Name: quantification of circular rnas using digital droplet pcr
Uploaded: 2022-09-16T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por financiamento intramural do Instituto de Ciências da Vida, a bolsa de pesquisa DBT (BT / PR27622 / MED / 30/1961 / 2018) e a Wellcome Trust / DBT India Alliance Fellowship [IA / I / 18 / 2 / 504017] concedida a Amaresh C. Panda. Agradecemos a outros membros do laboratório pela revisão do artigo.

O RNA é sensível às RNases; portanto, todos os reagentes, instrumentos e espaços de trabalho devem ser livres de RNase e manuseados com cuidado.
1. Desenho do primer divergente para o circRNA (ver Figura 1)
<ol><li>Recupere a sequência madura a partir de dados de anotação de circRNA usando BEDTools ou do navegador do genoma UCSC, unindo a sequência de éxons/íntrons presente entre as coordenadas da junção de backsplic...

<ol>
	<li>Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+the+predominant+transcript+isoform+from+hundreds+of+human+genes+in+diverse+cell+types.">Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types.</a> PLoS One. 7 (2), 30733 (2012).</li><li>Chen, L. L., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+circRNA+biogenesis.">Regulation of circRNA biogenesis.</a> RNA Biology. 12 (4), 381-388 (2015).</li><li>Kristensen, L. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+role+of+circular+RNA-protein+interactions.">Emerging role of circular RNA-protein interactions.</a> Non-Coding RNA. 7 (3), 48 (2021).</li><li>Verduci, L., Tarcitano, E., Strano, S., Yarden, Y., Blandino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CircRNAs:+Role+in+human+diseases+and+potential+use+as+biomarkers.">CircRNAs: Role in human diseases and potential use as biomarkers.</a> Cell Death &amp; Disease. 12 (5), 468 (2021).</li><li>Pandey, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+analysis+of+circular+RNAs.">Methods for analysis of circular RNAs.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 11 (1), 1566 (2020).</li><li>Das, A., Das, D., Panda, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+circular+RNAs+by+PCR.">Validation of circular RNAs by PCR.</a> PCR Primer Design. Methods in Molecular Biology. 2392, 103-114 (2022).</li><li>Jeck, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+abundant,+conserved,+and+associated+with+ALU+repeats.">Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats.</a> RNA. 19 (2), 141-157 (2013).</li><li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+droplet+digital+polymerase+chain+reaction+format+for+DNA+copy+number+quantification.">Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification.</a> Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).</li><li>Hayden, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+droplet+digital+PCR+to+real-time+PCR+for+quantitative+detection+of+cytomegalovirus.">Comparison of droplet digital PCR to real-time PCR for quantitative detection of cytomegalovirus.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (2), 540-546 (2013).</li><li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets:+From+variable+nonsense+to+publication+quality+data.">Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: From variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7, 2409 (2017).</li><li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number.">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li><li>Ishak, A., AlRawashdeh, M. M., Esagian, S. M., Nikas, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic,+prognostic,+and+therapeutic+value+of+droplet+digital+PCR+(ddPCR)+in+COVID-19+patients:+A+systematic+review.">Diagnostic, prognostic, and therapeutic value of droplet digital PCR (ddPCR) in COVID-19 patients: A systematic review.</a> Journal of Clinical Medicine. 10 (23), 5712 (2021).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+droplet+digital+PCR+to+detect+the+pathogens+of+infectious+diseases.">Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases.</a> Bioscience Reports. 38 (6), (2018).</li><li>Lee, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+UCSC+genome+browser+database:+2022+update.">The UCSC genome browser database: 2022 update.</a> Nucleic Acids Research. 50, 1115-1122 (2022).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+A+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li><li>Untergasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer3--new+capabilities+and+interfaces.">Primer3--new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Research. 40 (15), 115 (2012).</li><li>Das, A., Das, D., Das, A., Panda, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quick+and+cost-effective+method+for+DNA-free+total+RNA+isolation+using+magnetic+silica+beads.">A quick and cost-effective method for DNA-free total RNA isolation using magnetic silica beads.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Oberacker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Synthesis+of+Functionalized+Paramagnetic+Beads+for+Nucleic+Acid+Purification+and+Manipulation.">Simple Synthesis of Functionalized Paramagnetic Beads for Nucleic Acid Purification and Manipulation.</a> Bio-protocol. 9 (20), 3394 (2019).</li><li>Ra&#269;ki, N., Dreo, T., Gutierrez-Aguirre, I., Blejec, A., Ravnikar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+transcriptase+droplet+digital+PCR+shows+high+resilience+to+PCR+inhibitors+from+plant,+soil+and+water+samples.">Reverse transcriptase droplet digital PCR shows high resilience to PCR inhibitors from plant, soil and water samples.</a> Plant Methods. 10 (1), 42 (2014).</li><li>Taylor, S. C., Carbonneau, J., Shelton, D. N., Boivin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+droplet+digital+PCR+from+RNA+and+DNA+extracts+with+direct+comparison+to+RT-qPCR:+Clinical+implications+for+quantification+of+Oseltamivir-resistant+subpopulations.">Optimization of droplet digital PCR from RNA and DNA extracts with direct comparison to RT-qPCR: Clinical implications for quantification of Oseltamivir-resistant subpopulations.</a> Journal of Virological Methods. 224, 58-66 (2015).</li></ol>

