להם לשמש כסמנים ביולוגיים לאבחון מחלות. מאמר זה נועד להראות כיצד לבצע תכנון פריימר מסתעף, מיצוי RNA, סינתזת cDNA וניתוח dd-PCR כדי לכמת במדויק רמות RNA מעגליות ספציפיות (circRNA) בתאים. לסיכום, אנו מדגימים את הכימות המדויק של circRNAs באמצעות dd-PCR.

ניתן לגזור את המספר המוחלט של circRNAs בכל דגימה מנתוני dd-PCR המיוצאים. ניתוח PCR כמותי בזמן אמת הציע ביטוי דיפרנציאלי של circBnc2 במיוטיובים המובחנים C2C12 (הנתונים לא מוצגים). כאן, רצינו לבדוק את מספר העותקים המוחלט של circBnc2 בהתפשטות מיובלסטים ומיוטובים C2C12. מכיוון שהביטוי של circBnc2 מושווה ...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR at JoVE.com

Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR

פרוטוקול זה מתאר את השיטה המפורטת של טיפות דיגיטליות PCR (dd-PCR) לכימות מדויק של רמות RNA מעגלי (circRNA) בתאים באמצעות פריימרים מסתעפים.

כימות רנ"א מעגלי באמצעות טיפות דיגיטליות PCR

Digital droplet polymerase chain reaction (dd-PCR) is one of the most sensitive quantification methods; it fractionates the reaction into nearly 20,000 ...

