Name: quantification of circular rnas using digital droplet pcr
Uploaded: 2022-09-16T14:50:00
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इस कार्य को इंस्टीट्यूट ऑफ लाइफ साइंसेज, डीबीटी अनुसंधान अनुदान (बीटी/पीआर 27622/एमईडी/30/1961/2018) और अमरेश सी पांडा को दिए गए वेलकम ट्रस्ट/डीबीटी इंडिया एलायंस फैलोशिप [आईए/आई/18/2/504017] से इंट्राम्यूरल फंडिंग द्वारा समर्थित किया गया था। हम लेख को प्रूफरीडिंग करने के लिए अन्य प्रयोगशाला सदस्यों को धन्यवाद देते हैं।

आरएनए आरएनए के प्रति संवेदनशील है; इसलिए, सभी अभिकर्मकों, उपकरणों और कार्यक्षेत्र को RNase-मुक्त होना चाहिए और देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए।
1. सर्आरएनए के लिए डाइवर्जेंट प्राइमर डिजाइन (</stro...

<ol>
	<li>Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+the+predominant+transcript+isoform+from+hundreds+of+human+genes+in+diverse+cell+types.">Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types.</a> PLoS One. 7 (2), 30733 (2012).</li><li>Chen, L. L., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+circRNA+biogenesis.">Regulation of circRNA biogenesis.</a> RNA Biology. 12 (4), 381-388 (2015).</li><li>Kristensen, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biogenesis,+biology+and+characterization+of+circular+RNAs.">The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs.</a> Nature Reviews Genetics. 20 (11), 675-691 (2019).</li><li>Chen, X., Zhou, M., Yant, L., Huang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNA+in+disease:+Basic+properties+and+biomedical+relevance.">Circular RNA in disease: Basic properties and biomedical relevance.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. , (2022).</li><li>Sinha, T., Panigrahi, C., Das, D., Chandra Panda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNA+translation,+a+path+to+hidden+proteome.">Circular RNA translation, a path to hidden proteome.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 13 (1), 1685 (2022).</li><li>Panda, A. C., Xiao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+Act+as+miRNA+Sponges.">Circular RNAs Act as miRNA Sponges.</a> Circular RNAs: Biogenesis and Functions. , 67-79 (2018).</li><li>Das, A., Sinha, T., Shyamal, S., Panda, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+role+of+circular+RNA-protein+interactions.">Emerging role of circular RNA-protein interactions.</a> Non-Coding RNA. 7 (3), 48 (2021).</li><li>Verduci, L., Tarcitano, E., Strano, S., Yarden, Y., Blandino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CircRNAs:+Role+in+human+diseases+and+potential+use+as+biomarkers.">CircRNAs: Role in human diseases and potential use as biomarkers.</a> Cell Death &amp; Disease. 12 (5), 468 (2021).</li><li>Pandey, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+analysis+of+circular+RNAs.">Methods for analysis of circular RNAs.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 11 (1), 1566 (2020).</li><li>Das, A., Das, D., Panda, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+circular+RNAs+by+PCR.">Validation of circular RNAs by PCR.</a> PCR Primer Design. Methods in Molecular Biology. 2392, 103-114 (2022).</li><li>Jeck, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+abundant,+conserved,+and+associated+with+ALU+repeats.">Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats.</a> RNA. 19 (2), 141-157 (2013).</li><li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+droplet+digital+polymerase+chain+reaction+format+for+DNA+copy+number+quantification.">Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification.</a> Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).</li><li>Hayden, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+droplet+digital+PCR+to+real-time+PCR+for+quantitative+detection+of+cytomegalovirus.">Comparison of droplet digital PCR to real-time PCR for quantitative detection of cytomegalovirus.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (2), 540-546 (2013).</li><li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets:+From+variable+nonsense+to+publication+quality+data.">Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: From variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7, 2409 (2017).</li><li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number.">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li><li>Ishak, A., AlRawashdeh, M. M., Esagian, S. M., Nikas, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic,+prognostic,+and+therapeutic+value+of+droplet+digital+PCR+(ddPCR)+in+COVID-19+patients:+A+systematic+review.">Diagnostic, prognostic, and therapeutic value of droplet digital PCR (ddPCR) in COVID-19 patients: A systematic review.</a> Journal of Clinical Medicine. 10 (23), 5712 (2021).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+droplet+digital+PCR+to+detect+the+pathogens+of+infectious+diseases.">Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases.</a> Bioscience Reports. 38 (6), (2018).</li><li>Lee, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+UCSC+genome+browser+database:+2022+update.">The UCSC genome browser database: 2022 update.</a> Nucleic Acids Research. 50, 1115-1122 (2022).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+A+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li><li>Untergasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer3--new+capabilities+and+interfaces.">Primer3--new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Research. 40 (15), 115 (2012).</li><li>Das, A., Das, D., Das, A., Panda, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quick+and+cost-effective+method+for+DNA-free+total+RNA+isolation+using+magnetic+silica+beads.">A quick and cost-effective method for DNA-free total RNA isolation using magnetic silica beads.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Oberacker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Synthesis+of+Functionalized+Paramagnetic+Beads+for+Nucleic+Acid+Purification+and+Manipulation.">Simple Synthesis of Functionalized Paramagnetic Beads for Nucleic Acid Purification and Manipulation.</a> Bio-protocol. 9 (20), 3394 (2019).</li><li>Ra&#269;ki, N., Dreo, T., Gutierrez-Aguirre, I., Blejec, A., Ravnikar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+transcriptase+droplet+digital+PCR+shows+high+resilience+to+PCR+inhibitors+from+plant,+soil+and+water+samples.">Reverse transcriptase droplet digital PCR shows high resilience to PCR inhibitors from plant, soil and water samples.</a> Plant Methods. 10 (1), 42 (2014).</li><li>Taylor, S. C., Carbonneau, J., Shelton, D. N., Boivin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+droplet+digital+PCR+from+RNA+and+DNA+extracts+with+direct+comparison+to+RT-qPCR:+Clinical+implications+for+quantification+of+Oseltamivir-resistant+subpopulations.">Optimization of droplet digital PCR from RNA and DNA extracts with direct comparison to RT-qPCR: Clinical implications for quantification of Oseltamivir-resistant subpopulations.</a> Journal of Virological Methods. 224, 58-66 (2015).</li></ol>

उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों की खोज के साथ पिछले दशक में सीआईआरएनए अनुसंधान में वृद्धि हुई है। नतीजतन, इसे भविष्य के आरएनए चिकित्सीय के लिए एक संभावित अणु माना गया है। इसके अलावा, यह कैंसर और...

आरएनए अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों और उपन्यास कम्प्यूटेशनल एल्गोरिदम में हालिया प्रगति ने गैर-कोडिंग आरएनए के बढ़ते परिवार के एक नए सदस्य की खोज की है, जिसे परिपत्र आरएनए (सीआईआरएनए) 1 कहा जाता है। जैसा कि नाम से पता चलता है, लगभग आरएनए एकल-फंसे आरएनए अणुओं का एक परिवार है जिसमें कोई मुक्त सिरा नहीं है। वे गैर-कैननिकल हेड-टू-टेल स्प्लिसिंग द्वारा बनाए जाते हैं जिन्हें बैक-स्प्लिसिंग कहा जाता है, जहां अपस्ट्रीम स्प्लिस स्वीकर्ता साइट डाउनस्ट्रीम स्प्लिस डोनर साइट के साथ सहसंयोजक रूप से जुड़ती है ताकि एक स्थिर आरएनए सर्कल 1,2 बनाया जा सके। इस प्रक्रिया को कई कारकों द्वारा मध्यस्थ किया जा सकता है, जिसमें गोलाकार एक्सॉन के अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम में मौजूद उल्टे अलु दोहराए जाने वाले तत्व शामिल हैं, या कुछ स्प्लिसिंग कारकों या आरएनए बाइंडिंग प्रोटीन (आरबीपी) 2,3 द्वारा मध्यस्थता की जा सकती है। एक्सोनिक या इनट्रोनिक अनुक्रम से विशेष रूप से उत्पन्न परिपत्र आरएनए को एक्सोनिक सर्आरएनए और सर्कुलर इनट्रोनिक आरएनए या सीआई-आरएनए के रूप में वर्गीकृत किया जाता है, जबकि कुछ एक्सॉनिक सर्आरएनए इंट्रोन को बनाए रखते हैं और उन्हें एक्सॉन-इंट्रॉन सर्आरएनए (ईआईसीआईआरआरएनए) 3,4 कहा जाता है। लगभग आरएनए के कार्य बहुमुखी हैं, जिसमें स्पंजिंग मिआरएनए और / या आरबीपी, प्रतिलेखन को विनियमित करना और पेप्टाइड्स 3,5,6,7 में अनुवाद करके सेलुलर फ़ंक्शन को विनियमित करना शामिल है। कई रिपोर्टों ने विभिन्न बीमारियों और शारीरिक प्रक्रियाओं में सीआईआरएनए के महत्व पर प्रकाश डालाहै। इसके अलावा, ऊतक-विशिष्ट अभिव्यक्ति पैटर्न और एक्सोन्यूक्लिज़ पाचन के प्रतिरोध इसे रोग निदान के लिए एक कार्यात्मक बायोमार्कर बनाते हैं और इसका उपयोग उपयुक्त चिकित्सीय लक्ष्य8 के रूप में भी किया जा सकता है। स्वास्थ्य और रोगों को विनियमित करने में इसके महत्व को ध्यान में रखते हुए, सर्आरएनए अभिव्यक्ति का सटीक परिमाणीकरण समय की आवश्यकता है।
जैविक नमूनों में सीआईआरएनए की मात्रा निर्धारित करने के लिए कई जैव रासायनिक विधियां विकसितकी गई हैं। सर्आरएनए परिमाणीकरण के लिए सबसे सुविधाजनक और व्यापक रूप से स्वीकृत तरीकों में से एक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन है, जिसके बाद मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (आरटी-क्यूपीसीआर) डाइवर्जेंट प्राइमर जोड़े10 का उपयोग करता है। हालांकि, अधिकांश सीआईआरएनए रैखिक एमआरएनए की तुलना में कम बहुतायत में हैं, जो उन्हें11 की मात्रा निर्धारित करना चुनौतीपूर्ण बनाता है। इस मुद्दे को दूर करने के लिए, हमने किसी दिए गए नमूने में सीआईआरएनए की संख्या को सटीक रूप से निर्धारित करने के लिए डिजिटल ड्रॉपलेट पीसीआर (डीडी-पीसीआर) का उपयोग करने की मांग की। डीडी-पीसीआर एक उन्नत पीसीआर तकनीक है जो माइक्रोफ्लुइडिक्स सिद्धांत का पालन करती है; यह तेल में कई जलीय बूंदें उत्पन्न करता है, और पीसीआर प्रत्येक बूंद में एक व्यक्तिगत प्रतिक्रिया12 के रूप में होता है। प्रतिक्रिया अलग-अलग बूंदों में होती है और एक ड्रॉपलेट रीडर का उपयोग करके विश्लेषण किया जाता है, जो रुचि के जीन के लिए सकारात्मक या नकारात्मक बूंदों की संख्यादेता है। यह रुचि के जीन को सटीक रूप से निर्धारित करने के लिए सबसे संवेदनशील तकनीक है, भले ही किसी दिए गए नमूने में केवल एक प्रति हो। अवरोधकों के प्रति संवेदनशीलता में कमी, बेहतर परिशुद्धता, और