Name: quantification of circular rnas using digital droplet pcr
Uploaded: 2022-09-16T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR at JoVE.com

이 연구는 생명 과학 연구소의 교내 자금, DBT 연구 보조금 (BT / PR27622 / MED / 30 / 1961 / 2018) 및 Wellcome Trust / DBT India Alliance Fellowship [IA / I / 18 / 2 / 504017]이 Amaresh C. Panda에게 수여되었습니다. 기사를 교정해 주신 다른 실험실 구성원에게 감사드립니다.

RNA는 RNase에 민감합니다. 따라서 모든 시약, 기기 및 작업 공간은 RNase가 없어야 하며 주의해서 취급해야 합니다.
1. circRNA에 대한 발산 프라이머 설계(그림 1 참조)
<ol><li>BEDTools를 사용하여 circRNA 주석 데이터에서 또는 UCSC 게놈 브라우저에서 백스플라이스 접합 좌표18,19 사이에 존재하...

<ol>
	<li>Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+the+predominant+transcript+isoform+from+hundreds+of+human+genes+in+diverse+cell+types.">Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types.</a> PLoS One. 7 (2), 30733 (2012).</li><li>Chen, L. L., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+circRNA+biogenesis.">Regulation of circRNA biogenesis.</a> RNA Biology. 12 (4), 381-388 (2015).</li><li>Kristensen, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biogenesis,+biology+and+characterization+of+circular+RNAs.">The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs.</a> Nature Reviews Genetics. 20 (11), 675-691 (2019).</li><li>Chen, X., Zhou, M., Yant, L., Huang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNA+in+disease:+Basic+properties+and+biomedical+relevance.">Circular RNA in disease: Basic properties and biomedical relevance.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. , (2022).</li><li>Sinha, T., Panigrahi, C., Das, D., Chandra Panda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNA+translation,+a+path+to+hidden+proteome.">Circular RNA translation, a path to hidden proteome.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 13 (1), 1685 (2022).</li><li>Panda, A. C., Xiao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+Act+as+miRNA+Sponges.">Circular RNAs Act as miRNA Sponges.</a> Circular RNAs: Biogenesis and Functions. , 67-79 (2018).</li><li>Das, A., Sinha, T., Shyamal, S., Panda, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+role+of+circular+RNA-protein+interactions.">Emerging role of circular RNA-protein interactions.</a> Non-Coding RNA. 7 (3), 48 (2021).</li><li>Verduci, L., Tarcitano, E., Strano, S., Yarden, Y., Blandino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CircRNAs:+Role+in+human+diseases+and+potential+use+as+biomarkers.">CircRNAs: Role in human diseases and potential use as biomarkers.</a> Cell Death &amp; Disease. 12 (5), 468 (2021).</li><li>Pandey, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+analysis+of+circular+RNAs.">Methods for analysis of circular RNAs.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 11 (1), 1566 (2020).</li><li>Das, A., Das, D., Panda, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+circular+RNAs+by+PCR.">Validation of circular RNAs by PCR.</a> PCR Primer Design. Methods in Molecular Biology. 2392, 103-114 (2022).</li><li>Jeck, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+abundant,+conserved,+and+associated+with+ALU+repeats.">Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats.</a> RNA. 19 (2), 141-157 (2013).</li><li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+droplet+digital+polymerase+chain+reaction+format+for+DNA+copy+number+quantification.">Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification.</a> Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).</li><li>Hayden, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+droplet+digital+PCR+to+real-time+PCR+for+quantitative+detection+of+cytomegalovirus.">Comparison of droplet digital PCR to real-time PCR for quantitative detection of cytomegalovirus.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (2), 540-546 (2013).</li><li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets:+From+variable+nonsense+to+publication+quality+data.">Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: From variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7, 2409 (2017).</li><li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number.">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li><li>Ishak, A., AlRawashdeh, M. M., Esagian, S. M., Nikas, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic,+prognostic,+and+therapeutic+value+of+droplet+digital+PCR+(ddPCR)+in+COVID-19+patients:+A+systematic+review.">Diagnostic, prognostic, and therapeutic value of droplet digital PCR (ddPCR) in COVID-19 patients: A systematic review.</a> Journal of Clinical Medicine. 10 (23), 5712 (2021).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+droplet+digital+PCR+to+detect+the+pathogens+of+infectious+diseases.">Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases.</a> Bioscience Reports. 38 (6), (2018).</li><li>Lee, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+UCSC+genome+browser+database:+2022+update.">The UCSC genome browser database: 2022 update.</a> Nucleic Acids Research. 50, 1115-1122 (2022).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+A+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li><li>Untergasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer3--new+capabilities+and+interfaces.">Primer3--new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Research. 40 (15), 115 (2012).</li><li>Das, A., Das, D., Das, A., Panda, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quick+and+cost-effective+method+for+DNA-free+total+RNA+isolation+using+magnetic+silica+beads.">A quick and cost-effective method for DNA-free total RNA isolation using magnetic silica beads.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Oberacker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Synthesis+of+Functionalized+Paramagnetic+Beads+for+Nucleic+Acid+Purification+and+Manipulation.">Simple Synthesis of Functionalized Paramagnetic Beads for Nucleic Acid Purification and Manipulation.</a> Bio-protocol. 9 (20), 3394 (2019).</li><li>Ra&#269;ki, N., Dreo, T., Gutierrez-Aguirre, I., Blejec, A., Ravnikar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+transcriptase+droplet+digital+PCR+shows+high+resilience+to+PCR+inhibitors+from+plant,+soil+and+water+samples.">Reverse transcriptase droplet digital PCR shows high resilience to PCR inhibitors from plant, soil and water samples.</a> Plant Methods. 10 (1), 42 (2014).</li><li>Taylor, S. C., Carbonneau, J., Shelton, D. N., Boivin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+droplet+digital+PCR+from+RNA+and+DNA+extracts+with+direct+comparison+to+RT-qPCR:+Clinical+implications+for+quantification+of+Oseltamivir-resistant+subpopulations.">Optimization of droplet digital PCR from RNA and DNA extracts with direct comparison to RT-qPCR: Clinical implications for quantification of Oseltamivir-resistant subpopulations.</a> Journal of Virological Methods. 224, 58-66 (2015).</li></ol>

