Name: quantification of circular rnas using digital droplet pcr
Uploaded: 2022-09-16T14:50:00
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この研究は、生命科学研究所からの壁内資金、DBT研究助成金(BT / PR27622 / MED/30/1961/2018)、およびウェルカムトラスト/ DBTインドアライアンスフェローシップ[IA / I / 18/2/504017]によってサポートされましたアマレシュC.パンダに授与されました。論文を校正してくださった他の研究室メンバーに感謝します。

RNAはRNaseに敏感です。したがって、すべての試薬、機器、およびワークスペースはRNaseを含まず、取り扱いには注意が必要です。
1. circRNAのダイバージェントプライマー設計( 図1参照)
<ol><li>BEDToolsを使用してcircRNAアノテーションデータから、またはバックスプライス接合座標18,19?...

<ol>
	<li>Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+the+predominant+transcript+isoform+from+hundreds+of+human+genes+in+diverse+cell+types.">Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types.</a> PLoS One. 7 (2), 30733 (2012).</li><li>Chen, L. L., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+circRNA+biogenesis.">Regulation of circRNA biogenesis.</a> RNA Biology. 12 (4), 381-388 (2015).</li><li>Kristensen, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biogenesis,+biology+and+characterization+of+circular+RNAs.">The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs.</a> Nature Reviews Genetics. 20 (11), 675-691 (2019).</li><li>Chen, X., Zhou, M., Yant, L., Huang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNA+in+disease:+Basic+properties+and+biomedical+relevance.">Circular RNA in disease: Basic properties and biomedical relevance.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. , (2022).</li><li>Sinha, T., Panigrahi, C., Das, D., Chandra Panda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNA+translation,+a+path+to+hidden+proteome.">Circular RNA translation, a path to hidden proteome.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 13 (1), 1685 (2022).</li><li>Panda, A. C., Xiao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+Act+as+miRNA+Sponges.">Circular RNAs Act as miRNA Sponges.</a> Circular RNAs: Biogenesis and Functions. , 67-79 (2018).</li><li>Das, A., Sinha, T., Shyamal, S., Panda, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+role+of+circular+RNA-protein+interactions.">Emerging role of circular RNA-protein interactions.</a> Non-Coding RNA. 7 (3), 48 (2021).</li><li>Verduci, L., Tarcitano, E., Strano, S., Yarden, Y., Blandino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CircRNAs:+Role+in+human+diseases+and+potential+use+as+biomarkers.">CircRNAs: Role in human diseases and potential use as biomarkers.</a> Cell Death &amp; Disease. 12 (5), 468 (2021).</li><li>Pandey, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+analysis+of+circular+RNAs.">Methods for analysis of circular RNAs.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 11 (1), 1566 (2020).</li><li>Das, A., Das, D., Panda, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+circular+RNAs+by+PCR.">Validation of circular RNAs by PCR.</a> PCR Primer Design. Methods in Molecular Biology. 2392, 103-114 (2022).</li><li>Jeck, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+abundant,+conserved,+and+associated+with+ALU+repeats.">Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats.</a> RNA. 19 (2), 141-157 (2013).</li><li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+droplet+digital+polymerase+chain+reaction+format+for+DNA+copy+number+quantification.">Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification.</a> Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).</li><li>Hayden, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+droplet+digital+PCR+to+real-time+PCR+for+quantitative+detection+of+cytomegalovirus.">Comparison of droplet digital PCR to real-time PCR for quantitative detection of cytomegalovirus.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (2), 540-546 (2013).</li><li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets:+From+variable+nonsense+to+publication+quality+data.">Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: From variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7, 2409 (2017).</li><li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number.">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li><li>Ishak, A., AlRawashdeh, M. M., Esagian, S. M., Nikas, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic,+prognostic,+and+therapeutic+value+of+droplet+digital+PCR+(ddPCR)+in+COVID-19+patients:+A+systematic+review.">Diagnostic, prognostic, and therapeutic value of droplet digital PCR (ddPCR) in COVID-19 patients: A systematic review.</a> Journal of Clinical Medicine. 10 (23), 5712 (2021).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+droplet+digital+PCR+to+detect+the+pathogens+of+infectious+diseases.">Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases.</a> Bioscience Reports. 38 (6), (2018).</li><li>Lee, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+UCSC+genome+browser+database:+2022+update.">The UCSC genome browser database: 2022 update.</a> Nucleic Acids Research. 50, 1115-1122 (2022).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+A+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li><li>Untergasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer3--new+capabilities+and+interfaces.">Primer3--new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Research. 40 (15), 115 (2012).</li><li>Das, A., Das, D., Das, A., Panda, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quick+and+cost-effective+method+for+DNA-free+total+RNA+isolation+using+magnetic+silica+beads.">A quick and cost-effective method for DNA-free total RNA isolation using magnetic silica beads.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Oberacker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Synthesis+of+Functionalized+Paramagnetic+Beads+for+Nucleic+Acid+Purification+and+Manipulation.">Simple Synthesis of Functionalized Paramagnetic Beads for Nucleic Acid Purification and Manipulation.</a> Bio-protocol. 9 (20), 3394 (2019).</li><li>Ra&#269;ki, N., Dreo, T., Gutierrez-Aguirre, I., Blejec, A., Ravnikar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+transcriptase+droplet+digital+PCR+shows+high+resilience+to+PCR+inhibitors+from+plant,+soil+and+water+samples.">Reverse transcriptase droplet digital PCR shows high resilience to PCR inhibitors from plant, soil and water samples.</a> Plant Methods. 10 (1), 42 (2014).</li><li>Taylor, S. C., Carbonneau, J., Shelton, D. N., Boivin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+droplet+digital+PCR+from+RNA+and+DNA+extracts+with+direct+comparison+to+RT-qPCR:+Clinical+implications+for+quantification+of+Oseltamivir-resistant+subpopulations.">Optimization of droplet digital PCR from RNA and DNA extracts with direct comparison to RT-qPCR: Clinical implications for quantification of Oseltamivir-resistant subpopulations.</a> Journal of Virological Methods. 224, 58-66 (2015).</li></ol>

