Name: quantification of circular rnas using digital droplet pcr
Uploaded: 2022-09-16T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato da finanziamenti intramurali dell'Institute of Life Sciences, dalla sovvenzione di ricerca DBT (BT / PR27622 / MED / 30/1961 / 2018) e dalla Wellcome Trust / DBT India Alliance Fellowship [IA / I / 18/2 / 504017] assegnata ad Amaresh C. Panda. Ringraziamo gli altri membri del laboratorio per aver riletto l'articolo.

L'RNA è sensibile alle RNasi; pertanto, tutti i reagenti, gli strumenti e gli spazi di lavoro devono essere privi di RNasi e maneggiati con cura.
1. Disegno di primer divergente per circRNA (vedi Figura 1)
<ol><li>Recuperare la sequenza matura dai dati di annotazione del circRNA utilizzando BEDTools o dal browser del genoma UCSC unendo la sequenza esone/introne presente tra le coordinate di giunzione retrosplicare<sup class="xr...

<ol>
	<li>Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+the+predominant+transcript+isoform+from+hundreds+of+human+genes+in+diverse+cell+types.">Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types.</a> PLoS One. 7 (2), 30733 (2012).</li><li>Chen, L. L., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+circRNA+biogenesis.">Regulation of circRNA biogenesis.</a> RNA Biology. 12 (4), 381-388 (2015).</li><li>Kristensen, L. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+role+of+circular+RNA-protein+interactions.">Emerging role of circular RNA-protein interactions.</a> Non-Coding RNA. 7 (3), 48 (2021).</li><li>Verduci, L., Tarcitano, E., Strano, S., Yarden, Y., Blandino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CircRNAs:+Role+in+human+diseases+and+potential+use+as+biomarkers.">CircRNAs: Role in human diseases and potential use as biomarkers.</a> Cell Death &amp; Disease. 12 (5), 468 (2021).</li><li>Pandey, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+analysis+of+circular+RNAs.">Methods for analysis of circular RNAs.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 11 (1), 1566 (2020).</li><li>Das, A., Das, D., Panda, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+circular+RNAs+by+PCR.">Validation of circular RNAs by PCR.</a> PCR Primer Design. Methods in Molecular Biology. 2392, 103-114 (2022).</li><li>Jeck, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+abundant,+conserved,+and+associated+with+ALU+repeats.">Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats.</a> RNA. 19 (2), 141-157 (2013).</li><li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+droplet+digital+polymerase+chain+reaction+format+for+DNA+copy+number+quantification.">Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification.</a> Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).</li><li>Hayden, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+droplet+digital+PCR+to+real-time+PCR+for+quantitative+detection+of+cytomegalovirus.">Comparison of droplet digital PCR to real-time PCR for quantitative detection of cytomegalovirus.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (2), 540-546 (2013).</li><li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets:+From+variable+nonsense+to+publication+quality+data.">Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: From variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7, 2409 (2017).</li><li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number.">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li><li>Ishak, A., AlRawashdeh, M. M., Esagian, S. M., Nikas, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic,+prognostic,+and+therapeutic+value+of+droplet+digital+PCR+(ddPCR)+in+COVID-19+patients:+A+systematic+review.">Diagnostic, prognostic, and therapeutic value of droplet digital PCR (ddPCR) in COVID-19 patients: A systematic review.</a> Journal of Clinical Medicine. 10 (23), 5712 (2021).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+droplet+digital+PCR+to+detect+the+pathogens+of+infectious+diseases.">Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases.</a> Bioscience Reports. 38 (6), (2018).</li><li>Lee, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+UCSC+genome+browser+database:+2022+update.">The UCSC genome browser database: 2022 update.</a> Nucleic Acids Research. 50, 1115-1122 (2022).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+A+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li><li>Untergasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer3--new+capabilities+and+interfaces.">Primer3--new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Research. 40 (15), 115 (2012).</li><li>Das, A., Das, D., Das, A., Panda, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quick+and+cost-effective+method+for+DNA-free+total+RNA+isolation+using+magnetic+silica+beads.">A quick and cost-effective method for DNA-free total RNA isolation using magnetic silica beads.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Oberacker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Synthesis+of+Functionalized+Paramagnetic+Beads+for+Nucleic+Acid+Purification+and+Manipulation.">Simple Synthesis of Functionalized Paramagnetic Beads for Nucleic Acid Purification and Manipulation.</a> Bio-protocol. 9 (20), 3394 (2019).</li><li>Ra&#269;ki, N., Dreo, T., Gutierrez-Aguirre, I., Blejec, A., Ravnikar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+transcriptase+droplet+digital+PCR+shows+high+resilience+to+PCR+inhibitors+from+plant,+soil+and+water+samples.">Reverse transcriptase droplet digital PCR shows high resilience to PCR inhibitors from plant, soil and water samples.</a> Plant Methods. 10 (1), 42 (2014).</li><li>Taylor, S. C., Carbonneau, J., Shelton, D. N., Boivin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+droplet+digital+PCR+from+RNA+and+DNA+extracts+with+direct+comparison+to+RT-qPCR:+Clinical+implications+for+quantification+of+Oseltamivir-resistant+subpopulations.">Optimization of droplet digital PCR from RNA and DNA extracts with direct comparison to RT-qPCR: Clinical implications for quantification of Oseltamivir-resistant subpopulations.</a> Journal of Virological Methods. 224, 58-66 (2015).</li></ol>

