Name: quantification of circular rnas using digital droplet pcr
Uploaded: 2022-09-16T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por fondos intramuros del Instituto de Ciencias de la Vida, la beca de investigación DBT (BT / PR27622 / MED / 30/1961 / 2018) y la beca Wellcome Trust / DBT India Alliance [IA / I / 18/2 / 504017] otorgada a Amaresh C. Panda. Agradecemos a otros miembros del laboratorio por corregir el artículo.

El ARN es sensible a las RNasas; por lo tanto, todos los reactivos, instrumentos y espacios de trabajo deben estar libres de RNasa y manejarse con cuidado.
1. Diseño divergente del cebador para circRNA (ver Figura 1)
<ol><li>Recupere la secuencia madura de los datos de anotación de circRNA utilizando BEDTools o desde el navegador del genoma UCSC uniendo la secuencia de exón/intrón presente entre las coordenadas de unión del...

<ol>
	<li>Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+the+predominant+transcript+isoform+from+hundreds+of+human+genes+in+diverse+cell+types.">Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types.</a> PLoS One. 7 (2), 30733 (2012).</li><li>Chen, L. L., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+circRNA+biogenesis.">Regulation of circRNA biogenesis.</a> RNA Biology. 12 (4), 381-388 (2015).</li><li>Kristensen, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biogenesis,+biology+and+characterization+of+circular+RNAs.">The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs.</a> Nature Reviews Genetics. 20 (11), 675-691 (2019).</li><li>Chen, X., Zhou, M., Yant, L., Huang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNA+in+disease:+Basic+properties+and+biomedical+relevance.">Circular RNA in disease: Basic properties and biomedical relevance.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. , (2022).</li><li>Sinha, T., Panigrahi, C., Das, D., Chandra Panda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNA+translation,+a+path+to+hidden+proteome.">Circular RNA translation, a path to hidden proteome.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 13 (1), 1685 (2022).</li><li>Panda, A. C., Xiao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+Act+as+miRNA+Sponges.">Circular RNAs Act as miRNA Sponges.</a> Circular RNAs: Biogenesis and Functions. , 67-79 (2018).</li><li>Das, A., Sinha, T., Shyamal, S., Panda, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+role+of+circular+RNA-protein+interactions.">Emerging role of circular RNA-protein interactions.</a> Non-Coding RNA. 7 (3), 48 (2021).</li><li>Verduci, L., Tarcitano, E., Strano, S., Yarden, Y., Blandino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CircRNAs:+Role+in+human+diseases+and+potential+use+as+biomarkers.">CircRNAs: Role in human diseases and potential use as biomarkers.</a> Cell Death &amp; Disease. 12 (5), 468 (2021).</li><li>Pandey, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+analysis+of+circular+RNAs.">Methods for analysis of circular RNAs.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 11 (1), 1566 (2020).</li><li>Das, A., Das, D., Panda, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+circular+RNAs+by+PCR.">Validation of circular RNAs by PCR.</a> PCR Primer Design. Methods in Molecular Biology. 2392, 103-114 (2022).</li><li>Jeck, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+abundant,+conserved,+and+associated+with+ALU+repeats.">Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats.</a> RNA. 19 (2), 141-157 (2013).</li><li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+droplet+digital+polymerase+chain+reaction+format+for+DNA+copy+number+quantification.">Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification.</a> Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).</li><li>Hayden, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+droplet+digital+PCR+to+real-time+PCR+for+quantitative+detection+of+cytomegalovirus.">Comparison of droplet digital PCR to real-time PCR for quantitative detection of cytomegalovirus.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (2), 540-546 (2013).</li><li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets:+From+variable+nonsense+to+publication+quality+data.">Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: From variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7, 2409 (2017).</li><li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number.">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li><li>Ishak, A., AlRawashdeh, M. M., Esagian, S. M., Nikas, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic,+prognostic,+and+therapeutic+value+of+droplet+digital+PCR+(ddPCR)+in+COVID-19+patients:+A+systematic+review.">Diagnostic, prognostic, and therapeutic value of droplet digital PCR (ddPCR) in COVID-19 patients: A systematic review.</a> Journal of Clinical Medicine. 10 (23), 5712 (2021).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+droplet+digital+PCR+to+detect+the+pathogens+of+infectious+diseases.">Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases.</a> Bioscience Reports. 38 (6), (2018).</li><li>Lee, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+UCSC+genome+browser+database:+2022+update.">The UCSC genome browser database: 2022 update.</a> Nucleic Acids Research. 50, 1115-1122 (2022).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+A+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li><li>Untergasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer3--new+capabilities+and+interfaces.">Primer3--new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Research. 40 (15), 115 (2012).</li><li>Das, A., Das, D., Das, A., Panda, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quick+and+cost-effective+method+for+DNA-free+total+RNA+isolation+using+magnetic+silica+beads.">A quick and cost-effective method for DNA-free total RNA isolation using magnetic silica beads.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Oberacker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Synthesis+of+Functionalized+Paramagnetic+Beads+for+Nucleic+Acid+Purification+and+Manipulation.">Simple Synthesis of Functionalized Paramagnetic Beads for Nucleic Acid Purification and Manipulation.</a> Bio-protocol. 9 (20), 3394 (2019).</li><li>Ra&#269;ki, N., Dreo, T., Gutierrez-Aguirre, I., Blejec, A., Ravnikar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+transcriptase+droplet+digital+PCR+shows+high+resilience+to+PCR+inhibitors+from+plant,+soil+and+water+samples.">Reverse transcriptase droplet digital PCR shows high resilience to PCR inhibitors from plant, soil and water samples.</a> Plant Methods. 10 (1), 42 (2014).</li><li>Taylor, S. C., Carbonneau, J., Shelton, D. N., Boivin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+droplet+digital+PCR+from+RNA+and+DNA+extracts+with+direct+comparison+to+RT-qPCR:+Clinical+implications+for+quantification+of+Oseltamivir-resistant+subpopulations.">Optimization of droplet digital PCR from RNA and DNA extracts with direct comparison to RT-qPCR: Clinical implications for quantification of Oseltamivir-resistant subpopulations.</a> Journal of Virological Methods. 224, 58-66 (2015).</li></ol>