CircRNAの研究は、ハイスループットシーケンシング技術の発見により、過去10年間で成長しました。その結果、将来のRNA治療薬の潜在的な分子と見なされています。さらに、癌や心血管疾患を含むいくつかの疾患においてバイオマーカーとして作用することが知られている4,8。しかしながら、circRNAの同定は、その存在量が少なく、親mRNA...

RNAシーケンシング技術と新しい計算アルゴリズムの最近の進歩により、環状RNA(circRNA)1と呼ばれるノンコーディングRNAファミリーの新しいメンバーが発見されました。名前が示すように、circRNAは自由末端を持たない一本鎖RNA分子のファミリーです。これらは、バックスプライシングと呼ばれる非標準的なヘッドツーテールスプライシングによって形成され、上流のスプライスアクセプター部位が下流のスプライスドナー部位と共有結合して安定したRNAサークルを形成します1,2。このプロセスは、環状エクソンの上流および下流に存在する逆Alu反復要素を含むいくつかの要因によって媒介されるか、またはいくつかのスプライシング因子またはRNA結合タンパク質(RBP)によって媒介される可能性があります2,3。エキソン配列またはイントロニック配列のみから生成された環状RNAは、エキソンcircRNAおよび環状イントロニックRNAまたはci-RNAに分類されますが、一部のエキソンcircRNAはイントロンを保持し、エクソン-イントロンcircRNA(EIcircRNA)と呼ばれます3,4。circRNAの機能は、miRNAおよび/またはRBPのスポンジング、転写の調節、ペプチドへの翻訳による細胞機能の調節など、多面的です3,5,6,7。いくつかの報告は、さまざまな疾患や生理学的プロセスにおけるcircRNAの重要性を強調しています8。さらに、組織特異的な発現パターンとエキソヌクレアーゼ消化に対する耐性は、疾患診断のための機能的なバイオマーカーとなり、適切な治療標的としても使用することができます8。健康と病気の調節におけるその重要性を考えると、circRNA発現の正確な定量は時間の必要性です。
生物学的サンプル中のcircRNAを定量するために、いくつかの生化学的方法が開発されている9。circRNA定量のための最も便利で広く受け入れられている方法の1つは、逆転写とそれに続くダイバージェントプライマーペア10を使用した定量的ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)です。しかし、circRNAの大部分は直鎖状mRNAに比べて存在量が少ないため、定量することは困難です11。この問題を克服するために、デジタルドロップレットPCR(dd-PCR)を使用して、特定のサンプル中のcircRNAの数を正確に定量することを目指しました。dd-PCRは、マイクロフルイディクスの原理に従った高度なPCR技術です。油中に複数の水性液滴を生成し、個々の反応12として各液滴中でPCRが起こる。反応は個々の液滴で起こり、液滴リーダーを使用して分析され、目的の遺伝子に対する正または負の液滴の数が得られます12。これは、特定のサンプルにコピーが1つしかない場合でも、目的の遺伝子を正確に定量するための最も感度の高い手法です。阻害剤に対する感度の低下、精度の向上、定量のための参照遺伝子の省略により、従来のqPCR13,14,15よりも有利になります。これは、目的の遺伝子の絶対定量のための研究および診断ツールとして広く使用されています16,17。ここでは、ダイバージェントプライマーを用いたマウスC2C12筋細胞および増殖マウスC2C12筋芽細胞の分化におけるcircRNA定量のための詳細なdd-PCRプロトコルについて説明します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >1.5 ml microcentifuge tube</td>
			<td >Tarson</td>
			<td >500010</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.2 ml tube strips with cap</td>
			<td >Tarson</td>
			<td >610020, 510073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filter Tips</td>
			<td >Tarson</td>
			<td >528104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >10977023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell scrapper</td>
			<td >HiMedia</td>
			<td >TCP223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chloroform</td>
			<td >SRL</td>
			<td >96764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA diluent</td>
			<td >HiMedia</td>
			<td >MB228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Random primers</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >48190011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >dNTP set</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >R0181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Murine RNase inhibitor</td>
			<td >NEB</td>
			<td >M0314S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Maxima reverse transcriptase</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >EP0743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 dd-PCR Evagreen Supermix</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Droplet generation oil for Evagreen</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1814040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DG8 Cartridges and Gaskets</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DG8 Cartridge holder</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1863051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 Droplet Generator</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ddPCR 96-Well Plates</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >12001925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PX1 PCR Plate Sealer</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1814000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C1000 Touch Thermal Cycler with 96&#8211;Deep Well Reaction Module</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1851197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 Droplet Reader</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Quantasoft Software</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silica column</td>
			<td >Umbrella Life Science</td>
			<td >38220090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UCSC Genome Browser</td>
			<td ></td>
			<td >https://genome.ucsc.edu/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primer 3</td>
			<td ></td>
			<td >https://primer3.ut.ee/</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of circular rnas using digital droplet pcr

デジタル液滴ポリメラーゼ連鎖反応(dd-PCR)は、最も感度の高い定量方法の1つです。反応を約20,000個の油中水滴に分画し、PCRは個々の液滴で行われます。dd-PCRは、低存在量のターゲットの検出精度の向上、定量のための参照遺伝子の省略、サンプルの技術的な複製の排除、サンプル中の阻害剤に対する高い回復力を示すなど、従来のリアルタイムqPCRに比べていくつかの利点があります。最近、dd-PCRは、遺伝子発現解析および診断のために標的DNAまたはRNAを正確に定量するための最も一般的な方法の1つになっています。環状RNA(circRNA)は、最近発見された共有結合的に閉じたRNA分子の大きなファミリーで、5'末端と3'末端を欠いています。それらは、RNA結合タンパク質およびマイクロRNAのスポンジとして作用することによって遺伝子発現を調節することが示されている。さらに、circRNAは体液中に分泌され、エキソヌクレアーゼに対する耐性があるため、疾患診断のバイオマーカーとして機能します。本稿では、ダイバージェントプライマー設計、RNA抽出、cDNA合成、およびdd-PCR分析を実行して、細胞内の特定の環状RNA(circRNA)レベルを正確に定量する方法を示すことを目的としています。結論として、dd-PCRを用いたcircRNAの正確な定量を実証する。

各サンプル中のcircRNAの絶対数は、エクスポートされたdd-PCRデータから導き出すことができます。リアルタイム定量PCR分析は、分化したC2C12筋管細胞における circBnc2 の差次的発現を示唆した(データは示さず)。ここでは、増殖するC2C12筋芽細胞および筋管における circBnc2 の絶対コピー数を確認したいと考えました。 circBnc2 の発現は2つの条件で比較されるため、同じ試薬と?...