CircRNA 연구는 지난 10년 동안 고처리량 시퀀싱 기술의 발견으로 성장했습니다. 결과적으로, 그것은 미래의 RNA 치료제를위한 잠재적 인 분자로 간주되었습니다. 또한, 암 및 심혈관 질환 4,8을 비롯한 여러 질환에서 바이오마커로 작용하는 것으로 알려져 있다. 그러나 circRNA의 식별은 존재도가 낮고 모 mRNA9와 구별되는 특정 백스플라이스...

RNA 시퀀싱 기술과 새로운 계산 알고리즘의 최근 발전은 원형 RNA(circRNA)1라고 하는 성장하는 비코딩 RNA 계열의 새로운 구성원을 발견했습니다. 이름에서 알 수 있듯이 circRNA는 자유 끝이 없는 단일 가닥 RNA 분자 계열입니다. 이들은 백스플라이싱이라고 하는 비표준 헤드-투-테일 스플라이싱에 의해 형성되며, 여기서 상류 스플라이스 수용체 부위는 다운스트림 스플라이스 공여체 부위와 공유적으로 결합하여 안정적인 RNA 원 1,2를 형성합니다. 이 과정은 순환된 엑손의 상류 및 하류에 존재하는 거꾸로 된 Alu 반복 요소를 포함한 여러 요인에 의해 매개되거나 일부 스플라이싱 인자 또는 RNA 결합 단백질(RBP)2,3에 의해 매개될 수 있습니다. 엑소닉 또는 인트론 서열에서만 생성된 원형 RNA는 엑소닉 circRNA 및 원형 인트론 RNA 또는 ci-RNA로 분류되는 반면, 일부 엑소닉 circRNA는 인트론을 유지하며 엑손-인트론 circRNA(EIcircRNA)라고 합니다.3,4. circRNA의 기능은 스폰지 miRNA 및/또는 RBP, 전사 조절 및 펩티드 3,5,6,7로 번역하여 세포 기능을 조절하는 것을 포함하여 다면적입니다. 여러 보고서에서 다양한 질병 및 생리적 과정에서 circRNA의 중요성을 강조했습니다8. 또한, 조직 특이적 발현 패턴 및 엑소뉴클레아제 소화에 대한 내성은 질병 진단을 위한 기능적 바이오마커가 되며 적절한치료 표적으로도 사용될 수 있다8. 건강과 질병을 조절하는 데있어 그 중요성을 고려할 때, circRNA 발현의 정확한 정량화는 시간의 필요성입니다.
생물학적샘플에서 circRNA를 정량화하기 위해 여러 생화학적 방법이 개발되었습니다9. circRNA 정량화에 가장 편리하고 널리 사용되는 방법 중 하나는 역전사 후 발산 프라이머 쌍10을 사용하는 정량적 중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR)입니다. 그러나 대부분의 circRNA는 선형 mRNA에 비해 존재량이 적기 때문에 정량화하기가 어렵습니다11. 이 문제를 극복하기 위해 우리는 디지털 액적 PCR (dd-PCR)을 사용하여 주어진 샘플에서 circRNA의 수를 정확하게 정량화하고자했습니다. dd-PCR은 미세 유체 원리를 따르는 고급 PCR 기술입니다. 오일에 여러 개의 수성 방울을 생성하고 PCR은 개별 반응(12)으로서 각 액적에서 발생합니다. 반응은 개별 액적에서 발생하고 액적 판독기를 사용하여 분석되며, 이는 관심 유전자12에 대한 양성 또는 음성 액적의 수를 제공합니다. 주어진 샘플에 단 하나의 사본만 있는 경우에도 관심 유전자를 정확하게 정량화하는 가장 민감한 기술입니다. 억제제에 대한 민감도 감소, 정밀도 향상 및 정량화를 위한 참조 유전자 생략은 기존 qPCR13,14,15보다 유리합니다. 관심 유전자의 절대 정량화를위한 연구 및 진단 도구로 널리 사용되었습니다16,17. 여기에서는 발산 프라이머를 사용하여 마우스 C2C12 근관을 분화하고 마우스 C2C12 근아세포를 증식시키는 데 있어 circRNA 정량화를 위한 상세한 dd-PCR 프로토콜을 설명합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >1.5 ml microcentifuge tube</td>
			<td >Tarson</td>
			<td >500010</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.2 ml tube strips with cap</td>
			<td >Tarson</td>
			<td >610020, 510073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filter Tips</td>
			<td >Tarson</td>
			<td >528104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >10977023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell scrapper</td>
			<td >HiMedia</td>
			<td >TCP223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chloroform</td>
			<td >SRL</td>
			<td >96764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA diluent</td>
			<td >HiMedia</td>