La investigación de CircRNA ha crecido en la última década con el descubrimiento de tecnologías de secuenciación de alto rendimiento. Como resultado, se ha considerado una molécula potencial para futuras terapias de ARN. Además, se sabe que actúa como biomarcador en varias enfermedades, incluyendo cáncer y enfermedades cardiovasculares 4,8. Sin embargo, la identificación del circRNA es complicada debido a su baja abundancia y a que solo tiene una secuen...

Los avances recientes en las tecnologías de secuenciación de ARN y los nuevos algoritmos computacionales han descubierto un nuevo miembro de la creciente familia de ARN no codificantes, llamado ARN circular (circRNA)1. Como su nombre indica, los circRNAs son una familia de moléculas de ARN monocatenario sin extremos libres. Están formados por empalme no canónico de cabeza a cola llamado empalme posterior, donde el sitio aceptor de empalme aguas arriba se une covalentemente con el sitio donante de empalme aguas abajo para formar un círculo de ARN estable 1,2. Este proceso podría estar mediado por varios factores, incluyendo elementos repetitivos de Alu invertidos presentes en las aguas arriba y aguas abajo de los exones circularizados, o puede estar mediado por algunos factores de empalme o proteínas de unión a ARN (RBPs)2,3. Los ARN circulares generados exclusivamente a partir de la secuencia exónica o intrónica se clasifican como circARN exónicos y ARN intrónicos circulares o ci-ARN, mientras que algunos circARN exónicos retienen el intrón y se denominan circARN exón-intrón (EIcircRNAs)3,4. Las funciones de los circRNAs son multifacéticas, incluyendo la esponja de miRNA y/o RBP, la regulación de la transcripción y la regulación de la función celular traduciendo en péptidos 3,5,6,7. Varios relatos han destacado la importancia de los circRNAs en diversas enfermedades y procesos fisiológicos8. Además, los patrones de expresión específicos del tejido y la resistencia a la digestión de la exonucleasa lo convierten en un biomarcador funcional para el diagnóstico de enfermedades y también puede ser utilizado como una diana terapéutica adecuada8. Teniendo en cuenta su importancia en la regulación de la salud y las enfermedades, la cuantificación precisa de la expresión de circRNA es la necesidad del momento.
Se han desarrollado varios métodos bioquímicos para cuantificar circRNAs en muestras biológicas9. Uno de los métodos más convenientes y ampliamente aceptados para la cuantificación de circRNA es la transcripción inversa seguida de la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (RT-qPCR) utilizando pares de cebadores divergentes10. Sin embargo, la mayoría de los circRNAs están en baja abundancia en comparación con los mRNAs lineales, lo que hace que sea difícil cuantificarlos11. Para superar este problema, buscamos usar PCR digital de gotas (dd-PCR) para cuantificar el número de circRNAs en una muestra dada con precisión. La dd-PCR es una tecnología avanzada de PCR que sigue el principio de microfluídica; genera múltiples gotitas acuosas en aceite, y la PCR ocurre en cada gota como una reacción individual12. La reacción ocurre en gotitas individuales y se analiza utilizando un lector de gotas, que da el número de gotitas positivas o negativas para el gen de interés12. Es la técnica más sensible para cuantificar con precisión un gen de interés, incluso si solo hay una copia única en una muestra determinada. La disminución de la sensibilidad hacia los inhibidores, una mejor precisión y la omisión del gen de referencia para la cuantificación lo hacen más ventajoso que la qPCR convencional13,14,15. Ha sido ampliamente utilizado como herramienta de investigación y diagnóstico para la cuantificación absoluta de un gen de interés16,17. Aquí, describimos el protocolo detallado de dd-PCR para la cuantificación de circRNA en la diferenciación de miotubos C2C12 de ratón y mioblastos C2C12 de ratón proliferantes utilizando cebadores divergentes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >1.5 ml microcentifuge tube</td>
			<td >Tarson</td>
			<td >500010</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.2 ml tube strips with cap</td>
			<td >Tarson</td>
			<td >610020, 510073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filter Tips</td>
			<td >Tarson</td>
			<td >528104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >10977023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell scrapper</td>
			<td >HiMedia</td>
			<td >TCP223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chloroform</td>
			<td >SRL</td>
			<td >96764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA diluent</td>
			<td >HiMedia</td>
			<td >MB228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Random primers</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >48190011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >dNTP set</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >R0181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Murine RNase inhibitor</td>
			<td >NEB</td>
			<td >M0314S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Maxima reverse transcriptase</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >EP0743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 dd-PCR Evagreen Supermix</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Droplet generation oil for Evagreen</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1814040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DG8 Cartridges and Gaskets</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DG8 Cartridge holder</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1863051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 Droplet Generator</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ddPCR 96-Well Plates</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >12001925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PX1 PCR Plate Sealer</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1814000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C1000 Touch Thermal Cycler with 96&#8211;Deep Well Reaction Module</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1851197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 Droplet Reader</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Quantasoft Software</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silica column</td>
			<td >Umbrella Life Science</td>
			<td >38220090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UCSC Genome Browser</td>
			<td ></td>
			<td >https://genome.ucsc.edu/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primer 3</td>
			<td ></td>
			<td >https://primer3.ut.ee/</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of circular rnas using digital droplet pcr