La ricerca sul CircRNA è cresciuta nell'ultimo decennio con la scoperta di tecnologie di sequenziamento ad alto rendimento. Di conseguenza, è stata considerata una potenziale molecola per le future terapie a RNA. Inoltre, è noto per agire come biomarcatore in diverse malattie, tra cui il cancro e le malattie cardiovascolari 4,8. Tuttavia, l'identificazione del circRNA è difficile a causa della sua bassa abbondanza e ha solo una specifica sequenza di giunzione...

I recenti progressi nelle tecnologie di sequenziamento dell'RNA e nuovi algoritmi computazionali hanno scoperto un nuovo membro della crescente famiglia di RNA non codificanti, chiamato RNA circolare (circRNA)1. Come suggerisce il nome, i circRNA sono una famiglia di molecole di RNA a singolo filamento senza estremità libere. Sono formati da splicing testa-coda non canonico chiamato back-splicing, in cui il sito accettore di giunzione a monte si unisce covalentemente con il sito donatore di giunzione a valle per formare un cerchio stabile di RNA 1,2. Questo processo potrebbe essere mediato da diversi fattori, tra cui elementi ripetitivi invertiti di Alu presenti a monte e a valle degli esoni circolarizzati o può essere mediato da alcuni fattori di splicing o proteine leganti l'RNA (RBP)2,3. Gli RNA circolari generati esclusivamente dalla sequenza esonica o intronica sono classificati come circRNA esonico e RNA intronici circolari o ci-RNA, mentre alcuni circRNA esonici trattengono l'introne e sono chiamati circRNA esone-introne (EIcircRNAs)3,4. Le funzioni dei circRNA sono molteplici, tra cui la spugnatura di miRNA e/o RBP, la regolazione della trascrizione e la regolazione della funzione cellulare traducendo in peptidi 3,5,6,7. Diversi rapporti hanno evidenziato il significato dei circRNA in varie malattie e processi fisiologici8. Inoltre, i modelli di espressione tessuto-specifici e la resistenza alla digestione esonucleasica lo rendono un biomarcatore funzionale per la diagnosi della malattia e può anche essere utilizzato come bersaglio terapeutico adatto8. Considerando la sua importanza nella regolazione della salute e delle malattie, la quantificazione accurata dell'espressione del circRNA è la necessità del momento.
Sono stati sviluppati diversi metodi biochimici per quantificare i circRNA in campioni biologici9. Uno dei metodi più convenienti e ampiamente accettati per la quantificazione del circRNA è la trascrizione inversa seguita dalla reazione a catena della polimerasi quantitativa (RT-qPCR) utilizzando coppie di primer divergenti10. Tuttavia, la maggior parte dei circRNA sono in bassa abbondanza rispetto agli mRNA lineari, il che rende difficile quantificarli11. Per superare questo problema, abbiamo cercato di utilizzare la PCR digitale a goccia (dd-PCR) per quantificare accuratamente il numero di circRNA in un determinato campione. La dd-PCR è una tecnologia PCR avanzata che segue il principio della microfluidica; genera più goccioline acquose nell'olio e la PCR si verifica in ogni goccia come reazione individuale12. La reazione avviene nelle singole goccioline e viene analizzata utilizzando un lettore di goccioline, che fornisce il numero di goccioline positive o negative per il gene di interesse12. È la tecnica più sensibile per quantificare con precisione un gene di interesse, anche se c'è solo una singola copia in un dato campione. La diminuzione della sensibilità verso gli inibitori, la migliore precisione e l'omissione del gene di riferimento per la quantificazione lo rendono più vantaggioso rispetto alla qPCR convenzionale13,14,15. È stato ampiamente utilizzato come strumento di ricerca e diagnostica per la quantificazione assoluta di un gene di interesse16,17. Qui, descriviamo il protocollo dd-PCR dettagliato per la quantificazione del circRNA nella differenziazione dei miotubi C2C12 di topo e dei mioblasti C2C12 di topo proliferanti utilizzando primer divergenti.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >1.5 ml microcentifuge tube</td>
			<td >Tarson</td>
			<td >500010</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.2 ml tube strips with cap</td>
			<td >Tarson</td>
			<td >610020, 510073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filter Tips</td>
			<td >Tarson</td>
			<td >528104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >10977023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell scrapper</td>
			<td >HiMedia</td>
			<td >TCP223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chloroform</td>
			<td >SRL</td>
			<td >96764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA diluent</td>
			<td >HiMedia</td>
			<td >MB228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Random primers</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >48190011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >dNTP set</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >R0181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Murine RNase inhibitor</td>
			<td >NEB</td>
			<td >M0314S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Maxima reverse transcriptase</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >EP0743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 dd-PCR Evagreen Supermix</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Droplet generation oil for Evagreen</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1814040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DG8 Cartridges and Gaskets</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DG8 Cartridge holder</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1863051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 Droplet Generator</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ddPCR 96-Well Plates</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >12001925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PX1 PCR Plate Sealer</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1814000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C1000 Touch Thermal Cycler with 96&#8211;Deep Well Reaction Module</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1851197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 Droplet Reader</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Quantasoft Software</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silica column</td>
			<td >Umbrella Life Science</td>
			<td >38220090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UCSC Genome Browser</td>
			<td ></td>
			<td >https://genome.ucsc.edu/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primer 3</td>
			<td ></td>
			<td >https://primer3.ut.ee/</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of circular rnas using digital droplet pcr