A pesquisa de circRNA cresceu na última década com a descoberta de tecnologias de sequenciamento de alto rendimento. Como resultado, tem sido considerada uma molécula potencial para futuras terapias de RNA. Além disso, sabe-se que atua como biomarcador em diversas doenças, incluindo câncer e doenças cardiovasculares 4,8. No entanto, a identificação do circRNA é complicada devido à sua baixa abundância e possui apenas uma sequência específica de jun?...

Avanços recentes em tecnologias de sequenciamento de RNA e novos algoritmos computacionais descobriram um novo membro da crescente família de RNAs não codificantes, chamado RNA circular (circRNA)1. Como o nome sugere, os circRNAs são uma família de moléculas de RNA de fita simples sem extremidades livres. Eles são formados por splicing não-canônico da cabeça à cauda chamado back-splicing, onde o local aceptor da emenda a montante se une covalentemente com o local doador da emenda a jusante para formar um círculo estável de RNA 1,2. Esse processo pode ser mediado por diversos fatores, incluindo elementos repetitivos de Alu invertidos presentes no montante e a jusante de éxons circularizados, ou pode ser mediado por alguns fatores de splicing ou proteínas de ligação de RNA (RBPs)2,3. Os RNAs circulares gerados exclusivamente a partir da sequência exônica ou intrônica são classificados como circRNA exônico e RNAs intrônicos circulares ou ci-RNAs, enquanto alguns circRNAs exônicos retêm o íntron e são chamados de circRNAs de íntron éxon (EIcircRNAs)3,4. As funções dos circRNAs são multifacetadas, incluindo a esponja de miRNA e/ou RBP, regulando a transcrição e regulando a função celular por meio da tradução em peptídeos 3,5,6,7. Vários relatos têm destacado a importância dos circRNAs em diversas doenças e processos fisiológicos8. Além disso, os padrões de expressão tecidual específicos e a resistência à digestão da exonuclease a tornam um biomarcador funcional para o diagnóstico da doença e também podem ser utilizados como alvo terapêutico adequado8. Considerando sua importância na regulação da saúde e das doenças, a quantificação precisa da expressão do circRNA é a necessidade da hora.
Vários métodos bioquímicos têm sido desenvolvidos para quantificar circRNAs em amostras biológicas9. Um dos métodos mais convenientes e amplamente aceitos para a quantificação do circRNA é a transcrição reversa, seguida pela reação quantitativa em cadeia da polimerase (RT-qPCR) usando pares de iniciadores divergentes10. No entanto, a maioria dos circRNAs está em baixa abundância em comparação com os mRNAs lineares, o que torna difícil quantificá-los11. Para superar esse problema, buscou-se utilizar a PCR de gotículas digitais (dd-PCR) para quantificar com precisão o número de circRNAs em uma determinada amostra. O dd-PCR é uma tecnologia avançada de PCR que segue o princípio da microfluídica; gera múltiplas gotículas aquosas no óleo, e a PCR ocorre em cada gota como uma reação individual12. A reação ocorre em gotículas individuais e é analisada por meio de um leitor de gotículas, que fornece o número de gotículas positivas ou negativas para o gene de interesse12. É a técnica mais sensível para quantificar com precisão um gene de interesse, mesmo que haja apenas uma única cópia em uma determinada amostra. A diminuição da sensibilidade aos inibidores, a melhor precisão e a omissão do gene de referência para quantificação o tornam mais vantajoso do que a qPCR convencional13,14,15. Tem sido amplamente utilizado como ferramenta de pesquisa e diagnóstico para a quantificação absoluta de um gene de interesse16,17. Aqui, descrevemos o protocolo detalhado de dd-PCR para quantificação de circRNA na diferenciação de miotubos C2C12 de camundongos e mioblastos C2C12 de camundongos proliferantes usando primers divergentes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >1.5 ml microcentifuge tube</td>
			<td >Tarson</td>
			<td >500010</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.2 ml tube strips with cap</td>
