Name: quantification of circular rnas using digital droplet pcr
Uploaded: 2022-09-16T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR at JoVE.com

Эта работа была поддержана внутренним финансированием института наук о жизни, исследовательским грантом DBT (BT/PR27622/MED/30/1961/2018) и стипендией Wellcome Trust/DBT India Alliance Fellowship [IA/I/18/2/504017], присужденной Амарешу К. Панде. Мы благодарим других членов лаборатории за корректуру статьи.

РНК чувствительна к РНКазам; поэтому все реагенты, инструменты и рабочие места должны быть свободны от РНКазы и обрабатываться с осторожностью.
1. Дивергентная конструкция грунтовки для циркРНК (см. Рисунок 1)
<ol><li>Извлеките зрелую после...

<ol>
	<li>Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+the+predominant+transcript+isoform+from+hundreds+of+human+genes+in+diverse+cell+types.">Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types.</a> PLoS One. 7 (2), 30733 (2012).</li><li>Chen, L. L., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+circRNA+biogenesis.">Regulation of circRNA biogenesis.</a> RNA Biology. 12 (4), 381-388 (2015).</li><li>Kristensen, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biogenesis,+biology+and+characterization+of+circular+RNAs.">The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs.</a> Nature Reviews Genetics. 20 (11), 675-691 (2019).</li><li>Chen, X., Zhou, M., Yant, L., Huang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNA+in+disease:+Basic+properties+and+biomedical+relevance.">Circular RNA in disease: Basic properties and biomedical relevance.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. , (2022).</li><li>Sinha, T., Panigrahi, C., Das, D., Chandra Panda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNA+translation,+a+path+to+hidden+proteome.">Circular RNA translation, a path to hidden proteome.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 13 (1), 1685 (2022).</li><li>Panda, A. C., Xiao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+Act+as+miRNA+Sponges.">Circular RNAs Act as miRNA Sponges.</a> Circular RNAs: Biogenesis and Functions. , 67-79 (2018).</li><li>Das, A., Sinha, T., Shyamal, S., Panda, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+role+of+circular+RNA-protein+interactions.">Emerging role of circular RNA-protein interactions.</a> Non-Coding RNA. 7 (3), 48 (2021).</li><li>Verduci, L., Tarcitano, E., Strano, S., Yarden, Y., Blandino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CircRNAs:+Role+in+human+diseases+and+potential+use+as+biomarkers.">CircRNAs: Role in human diseases and potential use as biomarkers.</a> Cell Death &amp; Disease. 12 (5), 468 (2021).</li><li>Pandey, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+analysis+of+circular+RNAs.">Methods for analysis of circular RNAs.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 11 (1), 1566 (2020).</li><li>Das, A., Das, D., Panda, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+circular+RNAs+by+PCR.">Validation of circular RNAs by PCR.</a> PCR Primer Design. Methods in Molecular Biology. 2392, 103-114 (2022).</li><li>Jeck, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+abundant,+conserved,+and+associated+with+ALU+repeats.">Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats.</a> RNA. 19 (2), 141-157 (2013).</li><li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+droplet+digital+polymerase+chain+reaction+format+for+DNA+copy+number+quantification.">Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification.</a> Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).</li><li>Hayden, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+droplet+digital+PCR+to+real-time+PCR+for+quantitative+detection+of+cytomegalovirus.">Comparison of droplet digital PCR to real-time PCR for quantitative detection of cytomegalovirus.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (2), 540-546 (2013).</li><li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets:+From+variable+nonsense+to+publication+quality+data.">Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: From variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7, 2409 (2017).</li><li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number.">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li><li>Ishak, A., AlRawashdeh, M. M., Esagian, S. M., Nikas, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic,+prognostic,+and+therapeutic+value+of+droplet+digital+PCR+(ddPCR)+in+COVID-19+patients:+A+systematic+review.">Diagnostic, prognostic, and therapeutic value of droplet digital PCR (ddPCR) in COVID-19 patients: A systematic review.</a> Journal of Clinical Medicine. 10 (23), 5712 (2021).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+droplet+digital+PCR+to+detect+the+pathogens+of+infectious+diseases.">Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases.</a> Bioscience Reports. 38 (6), (2018).</li><li>Lee, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+UCSC+genome+browser+database:+2022+update.">The UCSC genome browser database: 2022 update.</a> Nucleic Acids Research. 50, 1115-1122 (2022).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+A+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li><li>Untergasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer3--new+capabilities+and+interfaces.">Primer3--new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Research. 40 (15), 115 (2012).</li><li>Das, A., Das, D., Das, A., Panda, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quick+and+cost-effective+method+for+DNA-free+total+RNA+isolation+using+magnetic+silica+beads.">A quick and cost-effective method for DNA-free total RNA isolation using magnetic silica beads.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Oberacker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Synthesis+of+Functionalized+Paramagnetic+Beads+for+Nucleic+Acid+Purification+and+Manipulation.">Simple Synthesis of Functionalized Paramagnetic Beads for Nucleic Acid Purification and Manipulation.</a> Bio-protocol. 9 (20), 3394 (2019).</li><li>Ra&#269;ki, N., Dreo, T., Gutierrez-Aguirre, I., Blejec, A., Ravnikar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+transcriptase+droplet+digital+PCR+shows+high+resilience+to+PCR+inhibitors+from+plant,+soil+and+water+samples.">Reverse transcriptase droplet digital PCR shows high resilience to PCR inhibitors from plant, soil and water samples.</a> Plant Methods. 10 (1), 42 (2014).</li><li>Taylor, S. C., Carbonneau, J., Shelton, D. N., Boivin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+droplet+digital+PCR+from+RNA+and+DNA+extracts+with+direct+comparison+to+RT-qPCR:+Clinical+implications+for+quantification+of+Oseltamivir-resistant+subpopulations.">Optimization of droplet digital PCR from RNA and DNA extracts with direct comparison to RT-qPCR: Clinical implications for quantification of Oseltamivir-resistant subpopulations.</a> Journal of Virological Methods. 224, 58-66 (2015).</li></ol>