La reacción en cadena de la polimerasa digital (dd-PCR) es uno de los métodos de cuantificación más sensibles; fracciona la reacción en casi 20,000 gotas de agua en aceite, y la PCR ocurre en las gotas individuales. La dd-PCR tiene varias ventajas sobre la qPCR convencional en tiempo real, incluida una mayor precisión en la detección de objetivos de baja abundancia, la omisión de genes de referencia para la cuantificación, la eliminación de réplicas técnicas para muestras y la demostración de una alta resistencia a los inhibidores en las muestras. Recientemente, la dd-PCR se ha convertido en uno de los métodos más populares para cuantificar con precisión el ADN o ARN objetivo para el análisis y diagnóstico de la expresión génica. Los ARN circulares (circRNAs) son una gran familia de moléculas de ARN cerradas covalentemente recientemente descubiertas que carecen de extremos 5' y 3'. Se ha demostrado que regulan la expresión génica actuando como esponjas para proteínas de unión a ARN y microARN. Además, los circRNAs se secretan en los fluidos corporales, y su resistencia a las exonucleasas los hace servir como biomarcadores para el diagnóstico de enfermedades. Este artículo tiene como objetivo mostrar cómo realizar el diseño divergente de cebadores, la extracción de ARN, la síntesis de ADNc y el análisis de dd-PCR para cuantificar con precisión los niveles específicos de ARN circular (circRNA) en las células. En conclusión, demostramos la cuantificación precisa de circRNAs utilizando dd-PCR.

El número absoluto de circRNAs en cada muestra se puede derivar de los datos de dd-PCR exportados. El análisis cuantitativo de PCR en tiempo real sugirió la expresión diferencial de circBnc2 en los miotubos C2C12 diferenciados (datos no mostrados). Aquí, queríamos verificar el número de copias absolutas de circBnc2 en mioblastos y miotubos C2C12 en proliferación. Dado que la expresión de circBnc2 se compara en dos condiciones, es realmente importante procesar todas las muestras para el...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR at JoVE.com

Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR

Este protocolo describe el método detallado de PCR digital de gotas (dd-PCR) para la cuantificación precisa de los niveles de ARN circular (circRNA) en células utilizando cebadores divergentes.

Cuantificación de ARN circulares mediante PCR digital de gotas

Digital droplet polymerase chain reaction (dd-PCR) is one of the most sensitive quantification methods; it fractionates the reaction into nearly 20,000 ...