			<td >Tarson</td>
			<td >610020, 510073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filter Tips</td>
			<td >Tarson</td>
			<td >528104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >10977023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell scrapper</td>
			<td >HiMedia</td>
			<td >TCP223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chloroform</td>
			<td >SRL</td>
			<td >96764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA diluent</td>
			<td >HiMedia</td>
			<td >MB228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Random primers</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >48190011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >dNTP set</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >R0181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Murine RNase inhibitor</td>
			<td >NEB</td>
			<td >M0314S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Maxima reverse transcriptase</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >EP0743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 dd-PCR Evagreen Supermix</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Droplet generation oil for Evagreen</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1814040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DG8 Cartridges and Gaskets</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DG8 Cartridge holder</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1863051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 Droplet Generator</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ddPCR 96-Well Plates</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >12001925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PX1 PCR Plate Sealer</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1814000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C1000 Touch Thermal Cycler with 96&#8211;Deep Well Reaction Module</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1851197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 Droplet Reader</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Quantasoft Software</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silica column</td>
			<td >Umbrella Life Science</td>
			<td >38220090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UCSC Genome Browser</td>
			<td ></td>
			<td >https://genome.ucsc.edu/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primer 3</td>
			<td ></td>
			<td >https://primer3.ut.ee/</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of circular rnas using digital droplet pcr

A reação em cadeia da polimerase de gotículas digitais (dd-PCR) é um dos métodos de quantificação mais sensíveis; ele fraciona a reação em quase 20.000 gotículas de água em óleo, e a PCR ocorre nas gotículas individuais. A dd-PCR tem várias vantagens sobre a qPCR convencional em tempo real, incluindo maior precisão na detecção de alvos de baixa abundância, omitindo genes de referência para quantificação, eliminando replicações técnicas para amostras e mostrando alta resiliência a inibidores nas amostras. Recentemente, o dd-PCR tornou-se um dos métodos mais populares para quantificar com precisão o DNA ou RNA alvo para análise e diagnóstico da expressão gênica. RNAs circulares (circRNAs) são uma grande família de moléculas de RNA covalentemente fechadas recentemente descobertas sem extremidades de 5' e 3'. Eles demonstraram regular a expressão gênica agindo como esponjas para proteínas de ligação ao RNA e microRNAs. Além disso, os circRNAs são secretados em fluidos corporais, e sua resistência às exonucleases faz com que eles sirvam como biomarcadores para o diagnóstico de doenças. Este artigo tem como objetivo mostrar como realizar o desenho de primer divergente, extração de RNA, síntese de cDNA e análise de dd-PCR para quantificar com precisão os níveis específicos de RNA circular (circRNA) nas células. Em conclusão, demonstramos a quantificação precisa de circRNAs usando dd-PCR.