La reazione a catena della polimerasi a goccia digitale (dd-PCR) è uno dei metodi di quantificazione più sensibili; fraziona la reazione in quasi 20.000 goccioline d'acqua in olio e la PCR si verifica nelle singole goccioline. La dd-PCR presenta diversi vantaggi rispetto alla qPCR convenzionale in tempo reale, tra cui una maggiore precisione nel rilevare bersagli a bassa abbondanza, omettendo geni di riferimento per la quantificazione, eliminando le repliche tecniche per i campioni e mostrando un'elevata resilienza agli inibitori nei campioni. Recentemente, la dd-PCR è diventata uno dei metodi più popolari per quantificare accuratamente il DNA o l'RNA bersaglio per l'analisi e la diagnostica dell'espressione genica. Gli RNA circolari (circRNA) sono una grande famiglia di molecole di RNA recentemente scoperte covalentemente chiuse prive di estremità 5' e 3'. È stato dimostrato che regolano l'espressione genica agendo come spugne per le proteine leganti l'RNA e i microRNA. Inoltre, i circRNA sono secreti nei fluidi corporei e la loro resistenza alle esonucleasi li rende utili come biomarcatori per la diagnosi della malattia. Questo articolo ha lo scopo di mostrare come eseguire la progettazione di primer divergenti, l'estrazione dell'RNA, la sintesi del cDNA e l'analisi dd-PCR per quantificare accuratamente specifici livelli di RNA circolare (circRNA) nelle cellule. In conclusione, dimostriamo la quantificazione precisa dei circRNA utilizzando dd-PCR.

Il numero assoluto di circRNA in ciascun campione può essere derivato dai dati dd-PCR esportati. L'analisi PCR quantitativa in tempo reale ha suggerito l'espressione differenziale di circBnc2 nei miotubi C2C12 differenziati (dati non mostrati). Qui, abbiamo voluto verificare il numero assoluto di copie di circBnc2 nei mioblasti e nei miotubi C2C12 proliferanti. Poiché l'espressione di circBnc2 viene confrontata in due condizioni, è molto importante elaborare tutti i campioni per l'isolamento...