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Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR

このプロトコルでは、ダイバージェントプライマーを使用して細胞内の環状RNA(circRNA)レベルを正確に定量するためのデジタルドロップレットPCR(dd-PCR)の詳細な方法について説明します。

デジタル液滴PCRを用いた環状RNAの定量

Digital droplet polymerase chain reaction (dd-PCR) is one of the most sensitive quantification methods; it fractionates the reaction into nearly 20,000 ...

dd-PCRは、標的DNAまたはRNAの絶対定量のための高感度で正確な方法です。これは、他の従来の方法では正確な結果が得られない病気の診断に使用されてきました。dd-PCRは、非常に少ない存在量の核酸分子を検出するための最も感度の高い技術です。定量的PCRとは異なり、dd-PCRは定量のためにハウスキーピング遺伝子制御を必要としません。dd-PCRは、その感度と精度により、マイクロRNAや環状RNAなどの低存在量のRNA分子を含む分子診断および研究のツールとして使用できます。dd-PCRを使用する前に、RT-PCRまたはRT-qPCRを実行して、プライマーが非特異的PCR増幅なしで標的遺伝子を増幅していることを確認する必要があります。まず、環状RNA配列長の最後の100ヌクレオチドを環状RNA配列の最初の100ヌクレオチドに結合することにより、長さ200ヌクレオチドのPCRテンプレート配列を調製する。プライマー3ウェブツールで設計されたプライマーのテンプレート配列を使用します。RNA単離のために、約500万個の増殖C2C12筋芽細胞と4日間分化したC2C12筋管を含む10センチメートルの皿1つを取ります。10ミリリットルの1X PBSで細胞を3回洗浄し、ピペットを使用してPBSを廃棄します。1ミリリットルのRNA単離試薬を加え、激しいピペッティングで細胞を溶解します。次に、200マイクロリットルのクロロホルムとボルテックスを15秒間加えます。チューブを摂氏4度で12, 000 Gで10分間遠心分離し、400マイクロリットルの上水層を取り、シリカカラムにロードし、室温で12, 000 Gで1分間遠心分離します。流れを新しいチューブに通し、600マイクロリットルの100%エタノールを加えます。20マイクロリットルの磁性シリカビーズを加え、チューブを25°C、1, 200 RPMに設定したサーモミキサーに5分間置きます。次に、チューブを磁気スタンドに30秒間、または溶液が透明になるまで置きます。磁性シリカビーズを90%エタノールを含む500マイクロリットルの洗浄バッファーに再懸濁します。チューブを磁気スタンドに30秒間置いた後、ビーズを磁石に向かって沈降させ、ピペットを使用してバッファーを廃棄します。チューブを摂氏50度でサーモミキサーで3分間風乾し、蓋を開けたままにします。20マイクロリットルのヌクレアーゼ遊離水を加え、ビーズを再懸濁します。溶解したRNAを新しいチューブに集め、分光光度計を使用して量と質を評価します。分光光度計を使用してRNA濃度を測定し、cDNA合成のために1マイクログラムのRNAを採取します。1マイクログラムの総RNAを1マイクロリットルのdNTPミックス、4マイクロリットルの5X逆転写酵素バッファー、2マイクロリットルの10X逆転写酵素ランダムプライマー、0.25マイクロリットルの逆転写酵素、および0.5マイクロリットルのRNase阻害剤と混合します。ヌクレアーゼを含まない水を使用して容量を20マイクロリットルに補います。