O número absoluto de circRNAs em cada amostra pode ser derivado dos dados de dd-PCR exportados. A análise quantitativa em tempo real da PCR sugeriu expressão diferencial de circBnc2 nos miotubos C2C12 diferenciados (dados não mostrados). Aqui, queríamos verificar o número absoluto de cópias de circBnc2 em mioblastos e miotubos C2C12 proliferantes. Como a expressão de circBnc2 é comparada em duas condições, é realmente importante processar todas as amostras para isolamento de RNA, s?...

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Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR

Este protocolo descreve o método detalhado de PCR de gotículas digitais (dd-PCR) para quantificação precisa dos níveis de RNA circular (circRNA) em células usando primers divergentes.

Quantificação de RNAs circulares usando PCR de gotículas digitais

Digital droplet polymerase chain reaction (dd-PCR) is one of the most sensitive quantification methods; it fractionates the reaction into nearly 20,000 ...

dd-PCR é um método altamente sensível e preciso para quantificação absoluta de DNA ou RNA alvo. Ele tem sido usado para o diagnóstico de doenças onde outros métodos convencionais não conseguem dar resultados precisos. dd-PCR é a técnica mais sensível para detectar moléculas de ácido nucleico abundantes muito baixas.Ao contrário da PCR quantitativa, a dd-PCR não requer nenhum controle genético de limpeza para quantificação. Devido à sua sensibilidade e precisão, a dd-PCR pode ser usada como uma ferramenta para diagnóstico molecular e pesquisa envolvendo moléculas de RNA de baixa abundância, como micro RNAs e RNAs circulares. Antes de usar dd-PCR, deve-se realizar RT-PCR ou RT-qPCR para confirmar que os primers estão amplificando seus genes-alvo sem qualquer amplificação de PCR inespecífica.Para começar, prepare uma sequência de modelo de PCR de 200 nucleotídeos de comprimento, unindo os últimos 100 nucleotídeos do comprimento total da sequência circular de RNA aos primeiros 100 nucleotídeos da sequência circular de RNA. Use a sequência de modelos para primer, projetada pela ferramenta da Web Primer 3. Pegue um prato de 10 centímetros contendo cerca de 5 milhões de células mioblásticas C2C12 proliferantes e um miotubo C2C12 diferenciado de quatro dias para isolamento de RNA.Lave as células com 10 mililitros de 1X PBS três vezes e descarte o PBS usando uma pipeta. Adicione um mililitro de reagente de isolamento de RNA e lise as células por pipetagem vigorosa. Em seguida, adicione 200 microlitros de clorofórmio e vórtice por 15 segundos.Centrifugar o tubo a quatro graus Celsius por 10 minutos a 12.000 G.Pegue 400 microlitros da camada aquosa superior, carregue-o em uma coluna de sílica e centrifugar por um minuto a 12.000 G à temperatura ambiente. Leve o fluxo para um novo tubo e adicione 600 microlitros de etanol a 100%. Adicione 20 microlitros de contas de sílica magnética e coloque o tubo em um termificador, ajustado a 25 graus Celsius e 1.200 RPM por cinco minutos.Em seguida, coloque o tubo num suporte magnético durante 30 segundos ou até que a solução fique límpida. Ressuspeite as esferas de sílica magnética em 500 microlitros de tampão de lavagem contendo etanol a 90%. Depois de colocar o tubo no suporte magnético por 30 segundos, deixe as contas se acomodarem em direção ao ímã e descarte o buffer usando uma pipeta.Seque o tubo ao ar livre a 50 graus Celsius por três minutos em uma terminadora, mantendo a tampa aberta. Adicione 20 microlitros de água livre de nuclease e ressuspenda as contas. Coletar o RNA dissolvido em um novo tubo para avaliação de quantidade e qualidade usando um espectrofotômetro.Meça a concentração de RNA usando um espectrofotômetro e pegue um micrograma de RNA para a síntese de cDNA. Misture um micrograma de RNA total com um microlitro de mistura de dNTP, quatro microlitros de tampão transcriptase reversa 5X, dois microlitros de primer aleatório de transcriptase reversa 10X, 0,25 microlitros de enzima transcriptase reversa e 