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Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR

Questo protocollo descrive il metodo dettagliato della PCR digitale a goccia (dd-PCR) per una quantificazione precisa dei livelli di RNA circolare (circRNA) nelle cellule utilizzando primer divergenti.

Quantificazione di RNA circolari mediante Digital Droplet PCR

Digital droplet polymerase chain reaction (dd-PCR) is one of the most sensitive quantification methods; it fractionates the reaction into nearly 20,000 ...

dd-PCR è un metodo altamente sensibile e accurato per la quantificazione assoluta del DNA o RNA bersaglio. È stato utilizzato per la diagnosi di malattie in cui altri metodi convenzionali non riescono a dare risultati accurati. dd-PCR è la tecnica più sensibile per rilevare molecole di acido nucleico molto basse e abbondanti.A differenza della PCR quantitativa, la dd-PCR non richiede alcun controllo genico per la quantificazione. Grazie alla sua sensibilità e accuratezza, la dd-PCR può essere utilizzata come strumento per la diagnostica molecolare e la ricerca che coinvolge molecole di RNA a bassa abbondanza come micro RNA e RNA circolari. Prima di utilizzare dd-PCR, si dovrebbe eseguire RT-PCR o RT-qPCR per confermare che i primer stanno amplificando i loro geni bersaglio senza alcuna amplificazione PCR non specifica.Per iniziare, preparare una sequenza modello di PCR di 200 nucleotidi di lunghezza unendo gli ultimi 100 nucleotidi della lunghezza totale della sequenza di RNA circolare ai primi 100 nucleotidi della sequenza di RNA circolare. Utilizzare la sequenza di modelli per primer, progettata dallo strumento web Primer 3. Prendi un piatto di 10 centimetri contenente circa 5 milioni di cellule di mioblasti C2C12 proliferanti e un miotubo C2C12 differenziato di quattro giorni per l'isolamento dell'RNA.Lavare le celle con 10 millilitri di 1X PBS tre volte e scartare il PBS usando una pipetta. Aggiungere un millilitro di reagente di isolamento dell'RNA e lisare le cellule mediante pipettaggio vigoroso. Quindi, aggiungere 200 microlitri di cloroformio e vortice per 15 secondi.Centrifugare il tubo a quattro gradi Celsius per 10 minuti a 12.000 G.Prendere 400 microlitri dello strato acquoso superiore, caricarlo su una colonna di silice e centrifugare per un minuto a 12.000 G a temperatura ambiente. Prendi il flusso attraverso un nuovo tubo e aggiungi 600 microlitri di etanolo al 100%. Aggiungere 20 microlitri di perle di silice magnetica e posizionare il tubo su un termomixer, impostato a 25 gradi Celsius e 1.200 RPM per cinque minuti.Quindi, posizionare il tubo su un supporto magnetico per 30 secondi o fino a quando la soluzione diventa chiara. Risospendere le sfere di silice magnetica in 500 microlitri di tampone di lavaggio contenente il 90% di etanolo. Dopo aver posizionato il tubo sul supporto magnetico per 30 secondi, lasciare che le perline si depositino verso il magnete e scartare il tampone usando una pipetta.Asciugare all'aria il tubo a 50 gradi Celsius per tre minuti su un termomiscelatore, mantenendo il coperchio aperto. Aggiungere 20 microlitri di acqua priva di nucleasi e risospendere le perle. Raccogliere l'RNA disciolto in una nuova provetta per la valutazione della quantità e della qualità utilizzando uno spettrofotometro.Misurare la concentrazione di RNA utilizzando uno spettrofotometro e prendere un microgrammo di RNA per la sintesi del cDNA. Mescolare un microgrammo di RNA totale con un microlitro di miscela dNTP, quattro microlitri di tampone 5X di trascrittasi inversa, due microlitri di primer casuale 10X trascrittasi inversa, 0,25 microlitri di enzima trascrittasi inversa e 0,5 microlitri di inibitore della RNasi. Portare il volume a 20 microlitri utilizzando acqua priva di nucleasi.Posizionare il tubo a 25 gradi Celsius per 10 minuti, seguito da 50 gradi Celsius per un'ora. Quindi posizionare il tubo a 85 gradi Celsius per cinque minuti per inattivare l'enzima. Impostare la reazione PCR di 22 microlitri in provette o strisce PCR da 0,2 millilitri, insieme a un tubo di controllo negativo e tubi di controllo non modello.Aggiungere 11 microlitri di miscela master dd-PCR, 5,5 