dd-PCR היא שיטה רגישה ומדויקת ביותר לכימות מוחלט של דנ"א מטרה או RNA. הוא שימש לאבחון מחלות כאשר שיטות קונבנציונליות אחרות אינן מצליחות לתת תוצאות מדויקות. dd-PCR היא הטכניקה הרגישה ביותר לאיתור מולקולות של חומצות גרעין בשפע נמוך מאוד.שלא כמו PCR כמותי, dd-PCR אינו דורש כל בקרת גנים ביתית לכימות. בשל רגישותו ודיוקו, dd-PCR יכול לשמש ככלי לאבחון מולקולרי ולמחקר הכולל מולקולות RNA בשפע נמוך כמו מיקרו-רנ"א ו-RNA מעגלי. לפני השימוש ב-dd-PCR, יש לבצע RT-PCR או RT-qPCR כדי לאשר שהפריימרים מגבירים את גני המטרה שלהם ללא כל הגברה לא ספציפית של PCR.כדי להתחיל, הכינו תבנית PCR רצף של 200 נוקלאוטידים באורך על ידי צירוף 100 הנוקלאוטידים האחרונים של אורך רצף הרנ"א המעגלי הכולל ל-100 הנוקלאוטידים הראשונים של רצף הרנ"א המעגלי. השתמש ברצף התבניות עבור פריימר, שעוצב על-ידי כלי האינטרנט Primer 3. קח מנה אחת בגודל 10 ס"מ המכילה כ-5 מיליון תאי מיובלסט C2C12 מתרבים ומיוטיוב C2C12 מובחן אחד לארבעה ימים לבידוד RNA.לשטוף את התאים עם 10 מיליליטר של 1X PBS שלוש פעמים ולהשליך את PBS באמצעות פיפטה. מוסיפים מיליליטר אחד של מגיב בידוד RNA ומניחים את התאים על ידי פיפטינג נמרץ. לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטרים של כלורופורם ומערבולת למשך 15 שניות.צנטריפוגה את הצינור בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ב 12, 000 G.קח 400 microliters של השכבה המימית העליונה, לטעון אותו על עמוד סיליקה, צנטריפוגה במשך דקה אחת ב 12, 000 G בטמפרטורת החדר. קח את הזרימה דרך צינור חדש ולהוסיף 600 microliters של 100% אתנול. מוסיפים 20 מיקרוליטרים של חרוזי סיליקה מגנטיים ומניחים את הצינור על תרמומיקסר, שנקבע ב 25 מעלות צלזיוס ו 1, 200 סל"ד במשך חמש דקות.לאחר מכן, הנח את הצינור על מעמד מגנטי למשך 30 שניות או עד שהתמיסה תתבהר. השהה את חרוזי הסיליקה המגנטיים ב-500 מיקרוליטרים של חיץ רחצה המכיל 90% אתנול. לאחר הנחת הצינור על המעמד המגנטי למשך 30 שניות, תנו לחרוזים להתיישב לכיוון המגנט והשליכו את החיץ באמצעות פיפטה.אוויר לייבש את הצינור ב 50 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות על thermomixer, שמירה על המכסה פתוח. מוסיפים 20 מיקרוליטרים של מים נטולי נוקלאז ומשעים את החרוזים. אסוף את הרנ"א המומס בצינור חדש להערכת כמות ואיכות באמצעות ספקטרופוטומטר.מדוד את ריכוז הרנ"א באמצעות ספקטרופוטומטר וקח מיקרוגרם אחד של RNA לסינתזת cDNA. מערבבים מיקרוגרם אחד של רנ"א כולל עם מיקרוליטר אחד של תערובת dNTP, ארבעה מיקרוליטרים של מאגר טרנסקריפטאז הפוך 5X, שני מיקרוליטרים של פריימר אקראי של 10X טרנסקריפטאז הפוך, 0.25 מיקרוליטרים של אנזים טרנסקריפטאז הפוך, ו-0.5 מיקרוליטרים של מעכב RNase. הרכיבו את הנפח ל-20 מיקרוליטרים באמצעות מים נטולי נוקלאז.מניחים את הצינור על 25 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות, ואחריו 50 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. לאחר מכן מניחים את הצינור ב 85 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות כדי להשבית את האנזים. הגדר את תגובת ה- PCR של 22 מיקרוליטר בצינורות או רצועות PCR של 0.2 מיליליטר, יחד עם צינור בקרה שלילי וצינורות בקרה שאינם תבנית.הוסף 11 מיקרוליטרים של תערובת מאסטר dd-PCR, 5.5 מיקרוליטרים של תערובת פריימר מעגלית ספציפית ל-RNA קדימה ואחורה של ריכוז מיקרומולרי אחד, ו-5.5 מיקרוליטרים של מים נטולי נוקלאז כדי להגדיר את צינורות התגובה של NTC. באופן דומה, כדי להגדיר את מבחנות התגובה, הוסף 11 מיקרוליטרים של תערובת מאסטר dd-PCR, 5.5 מיקרוליטרים של תערובת פריימר RNA מעגלית ספציפית קדימה ואחורה של ריכוז מיקרומולרי אחד, ו-5.5 מיקרוליטרים של cDNA. עבור דור הטיפות, העבר 20 מיקרוליטרים של תערובת ה- PCR מצינורות PCR של 0.2 מיליליטר לבארות הדגימה של מחסנית מחולל הטיפות.הוסף 70 מיקרוליטר של שמן לייצור טיפות לבארות הנפט של מחסנית מחולל הטיפות בזהירות, באמצעות פיפטה. כסו את מחסנית מחולל הטיפות באטם גומי והניחו אותה במכונת מחולל הטיפות כדי לקבל את תערובת טיפות השמן לדוגמה, שנוצרה בבארות הטיפות של המחסנית. להגברת PCR, העבירו 40 מיקרוליטרים של תערובת טיפות השמן לדוגמה מבארות הטיפות של מחסנית מחולל הטיפות לצלחת PCR של 96 בארות באמצעות פיפטה.אטמו את לוחית ה-PCR בעלת 96 הבארות עם איטום רדיד אלומיניום. הנח אותו בבלוק מכונת איטום הצלחות, שחומם מראש ב-180 מעלות צלזיוס, ולחץ על איטום לאיטום צלחת ה-PCR. לאחר מכן, הניחו את הצלחת במחזור התרמי dd-PCR והגדירו את טמפרטורת המכסה ל -105 מעלות צלזיוס וקצב רמפה לשתי מעלות צלזיוס לשנייה.לאחר סיום ה-PCR, הניחו את הצלחת על מכונת מונה הטיפות dd-PCR כאשר מחזיק הצלחת נמצא במיקום הנכון לספירת הטיפות. פתח את תוכנת ניתוח הטיפות והגדר את הריצה על ידי מתן קלט של המידע לדוגמה. לחץ על כפתור הניתוח כדי לנתח את הנתונים לאחר השלמת קריאת הטיפות.לאחר מכן, לחץ על משרעת 1D כפתור כדי לראות את הטיפות החיוביות והשליליות. כדי להפריד בין הטיפות החיוביות לבין הטיפות השליליות, שים קו סף משותף לכל הדגימות עם אותה מטרה. לחץ על לחצן הייצוא כדי לייצא את נתוני ספירת הרנ"א המעגלית כקובץ csv.הנתונים המיוצאים מראים את מספר הרנ"א המעגלי הקיים בכל דגימה. חשב באופן ידני את מספר ה-RNA המעגלי בכל דגימה לכל ננוגרם של RNA על-ידי התחשבות בכמות הכוללת של cDNA המשמשת בכל תגובה. ניתוח הנתונים באמצעות תוכנת QuantaSoft מוצג כאן.כל הדגימות למעט MT1 הראו יותר מ -12, 000 ספירות טיפות. מכיוון שספירת הטיפות הכוללת הייתה נמוכה ב- MT1, מדגם זה לא נלקח בחשבון לניתוח הנתונים הסופי. באופן מעניין, היה הבדל ברור בתבנית הביטוי של Circ B ו- C2 במצב המיוטוב המובחן בארבעה ימים בהשוואה לתאי המיאובלסט.הניתוח של שפע Circ B ו- C2 במונחים של מספר עותק, הצביע על כך שלשלושת ההעתקים של מיובלסטים C2C12 היו 76.8, 67 ו-46 עותקים לכל ננוגרם של RNA, בעוד שלשתי דגימות המיוטיוב היו 558 ו-610 עותקים לכל ננוגרם של RNA. הנתונים בגרף העמודות מייצגים את סטיית התקן הממוצעת פלוס מינוס של שניים עד שלושה שכפולים ביולוגיים. ddPCR היא אחת השיטות המתקדמות ביותר למדידת הביטוי הדיפרנציאלי המדויק של RNA מעגלי מטרה.שיטה זו תהיה כלי חיוני להאצת מחקר RNA מעגלי ותעשיות אבחון בשנה הקרובה.