परिमाणीकरण के लिए संदर्भ जीन को छोड़ना इसे पारंपरिक क्यूपीसीआर 13,14,15 की तुलना में अधिक फायदेमंद बनाता है। यह व्यापक रूप से रुचिके जीन 16,17 के पूर्ण परिमाणीकरण के लिए एक शोध और नैदानिक उपकरण के रूप में उपयोग किया गया है। यहां, हम माउस सी 2 सी 12 मायोट्यूब को अलग करने और डाइवर्जेंट प्राइमरों का उपयोग करके माउस सी 2 सी 12 मायोब्लास्ट्स के प्रसार में सर्आरएनए परिमाणीकरण के लिए विस्तृत डीडी-पीसीआर प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >1.5 ml microcentifuge tube</td>
			<td >Tarson</td>
			<td >500010</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.2 ml tube strips with cap</td>
			<td >Tarson</td>
			<td >610020, 510073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filter Tips</td>
			<td >Tarson</td>
			<td >528104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >10977023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell scrapper</td>
			<td >HiMedia</td>
			<td >TCP223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chloroform</td>
			<td >SRL</td>
			<td >96764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA diluent</td>
			<td >HiMedia</td>
			<td >MB228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Random primers</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >48190011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >dNTP set</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >R0181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Murine RNase inhibitor</td>
			<td >NEB</td>
			<td >M0314S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Maxima reverse transcriptase</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >EP0743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 dd-PCR Evagreen Supermix</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Droplet generation oil for Evagreen</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1814040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DG8 Cartridges and Gaskets</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DG8 Cartridge holder</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1863051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 Droplet Generator</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ddPCR 96-Well Plates</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >12001925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PX1 PCR Plate Sealer</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1814000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C1000 Touch Thermal Cycler with 96&#8211;Deep Well Reaction Module</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1851197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 Droplet Reader</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Quantasoft Software</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silica column</td>
			<td >Umbrella Life Science</td>
			<td >38220090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UCSC Genome Browser</td>
			<td ></td>
			<td >https://genome.ucsc.edu/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primer 3</td>
			<td ></td>
			<td >https://primer3.ut.ee/</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of circular rnas using digital droplet pcr