			<td >MB228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Random primers</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >48190011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >dNTP set</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >R0181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Murine RNase inhibitor</td>
			<td >NEB</td>
			<td >M0314S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Maxima reverse transcriptase</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >EP0743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 dd-PCR Evagreen Supermix</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Droplet generation oil for Evagreen</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1814040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DG8 Cartridges and Gaskets</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DG8 Cartridge holder</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1863051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 Droplet Generator</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ddPCR 96-Well Plates</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >12001925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PX1 PCR Plate Sealer</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1814000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C1000 Touch Thermal Cycler with 96&#8211;Deep Well Reaction Module</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1851197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 Droplet Reader</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Quantasoft Software</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silica column</td>
			<td >Umbrella Life Science</td>
			<td >38220090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UCSC Genome Browser</td>
			<td ></td>
			<td >https://genome.ucsc.edu/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primer 3</td>
			<td ></td>
			<td >https://primer3.ut.ee/</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of circular rnas using digital droplet pcr

디지털 액적 중합효소 연쇄 반응(dd-PCR)은 가장 민감한 정량화 방법 중 하나입니다. 반응을 거의 20,000개의 유중수 방울로 분획하고 개별 액적에서 PCR이 발생합니다. dd-PCR은 기존의 실시간 qPCR에 비해 낮은 존재비 표적 검출의 정확도 향상, 정량화를 위한 참조 유전자 생략, 샘플에 대한 기술 복제 제거, 샘플의 억제제에 대한 높은 복원력 표시 등 몇 가지 장점이 있습니다. 최근 dd-PCR은 유전자 발현 분석 및 진단을 위해 표적 DNA 또는 RNA를 정확하게 정량화하는 가장 보편적 인 방법 중 하나가되었습니다. 원형 RNA(circRNA)는 5' 및 3' 말단이 없는 최근에 발견된 공유 결합 폐쇄 RNA 분자의 대가족입니다. 그들은 RNA 결합 단백질과 마이크로 RNA의 스폰지 역할을하여 유전자 발현을 조절하는 것으로 나타났습니다. 또한 circRNA는 체액으로 분비되며 엑소뉴클레아제에 대한 내성으로 인해 질병 진단을 위한 바이오마커 역할을 합니다. 이 기사는 발산 프라이머 설계, RNA 추출, cDNA 합성 및 dd-PCR 분석을 수행하여 세포의 특정 원형 RNA(circRNA) 수준을 정확하게 정량화하는 방법을 보여주는 것을 목표로 합니다. 결론적으로, 우리는 dd-PCR을 사용하여 circRNA의 정확한 정량화를 입증합니다.