0,5 microlitros de inibidor de RNase. Completar o volume para 20 microlitros usando água livre de nuclease.Coloque o tubo a 25 graus Celsius por 10 minutos, seguido por 50 graus Celsius por uma hora. Em seguida, coloque o tubo a 85 graus Celsius por cinco minutos para inativar a enzima. Configure a reação de PCR de 22 microlitros em tubos ou tiras de PCR de 0,2 mililitro, juntamente com um tubo de controle negativo e tubos de controle sem modelo.Adicione 11 microlitros de mistura mestre dd-PCR, 5,5 microlitros de mistura de primer circular específica de RNA para frente e para trás de uma concentração micromolar e 5,5 microlitros de água livre de nuclease para configurar os tubos de reação NTC. Da mesma forma, para configurar os tubos de reação de ensaio, adicione 11 microlitros de mistura mestre dd-PCR, 5,5 microlitros de RNA circular específico para frente e mistura de primer reverso de uma concentração micromolar e 5,5 microlitros de cDNA. Para a geração de gotículas, transfira 20 microlitros da mistura de PCR de tubos de PCR de 0,2 mililitros para os poços de amostra do cartucho gerador de gotículas.Adicione 70 microlitros de óleo de geração de gotículas aos poços de petróleo do cartucho do gerador de gotículas com cuidado, usando uma pipeta. Cubra o cartucho do gerador de gotículas com uma junta de borracha e coloque-o na máquina geradora de gotas para obter a mistura de gotículas de óleo de amostra, gerada nos poços de gotículas do cartucho. Para amplificação por PCR, transfira 40 microlitros da mistura de gotículas de óleo da amostra dos poços de gotículas do cartucho gerador de gotículas para uma placa de PCR de 96 poços usando uma pipeta.Sele a placa de PCR de 96 poços com o selador de folha de alumínio. Coloque-o no bloco da máquina seladora de placas, pré-aquecido a 180 graus Celsius, e clique no selo para selar a placa de PCR. Em seguida, coloque a placa no termociclador dd-PCR e defina a temperatura da tampa para 105 graus Celsius e uma taxa de rampa para dois graus Celsius por segundo.Quando a PCR terminar, coloque a placa na máquina conta-gotas dd-PCR com o suporte da placa na posição correta para contar as gotículas. Abra o software de análise de gotículas e configure a execução fornecendo informações de amostra. Clique no botão analisar para analisar os dados após a conclusão da leitura da gota.Em seguida, clique no botão Amplitude 1D para ver as gotículas positivas e negativas. Para segregar as gotículas positivas das gotículas negativas, coloque uma linha de limiar comum para todas as amostras com o mesmo alvo. Clique no botão exportar para exportar os dados de contagem de RNA circular como um arquivo csv.Os dados exportados mostram o número de RNAs circulares presentes em cada amostra. Calcule manualmente o número de RNAs circulares em cada amostra por nanograma de RNA, considerando a quantidade total de cDNA usada em cada reação. A análise de dados usando o software QuantaSoft é mostrada aqui.Todas as amostras, exceto MT1, apresentaram mais de 12.000 contagens de gotículas. Como a contagem total de gotículas foi baixa em MT1, esta amostra não foi considerada para a análise final dos dados. Curiosamente, houve uma clara diferença no padrão de expressão de Circ B e C2 na condição diferenciada de quatro dias do miotubo em comparação com as células mioblásticas.A análise da abundância de Circ B e C2 em termos de número de cópias, indicou que as três repetições de mioblastos C2C12 tinham 76,8, 67 e 46 cópias por nanograma de RNA, enquanto as duas amostras de miotubo tinham 558 e 610 cópias por nanograma de RNA. Os dados no gráfico de barras representam a média mais menos o desvio padrão de duas a três replicações biológicas. ddPCR é um dos métodos mais avançados para medir a expressão diferencial precisa do RNA circular alvo.Este método será uma ferramenta essencial para acelerar a pesquisa circular de RNA e as indústrias de diagnóstico no próximo ano.

Research

JoVE Journal

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