microlitri di miscela di primer circolare RNA-specifica per avanti e inverso di una concentrazione micromolare e 5,5 microlitri di acqua priva di nucleasi per impostare i tubi di reazione NTC. Allo stesso modo, per impostare le provette di reazione, aggiungere 11 microlitri di miscela master dd-PCR, 5,5 microlitri di miscela di primer circolare specifica per RNA diretta e inversa di una concentrazione micromolare e 5,5 microlitri di cDNA. Per la generazione di gocce, trasferire 20 microlitri della miscela PCR da provette PCR da 0,2 millilitri ai pozzetti del campione della cartuccia del generatore di gocce.Aggiungere 70 microlitri di olio per la generazione di goccioline ai pozzetti dell'olio della cartuccia del generatore di goccioline con attenzione, utilizzando una pipetta. Coprire la cartuccia del generatore di gocce con una guarnizione di gomma e posizionarla nella macchina del generatore di gocce per ottenere la miscela di gocce d'olio campione, generata nei pozzetti delle gocce della cartuccia. Per l'amplificazione PCR, trasferire 40 microlitri della miscela di gocce d'olio campione dai pozzetti delle goccioline della cartuccia del generatore di gocce a una piastra PCR a 96 pozzetti utilizzando una pipetta.Sigillare la piastra PCR a 96 pozzetti con il sigillante in alluminio. Posizionarlo nel blocco macchina sigillatrice a piastre, preriscaldato a 180 gradi Celsius, e fare clic sul sigillo per sigillare la piastra PCR. Quindi, posizionare la piastra nel termociclatore dd-PCR e impostare la temperatura del coperchio su 105 gradi Celsius e una velocità di rampa su due gradi Celsius al secondo.Una volta terminata la PCR, posizionare la piastra sulla macchina contagocce dd-PCR con il supporto della piastra nella posizione corretta per il conteggio delle goccioline. Aprire il software di analisi delle gocce e impostare l'esecuzione fornendo l'input delle informazioni di esempio. Fare clic sul pulsante Analizza per analizzare i dati dopo il completamento della lettura del droplet.Quindi, fai clic sul pulsante Ampiezza 1D per visualizzare le goccioline positive e negative. Per separare le goccioline positive dalle goccioline negative, inserire una linea di soglia comune per tutti i campioni con lo stesso target. Fare clic sul pulsante di esportazione per esportare i dati circolari RNA conteggia come file csv.I dati esportati mostrano il numero di RNA circolari presenti in ciascun campione. Calcolare manualmente il numero di RNA circolari in ciascun campione per nanogrammo di RNA considerando la quantità totale di cDNA utilizzata in ciascuna reazione. L'analisi dei dati con il software QuantaSoft è mostrata qui.Tutti i campioni tranne MT1 hanno mostrato più di 12.000 conteggi di goccioline. Poiché il conteggio totale delle goccioline era basso in MT1, questo campione non è stato considerato per l'analisi finale dei dati. È interessante notare che c'era una chiara differenza nel modello di espressione di Circ B e C2 nella condizione differenziata del miotubo a quattro giorni rispetto alle cellule dei mioblasti.L'analisi dell'abbondanza di Circ B e C2 in termini di numero di copie, ha indicato che le tre repliche dei mioblasti C2C12 avevano 76,8, 67 e 46 copie per nanogrammo di RNA, mentre i due campioni di miotubo avevano 558 e 610 copie per nanogrammo di RNA. I dati nel grafico a barre rappresentano la deviazione standard media più meno di due o tre repliche biologiche. ddPCR è uno dei metodi più avanzati per misurare l'accurata espressione differenziale dell'RNA circolare bersaglio.Questo metodo sarà uno strumento essenziale per accelerare la ricerca sull'RNA circolare e le industrie diagnostiche nel prossimo anno.

Research

JoVE Journal

Biology

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Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

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Rapido PCR termici utilizzando microscala convezione termica

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Impiegando digitale Droplet PCR per identificare mutazioni BRAF V600E in inclusi in paraffina fissati in formalina Linee cella di riferimento standard

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