각 샘플에서 circRNA의 절대 수는 내보낸 dd-PCR 데이터로부터 유도할 수 있다. 실시간 정량 PCR 분석은 분화된 C2C12 근관에서 circBnc2 의 차등 발현을 제안했습니다(데이터는 나타내지 않음). 여기에서, 우리는 증식하는 C2C12 근원 세포 및 근관에서 circBnc2 의 절대 복제 수를 확인하고 싶었습니다. circBnc2 의 발현은 두 가지 조건에서 비교되기 때문에 동일한 시약과 절차를 사용하여 RNA ...

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Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR

이 프로토콜은 발산 프라이머를 사용하여 세포에서 원형 RNA(circRNA) 수준을 정밀하게 정량하기 위한 디지털 액적 PCR(dd-PCR)의 자세한 방법을 설명합니다.

디지털 액적 PCR을 사용한 원형 RNA의 정량화

Digital droplet polymerase chain reaction (dd-PCR) is one of the most sensitive quantification methods; it fractionates the reaction into nearly 20,000 ...

dd-PCR은 표적 DNA 또는 RNA의 절대 정량화를 위한 매우 민감하고 정확한 방법입니다. 다른 기존 방법으로는 정확한 결과를 제공하지 못하는 질병 진단에 사용되었습니다. dd-PCR은 매우 낮은 풍부 핵산 분자를 검출하기 위한 가장 민감한 기술입니다.정량적 PCR과 달리 dd-PCR은 정량화를 위한 하우스키핑 유전자 제어가 필요하지 않습니다. 감도와 정확성으로 인해 dd-PCR은 마이크로 RNA 및 원형 RNA와 같은 낮은 풍부 RNA 분자와 관련된 분자 진단 및 연구를 위한 도구로 사용할 수 있습니다. dd-PCR을 사용하기 전에 RT-PCR 또는 RT-qPCR을 수행하여 프라이머가 비특이적 PCR 증폭 없이 표적 유전자를 증폭하고 있는지 확인해야 합니다.시작하려면, 전체 원형 RNA 서열 길이의 마지막 100개 뉴클레오티드를 원형 RNA 서열의 처음 100개 뉴클레오티드에 결합함으로써 길이가 200개 뉴클레오티드 인 PCR 주형 서열을 준비한다. Primer 3 웹 도구로 디자인된 프라이머용 템플릿 시퀀스를 사용합니다. RNA 분리를 위해 약 500만 개의 증식하는 C2C12 근원세포 세포와 4일 분화된 C2C12 근관이 들어 있는 10cm 접시 하나를 가져갑니다.세포를 10 밀리리터의 1X PBS로 3 회 세척하고 피펫을 사용하여 PBS를 버립니다. RNA 분리 시약 1밀리리터를 추가하고 격렬한 피펫팅으로 세포를 용해시킵니다. 그런 다음 200 마이크로 리터의 클로로포름을 넣고 15 초 동안 와동시킵니다.튜브를 섭씨 4도에서 12, 000 G에서 10 분간 원심 분리하고 상부 수층 400 마이크로 리터를 취하여 실리카 컬럼에 넣고 실온에서 12, 000G에서 1 분간 원심 분리합니다. 새 튜브로 흐름을 가져 와서 600 마이크로 리터의 100 % 에탄올을 첨가하십시오. 20 마이크로 리터의 자성 실리카 비드를 넣고 튜브를 섭씨 25도 및 1, 200RPM으로 5 분 동안 설정 한 열 혼합기에 놓습니다.그런 다음 튜브를 마그네틱 스탠드에 30초 동안 또는 용액이 투명해질 때까지 놓습니다. 자성 실리카 비드를 90% 에탄올을 함유하는 500마이크로리터의 세척 완충액에 재현탁시킨다. 튜브를 마그네틱 스탠드에 30초 동안 놓은 후 비드가 자석 쪽으로 가라앉도록 하고 피펫을 사용하여 버퍼를 버립니다.튜브를 섭씨 50도에서 써모믹서에서 3분 동안 자연 건조하여 뚜껑을 열어 둡니다. 20마이크로리터의 뉴클레아제 자유수를 추가하고 비드를 재현탁합니다. 분광 광도계를 사용하여 양 및 품질 평가를 위해 용해 된 RNA를 새 튜브에 수집합니다.분광 광도계를 사용하여 RNA 농도를 측정하고 cDNA 합성을 위해 1 마이크로 그램의 RNA를 취합니다. 1마이크로리터의 dNTP 믹스, 4마이크로리터의 5X 역전사효소 버퍼, 2마이크로리터의 10X 역전사효소 랜덤 프라이머, 0.25마이크로리터의 역전사효소 효소 및 0.5마이크로리터의 RNase 억제제와 1마이크로그램의 총 RNA를 혼합합니다. 