dd-PCR es un método altamente sensible y preciso para la cuantificación absoluta de ADN o ARN diana. Se ha utilizado para el diagnóstico de enfermedades donde otros métodos convencionales no dan resultados precisos. dd-PCR es la técnica más sensible para detectar moléculas de ácido nucleico muy poco abundantes.A diferencia de la PCR cuantitativa, la dd-PCR no requiere ningún control genético de limpieza para la cuantificación. Debido a su sensibilidad y precisión, la dd-PCR se puede utilizar como una herramienta para el diagnóstico molecular y la investigación que involucra moléculas de ARN poco abundantes como micro ARN y ARN circulares. Antes de usar dd-PCR, se debe realizar RT-PCR o RT-qPCR para confirmar que los cebadores están amplificando sus genes diana sin ninguna amplificación de PCR no específica.Para comenzar, prepare una secuencia de plantilla de PCR de 200 nucleótidos de longitud uniendo los últimos 100 nucleótidos de la longitud total de la secuencia circular de ARN a los primeros 100 nucleótidos de la secuencia circular de ARN. Utilice la secuencia de plantillas para primer, diseñada por la herramienta web Primer 3. Tome un plato de 10 centímetros que contenga aproximadamente 5 millones de células de mioblastos C2C12 proliferantes y un miotubo C2C12 diferenciado de cuatro días para el aislamiento de ARN.Lave las células con 10 mililitros de 1X PBS tres veces y deseche el PBS con una pipeta. Agregue un mililitro de reactivo de aislamiento de ARN y lisar las células mediante un pipeteo vigoroso. Luego, agregue 200 microlitros de cloroformo y vórtice durante 15 segundos.Centrifugar el tubo a cuatro grados centígrados durante 10 minutos a 12, 000 G.Tome 400 microlitros de la capa acuosa superior, cárguelo en una columna de sílice y centrifugar durante un minuto a 12, 000 G a temperatura ambiente. Lleve el flujo a un nuevo tubo y agregue 600 microlitros de etanol al 100%. Agregue 20 microlitros de perlas de sílice magnética y coloque el tubo en un termomezclador, ajustado a 25 grados centígrados y 1, 200 RPM durante cinco minutos.Luego, coloque el tubo en un soporte magnético durante 30 segundos o hasta que la solución se aclare. Resuspenda las perlas de sílice magnéticas en 500 microlitros de tampón de lavado que contiene 90% de etanol. Después de colocar el tubo en el soporte magnético durante 30 segundos, deje que las perlas se asienten hacia el imán y deseche el tampón con una pipeta.Seque el tubo al aire a 50 grados centígrados durante tres minutos en un termomezclador, manteniendo la tapa abierta. Agregue 20 microlitros de agua libre de nucleasas y resuspenda las perlas. Recoja el ARN disuelto en un nuevo tubo para la evaluación de la cantidad y la calidad utilizando un espectrofotómetro.Mida la concentración de ARN usando un espectrofotómetro y tome un microgramo de ARN para la síntesis de ADNc. Mezcle un microgramo de ARN total con un microlitro de mezcla dNTP, cuatro microlitros de tampón de transcriptasa inversa 5X, dos microlitros de cebador aleatorio de transcriptasa inversa 10X, 0.25 microlitros de enzima transcriptasa