डिजिटल ड्रॉपलेट पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (डीडी-पीसीआर) सबसे संवेदनशील परिमाणीकरण विधियों में से एक है; यह प्रतिक्रिया को लगभग 20,000 पानी-इन-ऑयल बूंदों में विभाजित करता है, और पीसीआर व्यक्तिगत बूंदों में होता है। डीडी-पीसीआर के पारंपरिक वास्तविक समय क्यूपीसीआर पर कई फायदे हैं, जिसमें कम-बहुतायत लक्ष्यों का पता लगाने में सटीकता में वृद्धि, परिमाणीकरण के लिए संदर्भ जीन को छोड़ना, नमूनों के लिए तकनीकी प्रतिकृति को समाप्त करना और नमूनों में अवरोधकों के लिए उच्च लचीलापन दिखाना शामिल है। हाल ही में, डीडी-पीसीआर जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण और निदान के लिए लक्ष्य डीएनए या आरएनए को सटीक रूप से निर्धारित करने के लिए सबसे लोकप्रिय तरीकों में से एक बन गया है। सर्कुलर आरएनए (सीआईआरएनए) हाल ही में खोजे गए सहसंयोजक रूप से बंद आरएनए अणुओं का एक बड़ा परिवार है जिसमें 5 ' और 3 ' सिरों की कमी होती है। उन्हें आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन और माइक्रोआरएनए के लिए स्पंज के रूप में कार्य करके जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए दिखाया गया है। इसके अलावा, लगभग आरएनए शरीर के तरल पदार्थों में स्रावित होते हैं, और एक्सोन्यूक्लिज़ के लिए उनका प्रतिरोध उन्हें रोग निदान के लिए बायोमार्कर के रूप में काम करता है। इस लेख का उद्देश्य यह दिखाना है कि कोशिकाओं में विशिष्ट परिपत्र आरएनए (सिरआरएनए) स्तरों को सटीक रूप से निर्धारित करने के लिए डाइवर्जेंट प्राइमर डिजाइन, आरएनए निष्कर्षण, सीडीएनए संश्लेषण और डीडी-पीसीआर विश्लेषण कैसे किया जाए। अंत में, हम डीडी-पीसीआर का उपयोग करके सीआईआरएनए की सटीक मात्रा का प्रदर्शन करते हैं।

प्रत्येक नमूने में सीआईआरएनए की पूर्ण संख्या निर्यात किए गए डीडी-पीसीआर डेटा से प्राप्त की जा सकती है। वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर विश्लेषण ने विभेदित C2C12 मायोट्यूब (डेटा नहीं दिखाया गया) में CIRCBnc2</e...