Исследования CircRNA выросли в последнее десятилетие с открытием высокопроизводительных технологий секвенирования. В результате он был рассмотрен как потенциальная молекула для будущей РНК-терапии. Кроме того, известно, что он действует как биомаркер при нескольких заболеваниях, включа...

Последние достижения в технологиях секвенирования РНК и новых вычислительных алгоритмах обнаружили нового члена растущего семейства некодирующих РНК, называемого круговой РНК (циркРНК)1. Как следует из названия, циркРНК представляют собой семейство одноцепочечных молекул РНК без свободных концов. Они образованы неканоническим сращиванием голова к хвосту, называемым обратным сращиванием, где восходящий акцептор сращивания соединяется ковалентно с нисходящим донорским сайтом сращивания, образуя стабильный круг РНК 1,2. Этот процесс может быть опосредован несколькими факторами, включая инвертированные повторяющиеся элементы Alu, присутствующие в восходящем и нисходящем потоке циркуляризированных экзонов, или может быть опосредован некоторыми факторами сплайсинга или РНК-связывающими белками (RBP)2,3. Круговые РНК, генерируемые исключительно из экзонной или интронной последовательности, классифицируются как экзонные циркРНК и циркулярные интронные РНК или ci-РНК, тогда как некоторые экзонные циркРНК сохраняют интрон и называются экзон-интронными циркРНК (EIcircRNAs)3,4. Функции циркРНК многогранны, включая губку миРНК и/или RBP, регулирующую транскрипцию и регулирующую клеточную функцию путем трансляции в пептиды 3,5,6,7. В нескольких докладах подчеркивается значение циркРНК при различных заболеваниях и физиологических процессах8. Кроме того, тканеспецифические паттерны экспрессии и резистентность к перевариванию экзонуклеазы делают ее функциональным биомаркером для диагностики заболеваний, и ее также можно использовать в качестве подходящей терапевтической мишени8. Учитывая его важность в регулировании здоровья и заболеваний, точная количественная оценка экспрессии циркРНК является необходимостью часа.
Было разработано несколько биохимических методов для количественной оценки циркРНК в биологических образцах9. Одним из наиболее удобных и широко распространенных методов количественного определения циркРНК является обратная транскрипция с последующей количественной полимеразной цепной реакцией (RT-qPCR) с использованием дивергентных пар праймеров10. Тем не менее, большинство циркРНК находятся в низком изобилии по сравнению с линейными мРНК, что затрудняет их количественную оценку11. Чтобы преодолеть эту проблему, мы стремились использовать цифровую капельную ПЦР (dd-PCR) для точной количественной оценки количества циркРНК в данном образце. dd-PCR - это передовая технология ПЦР, которая следует принципу микрофлюидики; он генерирует несколько водных капель в масле, и ПЦР происходит в каждой капле как индивидуальная реакция12. Реакция возникает в отдельных каплях и анализируется с помощью капельного считывателя, который дает количество положительных или отрицательных капель для интересующего гена12. Это наиболее чувствительный метод точной количественной оценки интересующего гена, даже если в данном образце есть только одна копия. Снижение чувствительности к ингибиторам, лучшая точность и пропуск эталонного гена для количественной оценки делают его более выгодным, чем обычный qPCR 13,14,15. Он широко использовался в качестве исследовательского и диагностического инструмента для абсолютной количественной оценки интересующего гена16,17. Здесь мы описываем подробный протокол dd-PCR для количественной оценки циркРНК в дифференциации миотубок C2C12 мыши и пролиферирующих миобластов C2C12 мыши с использованием расходящихся праймер.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >1.5 ml microcentifuge tube</td>
			<td >Tarson</td>
			<td >500010</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.2 ml tube strips with cap</td>
			<td >Tarson</td>
			<td >610020, 510073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filter Tips</td>
			<td >Tarson</td>
			<td >528104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >10977023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell scrapper</td>
			<td >HiMedia</td>
			<td >TCP223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chloroform</td>
			<td >SRL</td>
			<td >96764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA diluent</td>
			<td >HiMedia</td>
			<td >MB228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Random primers</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >48190011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >dNTP set</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >R0181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Murine RNase inhibitor</td>
			<td >NEB</td>
			<td >M0314S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Maxima reverse transcriptase</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >EP0743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 dd-PCR Evagreen Supermix</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Droplet generation oil for Evagreen</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1814040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DG8 Cartridges and Gaskets</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DG8 Cartridge holder</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1863051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 Droplet Generator</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ddPCR 96-Well Plates</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >12001925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PX1 PCR Plate Sealer</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1814000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C1000 Touch Thermal Cycler with 96&#8211;Deep Well Reaction Module</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1851197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 Droplet Reader</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Quantasoft Software</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silica column</td>
			<td >Umbrella Life Science</td>
			<td >38220090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UCSC Genome Browser</td>
			<td ></td>
			<td >https://genome.ucsc.edu/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primer 3</td>
			<td ></td>
			<td >https://primer3.ut.ee/</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of circular rnas using digital droplet pcr