Research

JoVE Journal

Biology

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

פרופיל של טרום מיקרו RNAs ו רנ&quot;א באמצעות כמותי בזמן אמת PCR (qPCR) מערכים

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Rapid PCR Thermocycling using Microscale Thermal Convection

ראפיד PCR Thermocycling באמצעות הסעה תרמית Microscale

Many molecular biology assays depend in some way on the polymerase chain reaction (PCR) to amplify an initially dilute target DNA sample to a detectable ...

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

בידוד של קטן noncoding RNAs מסרום האדם

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Readout גורף פשוט של דיגיטלי מבחני כימות חומצות גרעין

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

העסקת דיגיטלי אגל PCR לזיהוי מוטציות V600E BRAF בשורות תאי ההפניה תקן קבוע פורמלין מוטבע-פרפין

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

Using Digital Image Correlation to Characterize Local Strains on Vascular Tissue Specimens

באמצעות מתאם תמונה דיגיטלי לאפיין זנים מקומיים בדגימות רקמת כלי דם

Characterization of the mechanical behavior of biological and engineered soft tissues is a central component of fundamental biomedical research and ...

Genome-wide Purification of Extrachromosomal Circular DNA from Eukaryotic Cells

טיהור הגנום כולו של DNA המעגל extrachromosomal מתאי איקריוטיים

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs ...

Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR

כימות מוחלטת של פלזמה רמות MicroRNA בקופים Cynomolgus, באמצעות שעתוק במהופך בזמן אמת PCR כמותי

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This ...

Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit

השומנים מהירה Droplet בידוד פרוטוקול באמצעות ערכת בידוד להקציע אברון

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral ...

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

פרוטוקולי PCR דיגיטליים טיפתיים דו-שלביים של תמלול לאחור לזיהוי וכימות SARS-CoV-2

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...