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Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR

यह प्रोटोकॉल डाइवर्जेंट प्राइमरों का उपयोग करके कोशिकाओं में परिपत्र आरएनए (सीआईआरएनए) स्तरों की सटीक मात्रा का निर्धारण करने के लिए डिजिटल ड्रॉपलेट पीसीआर (डीडी-पीसीआर) की विस्तृत विधि का वर्णन करता है।

डिजिटल ड्रॉपलेट पीसीआर का उपयोग करके परिपत्र आरएनए का परिमाणीकरण

Digital droplet polymerase chain reaction (dd-PCR) is one of the most sensitive quantification methods; it fractionates the reaction into nearly 20,000 ...

डीडी-पीसीआर लक्ष्य डीएनए या आरएनए के पूर्ण परिमाणीकरण के लिए एक अत्यधिक संवेदनशील और सटीक तरीका है। इसका उपयोग रोग निदान के लिए किया गया है जहां अन्य पारंपरिक तरीके सटीक परिणाम देने में विफल रहते हैं। डीडी-पीसीआर बहुत कम प्रचुर मात्रा में न्यूक्लिक एसिड अणुओं का पता लगाने के लिए सबसे संवेदनशील तकनीक है।मात्रात्मक पीसीआर के विपरीत, डीडी-पीसीआर को परिमाणीकरण के लिए किसी भी हाउसकीपिंग जीन नियंत्रण की आवश्यकता नहीं होती है। इसकी संवेदनशीलता और सटीकता के कारण, डीडी-पीसीआर का उपयोग आणविक निदान और अनुसंधान के लिए एक उपकरण के रूप में किया जा सकता है जिसमें माइक्रो आरएनए और सर्कुलर आरएनए जैसे कम प्रचुर मात्रा में आरएनए अणु शामिल हैं। डीडी-पीसीआर का उपयोग करने से पहले, किसी को आरटी-पीसीआर या आरटी-क्यूपीसीआर करना चाहिए ताकि यह पुष्टि की जा सके कि प्राइमर किसी भी गैर-विशिष्ट पीसीआर प्रवर्धन के बिना अपने लक्ष्य जीन को बढ़ा रहे हैं।शुरू करने के लिए, कुल परिपत्र आरएनए अनुक्रम लंबाई के अंतिम 100 न्यूक्लियोटाइड को परिपत्र आरएनए अनुक्रम के पहले 100 न्यूक्लियोटाइड में जोड़कर लंबाई में 200 न्यूक्लियोटाइड का पीसीआर टेम्पलेट अनुक्रम तैयार करें। प्राइमर 3 वेब टूल द्वारा डिज़ाइन किए गए प्राइमर के लिए टेम्पलेट अनुक्रम का उपयोग करें। आरएनए अलगाव के लिए एक 10 सेंटीमीटर डिश लें जिसमें लगभग 5 मिलियन प्रसार सी 2 सी 12 मायोब्लास्ट कोशिकाएं और एक चार-दिवसीय विभेदित सी 2 सी 12 मायोट्यूब हो।कोशिकाओं को 10 मिलीलीटर 1एक्स पीबीएस के साथ तीन बार धोएं और पिपेट का उपयोग करके पीबीएस को छोड़ दें। एक मिलीलीटर आरएनए अलगाव अभिकर्मक जोड़ें और जोरदार पाइपिंग द्वारा कोशिकाओं को लाइस करें। फिर, 15 सेकंड के लिए क्लोरोफॉर्म और भंवर के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें।ऊपरी जलीय परत के 400 माइक्रोलीटर लें, इसे सिलिका कॉलम पर लोड करें, और कमरे के तापमान पर 12,000 जी पर एक मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें। प्रवाह को एक नई ट्यूब के माध्यम से लें और 100% इथेनॉल के 600 माइक्रोलीटर जोड़ें। चुंबकीय सिलिका मोतियों के 20 माइक्रोलीटर जोड़ें और ट्यूब को थर्मोमिक्सर पर रखें, पांच मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस और 1, 200 आरपीएम पर सेट करें।