Цифровая капельно-полимеразная цепная реакция (dd-PCR) является одним из наиболее чувствительных методов количественной оценки; он фракционирует реакцию почти на 20 000 капель воды в масле, и ПЦР происходит в отдельных каплях. dd-PCR имеет несколько преимуществ по сравнению с обычной qPCR в реальном времени, включая повышенную точность в обнаружении мишеней с низкой плотностью, пропуск эталонных генов для количественной оценки, устранение технических реплик для образцов и демонстрацию высокой устойчивости к ингибиторам в образцах. В последнее время дд-ПЦР стала одним из самых популярных методов точной количественной оценки целевой ДНК или РНК для анализа экспрессии генов и диагностики. Круговые РНК (циркРНК) представляют собой большое семейство недавно обнаруженных ковалентно закрытых молекул РНК, не имеющих 5' и 3' концов. Было показано, что они регулируют экспрессию генов, действуя как губки для РНК-связывающих белков и микроРНК. Кроме того, циркРНК секретируются в жидкости организма, и их устойчивость к экзонуклеазам делает их биомаркерами для диагностики заболеваний. Эта статья направлена на то, чтобы показать, как выполнить дизайн дивергентного праймера, экстракцию РНК, синтез кДНК и анализ dd-PCR для точной количественной оценки конкретных уровней циркулярной РНК (циркРНК) в клетках. В заключение мы демонстрируем точную количественную оценку циркРНК с помощью dd-PCR.

Абсолютное число циркРНК в каждом образце может быть получено из экспортированных данных ДД-ПЦР. Количественный анализ ПЦР в реальном времени показал дифференциальную экспрессию circBnc2 в дифференцированных миотрубах C2C12 (данные не показаны). Здесь мы хотели проверить абсолютное чи...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR at JoVE.com

Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR

Этот протокол описывает подробный метод цифровой капельной ПЦР (dd-PCR) для точной количественной оценки уровней круговой РНК (циркРНК) в клетках с использованием расходящихся праймеров.