뉴클레아제 자유수를 사용하여 부피를 20 마이크로리터로 구성한다.튜브를 섭씨 25도에서 10 분 동안 놓은 다음 섭씨 50도에서 1 시간 동안 놓습니다. 그런 다음 튜브를 섭씨 85도에 5 분 동안 두어 효소를 비활성화하십시오. 0.2 밀리리터 PCR 튜브 또는 스트립에 22 마이크로 리터의 PCR 반응을 음성 제어 튜브 및 비 템플릿 제어 튜브와 함께 설정합니다.11마이크로리터의 dd-PCR 마스터 믹스, 5.5마이크로리터의 1마이크로몰 농도의 원형 RNA 특이적 정방향 및 역방향 프라이머 믹스, 5.5마이크로리터의 뉴클레아제 자유수를 추가하여 NTC 반응 튜브를 설정합니다. 유사하게, 테스트 반응 튜브를 설정하려면 11마이크로리터의 dd-PCR 마스터 믹스, 5.5마이크로리터의 1마이크로몰 농도의 원형 RNA 특이적 정방향 및 역방향 프라이머 믹스 및 5.5마이크로리터의 cDNA를 추가합니다. 액적 생성을 위해 20마이크로리터의 PCR 혼합물을 0.2밀리리터 PCR 튜브에서 액적 발생기 카트리지의 샘플 웰로 옮깁니다.피펫을 사용하여 70마이크로리터의 액적 생성 오일을 액적 발생기 카트리지의 유정에 조심스럽게 추가합니다. 액적 발생기 카트리지를 고무 가스켓으로 덮고 액적 발생기 기계에 넣어 카트리지의 액적 우물에서 생성된 샘플 오일 방울 혼합물을 얻습니다. PCR 증폭을 위해 피펫을 사용하여 액적 발생기 카트리지의 액적 웰에서 40마이크로리터의 샘플 오일 액적 혼합물을 96웰 PCR 플레이트로 옮깁니다.알루미늄 호일 실러로 96웰 PCR 플레이트를 밀봉합니다. 섭씨 180도로 예열된 플레이트 실러 기계 블록에 넣고 PCR 플레이트를 밀봉하기 위한 씰을 클릭합니다. 그런 다음 플레이트를 dd-PCR 열 순환기에 놓고 뚜껑 온도를 섭씨 105도로 설정하고 램프 속도를 초당 섭씨 2도로 설정합니다.PCR이 끝나면 플레이트 홀더가 액적을 계수하기 위한 올바른 위치에 있는 상태에서 플레이트를 dd-PCR 액적 카운터 기계에 놓습니다. 액적 분석 소프트웨어를 열고 샘플 정보를 입력하여 실행을 설정합니다. 분석 버튼을 클릭하여 액적 판독 완료 후 데이터를 분석합니다.그런 다음 1D 진폭 버튼을 클릭하여 양수 및 음수 방울을 확인합니다. 음의 물방울에서 양성 방울을 분리하려면 동일한 표적을 가진 모든 샘플에 대해 공통 임계 선을 설정하십시오. 내보내기 버튼을 클릭하여 원형 RNA 카운트 데이터를 csv 파일로 내보냅니다.내보낸 데이터는 각 샘플에 존재하는 원형 RNA의 수를 보여줍니다. 각 반응에 사용된 cDNA의 총량을 고려하여 RNA 나노그램당 각 샘플의 원형 RNA 수를 수동으로 계산합니다. QuantaSoft 소프트웨어를 사용한 데이터 분석은 여기에 나와 있습니다.MT1을 제외한 모든 샘플은 12, 000개 이상의 액적 카운트를 나타내었다. MT1에서 총 액적 수가 낮았기 때문에 이 샘플은 최종 데이터 분석에 고려되지 않았습니다. 흥미롭게도, 근원세포 세포와 비교하여 4일간 분화된 근관 조건에서 Circ B 및 C2의 발현 패턴에 뚜렷한 차이가 있었다.복제 수 측면에서 Circ B 및 C2 풍부도를 분석한 결과, C2C12 근원세포의 3회 복제는 RNA 나노그램당 76.8, 67 및 46 카피를 갖는 반면, 2개의 근관 샘플은 RNA 나노그램당 558 및 610개의 카피를 가졌다. 막대 그래프의 데이터는 2-3개의 생물학적 반복실험의 평균과 표준 편차를 뺀 값을 나타냅니다. ddPCR은 표적 원형 RNA의 정확한 차등 발현을 측정하는 가장 진보된 방법 중 하나입니다.이 방법은 내년에 순환 RNA 연구 및 진단 산업을 가속화하는 데 필수적인 도구가 될 것입니다.

Research

JoVE Journal

Biology

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연구

생물학

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