फिर, ट्यूब को चुंबकीय स्टैंड पर 30 सेकंड के लिए रखें या जब तक समाधान स्पष्ट न हो जाए। चुंबकीय सिलिका मोतियों को 90% इथेनॉल युक्त वॉश बफर के 500 माइक्रोलीटर में पुन: निलंबित करें। ट्यूब को चुंबकीय स्टैंड पर 30 सेकंड के लिए रखने के बाद, मोतियों को चुंबक की ओर बसने दें और पिपेट का उपयोग करके बफर को छोड़ दें।ट्यूब को 50 डिग्री सेल्सियस पर थर्मोमिक्सर पर तीन मिनट के लिए हवा में सुखाएं, ढक्कन खुला रखें। न्यूक्लियस मुक्त पानी के 20 माइक्रोलीटर जोड़ें और मोतियों को फिर से निलंबित करें। स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके मात्रा और गुणवत्ता मूल्यांकन के लिए एक नई ट्यूब में विघटित आरएनए एकत्र करें।स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके आरएनए एकाग्रता को मापें और सीडीएनए संश्लेषण के लिए आरएनए का एक माइक्रोग्राम लें। कुल आरएनए के एक माइक्रोग्राम को डीएनटीपी मिश्रण के एक माइक्रोलीटर, 5एक्स रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस बफर के चार माइक्रोलीटर, 10एक्स रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस रैंडम प्राइमर के दो माइक्रोलीटर, रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस एंजाइम के 0.25 माइक्रोलीटर और आरएनएस इनहिबिटर के 0.5 माइक्रोलीटर के साथ मिलाएं। न्यूक्लियस मुक्त पानी का उपयोग करके 20 माइक्रोलीटर की मात्रा बनाएं।ट्यूब को 10 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर रखें, इसके बाद एक घंटे के लिए 50 डिग्री सेल्सियस रखें। फिर एंजाइम को निष्क्रिय करने के लिए ट्यूब को पांच मिनट के लिए 85 डिग्री सेल्सियस पर रखें। एक नकारात्मक नियंत्रण ट्यूब और गैर-टेम्पलेट नियंत्रण ट्यूबों के साथ 0.2 मिलीलीटर पीसीआर ट्यूब या स्ट्रिप्स में 22 माइक्रोलीटर की पीसीआर प्रतिक्रिया सेट करें।एनटीसी प्रतिक्रिया ट्यूबों को स्थापित करने के लिए डीडी-पीसीआर मास्टर मिक्स के 11 माइक्रोलीटर, एक माइक्रोमोलर एकाग्रता के गोलाकार आरएनए-विशिष्ट फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमर मिश्रण के 5.5 माइक्रोलीटर और न्यूक्लियस मुक्त पानी के 5.5 माइक्रोलीटर जोड़ें। इसी तरह, परीक्षण प्रतिक्रिया ट्यूबों को स्थापित करने के लिए, डीडी-पीसीआर मास्टर मिक्स के 11 माइक्रोलीटर, गोलाकार आरएनए विशिष्ट फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमर मिश्रण के 5.5 माइक्रोलीटर एक माइक्रोमोलर एकाग्रता और सीडीएनए के 5.5 माइक्रोलीटर जोड़ें। ड्रॉपलेट जनरेशन के लिए, 0.2 मिलीलीटर पीसीआर ट्यूबों से पीसीआर मिश्रण के 20 माइक्रोलीटर को ड्रॉपलेट जनरेटर कार्ट्रिज के नमूना कुओं में स्थानांतरित करें।एक पिपेट का उपयोग करके बूंद जनरेटर कारतूस के तेल कुओं में बूंद पीढ़ी के तेल के 70 माइक्रोलीटर सावधानीपूर्वक जोड़ें। ड्रॉपलेट जनरेटर कार्ट्रिज को रबर गैसकेट के साथ कवर करें और इसे ड्रॉपलेट जनरेटर मशीन में रखें, ताकि कारतूस के ड्रॉपलेट कुओं में उत्पन्न नमूना तेल बूंद मिश्रण प्राप्त किया जा सके। पीसीआर प्रवर्धन के लिए, ड्रॉपलेट जनरेटर कार्ट्रिज के ड्रॉपलेट कुओं से नमूना तेल बूंद मिश्रण के 40 माइक्रोलीटर को पिपेट का उपयोग करके 96-वेल पीसीआर प्लेट में स्थानांतरित करें।