チューブを摂氏25度で10分間置き、続いて摂氏50度で1時間置きます。次に、チューブを摂氏85度で5分間置き、酵素を不活性化します。0.2ミリリットルのPCRチューブまたはストリップに22マイクロリットルのPCR反応を、ネガティブコントロールチューブおよび非テンプレートコントロールチューブとともにセットアップします。11マイクロリットルのdd-PCRマスターミックス、5.5マイクロリットルの1マイクロモル濃度の環状RNA特異的フォワードプライマーおよびリバースプライマーミックス、および5.5マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を加えて、NTC反応チューブをセットアップします。同様に、テスト反応チューブをセットアップするには、11マイクロリットルのdd-PCRマスターミックス、5.5マイクロリットルの1マイクロモル濃度の環状RNA特異的フォワードプライマーおよびリバースプライマーミックス、および5.5マイクロリットルのcDNAを追加します。液滴を生成するには、20マイクロリットルのPCR混合物を0.2ミリリットルのPCRチューブから液滴発生カートリッジのサンプルウェルに移します。液滴発生油70マイクロリットルを液滴発生カートリッジの油井にピペットで慎重に加えます。液滴発生器カートリッジをゴム製ガスケットで覆い、液滴発生機に入れて、カートリッジの液滴ウェルで生成されたサンプル油滴混合物を取得します。PCR増幅のために、ピペットを使用して、液滴発生器カートリッジの液滴ウェルから96ウェルPCRプレートに40マイクロリットルのサンプル油滴混合物を移します。96ウェルPCRプレートをアルミホイルシーラーで密封します。摂氏180度に予熱したプレートシーラーマシンブロックに入れ、PCRプレートをシールするためにシールをクリックします。次に、プレートをdd-PCRサーマルサイクラーに入れ、蓋の温度を摂氏105度に設定し、ランプレートを毎秒摂氏2度に設定します。PCRが終了したら、プレートホルダーを正しい位置にしてプレートをdd-PCRドロップレットカウンターマシンに置きます。液滴分析ソフトウェアを開き、サンプル情報を入力してランを設定します。分析ボタンをクリックして、液滴読み取り完了後にデータを分析します。次に、[1D Amplitude]ボタンをクリックして、正と負の液滴を確認します。陽性の液滴を負の液滴から分離するには、同じターゲットを持つすべてのサンプルに共通のしきい値線を配置します。エクスポートボタンをクリックして、環状RNAカウントデータをcsvファイルとしてエクスポートします。エクスポートされたデータは、各サンプルに存在する環状RNAの数を示しています。各反応で使用されるcDNAの総量を考慮して、RNAナノグラムあたりの各サンプル中の環状RNAの数を手動で計算します。ここでは、QuantaSoftソフトウェアを使用したデータ分析を示します。MT1を除くすべてのサンプルは、12, 000を超える液滴数を示しました。MT1では総液滴数が少なかったため、このサンプルは最終的なデータ分析には考慮されませんでした。興味深いことに、筋芽細胞と比較して、4日間分化した筋管状態でCirc BとC2の発現パターンに明らかな違いがありました。コピー数の観点からCirc BとC2の存在量を分析したところ、C2C12筋芽細胞の3つの反復はRNAナノグラムあたり76.8、67、および46コピーであり、2つの筋管サンプルはRNAナノグラムあたり558および610コピーであったことが示されました。棒グラフのデータは、2〜3回の生物学的反復の平均プラスマイナス標準偏差を表します。ddPCRは、標的環状RNAの正確な発現差を測定するための最も先進的な方法の1つです。この方法は、来年の環状RNA研究および診断産業を加速するために不可欠なツールとなるでしょう。