Количественная оценка циркулярных РНК с использованием цифровой капельной ПЦР

Digital droplet polymerase chain reaction (dd-PCR) is one of the most sensitive quantification methods; it fractionates the reaction into nearly 20,000 ...

dd-PCR является высокочувствительным и точным методом абсолютной количественной оценки целевой ДНК или РНК. Он был использован для диагностики заболеваний, где другие традиционные методы не дают точных результатов. dd-PCR является наиболее чувствительным методом обнаружения очень низких обильных молекул нуклеиновых кислот.В отличие от количественной ПЦР, dd-PCR не требует какого-либо контроля генов для количественной оценки. Благодаря своей чувствительности и точности, dd-PCR может использоваться в качестве инструмента для молекулярной диагностики и исследований с участием молекул РНК с низким содержанием, таких как микроРНК и круговые РНК. Перед использованием dd-PCR следует выполнить ОТ-ПЦР или ОТ-qPCR, чтобы подтвердить, что праймеры амплируют свои гены-мишени без какой-либо неспецифической амплификации ПЦР.Для начала подготовьте шаблонную последовательность ПЦР длиной 200 нуклеотидов, соединив последние 100 нуклеотидов общей длины круговой последовательности РНК с первыми 100 нуклеотидами круговой последовательности РНК. Используйте шаблонную последовательность для праймера, разработанную веб-инструментом Primer 3. Возьмите одну 10-сантиметровую чашку, содержащую около 5 миллионов пролиферирующих клеток миобластов C2C12 и одну четырехдневную дифференцированную миотубу C2C12 для выделения РНК.Вымойте ячейки 10 миллилитрами 1X PBS три раза и выбросьте PBS с помощью пипетки. Добавьте один миллилитр реагента изоляции РНК и лизируйте клетки путем энергичного пипетирования. Затем добавьте 200 микролитров хлороформа и вихря в течение 15 секунд.Центрифугируйте трубку при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут при 12 000 г. Возьмите 400 микролитров верхнего водного слоя, загрузите ее на столб кремнезема и центрифугу в течение одной минуты при 12 000 г при комнатной температуре. Проведите поток в новую трубку и добавьте 600 микролитров 100% этанола. Добавьте 20 микролитров магнитных шариков кремнезема и поместите трубку на термомикшер, установленный при 25 градусах Цельсия и 1 200 оборотах в минуту в течение пяти минут.Затем поместите трубку на магнитную подставку на 30 секунд или до тех пор, пока раствор не станет прозрачным. Повторное суспендирование магнитных шариков кремнезема в 500 микролитрах промывочного буфера, содержащего 90% этанола. Поместив трубку на магнитную подставку на 30 секунд, дайте шарикам осесть к магниту и выбросьте буфер с помощью пипетки.Высушите трубку на воздухе при температуре 50 градусов Цельсия в течение трех минут на термомикшере, держа крышку открытой. Добавьте 20 микролитров воды без нуклеазы и повторно суспендируйте шарики. Соберите растворенную РНК в новую трубку для оценки количества и качества с помощью спектрофотометра.Измерьте концентрацию РНК с помощью спектрофотометра и возьмите один микрограмм РНК для синтеза кДНК. Смешайте один микрограмм общей РНК с одним микролитром смеси dNTP, четырьмя микролитрами буфера 5X обратной транскриптазы, двумя микролитрами 10X обратного транскриптазного случайного праймера, 0,25 микролитра фермента обратной транскриптазы и 0,5 микролитра ингибитора РНКазы. Восполните объем до 20 микролитров, используя воду без нуклеазы.Поместите трубку при 25 градусах Цельсия на 10 минут, а затем 50 градусов Цельсия в течение одного часа. Затем поместите трубку при 85 градусах Цельсия в течение пяти минут, чтобы инактивировать фермент. Настройте реакцию ПЦР 22 микролитров в 0,2-миллилитровых ПЦР-трубках или полосках, а также отрицательную контрольную трубку и нешаблонные контрольные трубки.Добавьте 11 микролитров мастер-смеси dd-PCR, 5,5 микролитра циркулярной РНК-специфической прямой и обратной праймерной смеси одной микромолярной концентрации и 5,5 микролитра воды без нуклеазы для создания реакционных трубок NTC. Аналогичным образом, чтобы настроить пробирки, добавьте 11 микролитров мастер-смеси dd-PCR, 5,5 микролитра круговой РНК-специфической прямой и обратной праймерной смеси одной микромолярной концентрации и 5,5 микролитра кДНК. Для генерации капель перенесите 20 микролитров ПЦР-смеси из 0,2-миллилитровых ПЦР-пробирок в пробоотборники картриджа генератора капель.Добавьте 70 микролитров масла для генерации капель в нефтяные скважины картриджа генератора капель осторожно, используя пипетку. Накройте картридж генератора капель резиновой прокладкой и поместите его в машину генератора капель, чтобы получить образец смеси капель масла, образующийся в капельных колодцах картриджа. Для амплификации ПЦР перенесите 40 микролитров смеси капель образца масла из капельных колодцев картриджа генератора капель на 96-луночную ПЦР-пластину с помощью пипетки.Запечатайте 96-луночную ПЦР-пластину с помощью герметика из алюминиевой фольги. Поместите его в блок пластинчатого герметика, предварительно нагретый при 180 градусах Цельсия, и нажмите на уплотнение для герметизации пластины ПЦР. Затем поместите пластину в термоциклер dd-PCR и установите температуру крышки на 105 градусов Цельсия и скорость рампы до двух градусов Цельсия в секунду.После того, как ПЦР закончится, поместите пластину на аппарат для счетчика капель dd-PCR с держателем пластины в правильном положении для подсчета капель. Откройте программное обеспечение для анализа капель и настройте запуск, введя информацию образца. Нажмите кнопку анализа, чтобы проанализировать данные после завершения считывания капель.Затем нажмите кнопку 1D Amplitude, чтобы увидеть положительные и отрицательные капли. Чтобы отделить положительные капли от отрицательных капель, поставьте общую пороговую линию для всех образцов с одной и той же мишенью. Нажмите кнопку экспорта, чтобы экспортировать данные круговой РНК в виде CSV-файла.Экспортированные данные показывают количество круговых РНК, присутствующих в каждом образце. Вручную рассчитайте количество круговых РНК в каждом образце на нанограмм РНК, учитывая общее количество кДНК, используемой в каждой реакции. Анализ данных с помощью программного обеспечения QuantaSoft показан здесь.Все образцы, кроме MT1, показали более 12 000 капель. Поскольку общее количество капель в МТ1 было низким, эта выборка не рассматривалась для окончательного анализа данных. Интересно, что наблюдалась явная разница в структуре экспрессии Circ B и C2 в четырехдневном дифференцированном состоянии миотруб по сравнению с клетками миобластов.Анализ обилия Circ B и C2 с точки зрения числа копий показал, что три реплики миобластов C2C12 имели 76,8, 67 и 46 копий на нанограмм РНК, в то время как два образца миотрубок имели 558 и 610 копий на нанограмм РНК. Данные в гистограмме представляют собой среднее плюс минус стандартное отклонение от двух до трех биологических реплик. ddPCR является одним из самых передовых методов измерения точной дифференциальной экспрессии целевой круговой РНК.Этот метод станет важным инструментом для ускорения исследований и диагностики циркулярной РНК в следующем году.