एल्यूमीनियम पन्नी सीलर के साथ 96-वेल पीसीआर प्लेट को सील करें। इसे प्लेट सीलर मशीन ब्लॉक में रखें, 180 डिग्री सेल्सियस पर प्रीहीट करें, और पीसीआर प्लेट को सील करने के लिए सील पर क्लिक करें। फिर, प्लेट को डीडी-पीसीआर थर्मल साइकिलर में रखें और ढक्कन तापमान को 105 डिग्री सेल्सियस और रैंप दर को दो डिग्री सेल्सियस प्रति सेकंड पर सेट करें।एक बार पीसीआर खत्म हो जाने के बाद, बूंदों की गिनती के लिए प्लेट धारक के साथ डीडी-पीसीआर ड्रॉपलेट काउंटर मशीन पर प्लेट रखें। ड्रॉपलेट विश्लेषण सॉफ्टवेयर खोलें और नमूना जानकारी का इनपुट देकर रन सेट करें। ड्रॉपलेट रीडिंग के पूरा होने के बाद डेटा का विश्लेषण करने के लिए विश्लेषण बटन पर क्लिक करें।फिर, सकारात्मक और नकारात्मक बूंदों को देखने के लिए 1 डी आयाम बटन पर क्लिक करें। नकारात्मक बूंदों से सकारात्मक बूंदों को अलग करने के लिए, एक ही लक्ष्य के साथ सभी नमूनों के लिए एक सामान्य दहलीज रेखा रखें। परिपत्र RNA गणना डेटा को csv फ़ाइल के रूप में निर्यात करने के लिए निर्यात बटन क्लिक करें.निर्यात किए गए डेटा प्रत्येक नमूने में मौजूद परिपत्र आरएनए की संख्या दिखाते हैं। प्रत्येक प्रतिक्रिया में उपयोग किए जाने वाले सीडीएनए की कुल मात्रा पर विचार करके आरएनए के प्रति नैनोग्राम प्रत्येक नमूने में परिपत्र आरएनए की संख्या की मैन्युअल रूप से गणना करें। क्वांटासॉफ्ट सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डेटा विश्लेषण यहां दिखाया गया है।एमटी 1 को छोड़कर सभी नमूनों में 12,000 से अधिक बूंदों की गिनती दिखाई दी। चूंकि एमटी 1 में कुल बूंद गिनती कम थी, इसलिए इस नमूने को अंतिम डेटा विश्लेषण के लिए नहीं माना गया था। दिलचस्प बात यह है कि मायोब्लास्ट कोशिकाओं की तुलना में चार दिन की विभेदित मायोट्यूब स्थिति में सिरिक बी और सी 2 के अभिव्यक्ति पैटर्न में स्पष्ट अंतर था।कॉपी संख्या के संदर्भ में सीआईआरसी बी और सी 2 बहुतायत के विश्लेषण ने संकेत दिया कि सी 2 सी 12 मायोब्लास्ट्स की तीन प्रतिकृतियों में आरएनए के प्रति नैनोग्राम 76.8, 67 और 46 प्रतियां थीं, जबकि दो मायोट्यूब नमूनों में आरएनए के प्रति नैनोग्राम 558 और 610 प्रतियां थीं। बार ग्राफ में डेटा दो से तीन जैविक प्रतिकृतियों के औसत प्लस माइनस मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करता है। डीडीपीसीआर लक्ष्य परिपत्र आरएनए की सटीक अंतर अभिव्यक्ति को मापने के लिए सबसे उन्नत तरीकों में से एक है।यह विधि आने वाले वर्ष में परिपत्र आरएनए अनुसंधान और नैदानिक उद्योगों में तेजी लाने के लिए एक आवश्यक उपकरण होगी।

Research

JoVE Journal

Biology

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Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

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Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral ...

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

सार्स-सीओवी-2 का पता लगाने और परिमाणीकरण के लिए दो-चरण रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन ड्रॉपलेट डिजिटल पीसीआर प्रोटोकॉल

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...