Research

JoVE Journal

Biology

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

定量リアルタイムPCR（定量PCR）アレイを用いたプレマイクロRNAとマイクロRNAのプロファイリング

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Rapid PCR Thermocycling using Microscale Thermal Convection

ミクロ熱対流を使用して迅速なPCRの熱サイクル

Many molecular biology assays depend in some way on the polymerase chain reaction (PCR) to amplify an initially dilute target DNA sample to a detectable ...

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

ヒト血清から小非コードRNAの分離

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

デジタル核酸定量アッセイの簡単な一括読み出し

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

ホルマリン固定パラフィン包埋参照標準細胞株にBRAF V600E変異を検出するデジタルドロップレットPCRを採用

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

Using Digital Image Correlation to Characterize Local Strains on Vascular Tissue Specimens

デジタル画像相関を使用すると、血管の組織標本のローカル株を特徴づけるために、

Characterization of the mechanical behavior of biological and engineered soft tissues is a central component of fundamental biomedical research and ...

Genome-wide Purification of Extrachromosomal Circular DNA from Eukaryotic Cells

真核細胞から体外の環状DNAのゲノムワイドな精製

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs ...

Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR

定量的リアルタイム逆転写 PCR を用いたカニクイザルにおける血中マイクロ Rna の絶対定量

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This ...

Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit

老舗のオルガネラの分離キットを使用して急速な脂質液滴の隔離のプロトコル

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral ...

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

SARS-CoV-2の検出と定量のための2段階逆転写液滴デジタルPCRプロトコル

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...