Research

JoVE Journal

Biology

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

Профилирование Предварительно микро-РНК и микроРНК с использованием количественных ПЦР в реальном времени (КПЦР) Массивы

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Rapid PCR Thermocycling using Microscale Thermal Convection

Быстрые ПЦР термоциклирования использованием Микромасштабные тепловой конвекции

Many molecular biology assays depend in some way on the polymerase chain reaction (PCR) to amplify an initially dilute target DNA sample to a detectable ...

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

Выделение малых некодирующих РНК из сыворотки крови человека

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Простой Массовая считывания цифровых нуклеиновых кислот количественного определения Анализы

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

Используя цифровой капли ПЦР для обнаружения гена BRAF V600E Мутации в формалине фиксированной в парафин Ссылка на стандарт клеточных линиях

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

Using Digital Image Correlation to Characterize Local Strains on Vascular Tissue Specimens

Использование цифровой корреляции изображения для характеристики локальных деформаций на сосудистую ткань образцов

Characterization of the mechanical behavior of biological and engineered soft tissues is a central component of fundamental biomedical research and ...

Genome-wide Purification of Extrachromosomal Circular DNA from Eukaryotic Cells

Генома Очистка экстрахромосомального кольцевой ДНК из эукариотических клеток

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs ...

Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR

Абсолютная количественная оценка уровня микроРНК в плазме у обезьян Cynomolgus, используя количественные реального времени обратной транскрипции PCR

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This ...

Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit

Протокол изоляции капелька быстрого липидов используя налаженные органеллы изоляции комплект

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral ...

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

Двухэтапные протоколы капельной цифровой ПЦР с обратной транскрипцией для обнаружения и количественного определения SARS-CoV-2

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...