inversa y 0.5 microlitros de inhibidor de RNasa. Enrasar el volumen a 20 microlitros con agua libre de nucleasas.Coloque el tubo a 25 grados centígrados durante 10 minutos, seguido de 50 grados centígrados durante una hora. Luego coloque el tubo a 85 grados centígrados durante cinco minutos para inactivar la enzima. Configure la reacción de PCR de 22 microlitros en tubos o tiras de PCR de 0,2 mililitros, junto con un tubo de control negativo y tubos de control sin plantilla.Agregue 11 microlitros de mezcla maestra dd-PCR, 5.5 microlitros de mezcla circular de cebador directo e inverso específica de ARN de una concentración micromolar y 5.5 microlitros de agua libre de nucleasas para configurar los tubos de reacción NTC. Del mismo modo, para configurar los tubos de reacción de prueba, agregue 11 microlitros de mezcla maestra dd-PCR, 5.5 microlitros de mezcla de cebador directo e inverso específica de ARN circular de una concentración micromolar y 5.5 microlitros de ADNc. Para la generación de gotas, transfiera 20 microlitros de la mezcla de PCR de tubos de PCR de 0,2 mililitros a los pocillos de muestra del cartucho generador de gotas.Agregue 70 microlitros de aceite de generación de gotas a los pozos de petróleo del cartucho generador de gotas con cuidado, usando una pipeta. Cubra el cartucho generador de gotas con una junta de goma y colóquelo en la máquina generadora de gotas para obtener la mezcla de gotas de aceite de muestra, generada en los pocillos de gotas del cartucho. Para la amplificación por PCR, transfiera 40 microlitros de la mezcla de gotas de aceite de muestra de los pocillos de gotas del cartucho generador de gotas a una placa de PCR de 96 pocillos utilizando una pipeta.Selle la placa de PCR de 96 pocillos con el sellador de papel de aluminio. Colóquelo en el bloque de la máquina selladora de placas, precalentado a 180 grados centígrados, y haga clic en el sello para sellar la placa de PCR. Luego, coloque la placa en el termociclador dd-PCR y ajuste la temperatura de la tapa a 105 grados centígrados y una velocidad de rampa a dos grados centígrados por segundo.Una vez finalizada la PCR, coloque la placa en la máquina contadora de gotas dd-PCR con el soporte de la placa en la posición correcta para contar las gotas. Abra el software de análisis de gotas y configure la ejecución ingresando la información de la muestra. Haga clic en el botón analizar para analizar los datos después de completar la lectura de gotas.Luego, haga clic en el botón Amplitud 1D para ver las gotas positivas y negativas. Para separar las gotas positivas de las negativas, coloque una línea de umbral común para todas las muestras con el mismo objetivo. Haga clic en el botón de exportación para exportar los datos de recuentos circulares de ARN como un archivo csv.Los datos exportados muestran el número de ARN circulares presentes en cada muestra. Calcule manualmente el número de ARN circulares en cada muestra por nanogramo de ARN considerando la cantidad total de ADNc utilizado en cada reacción. El análisis de datos utilizando el software QuantaSoft se muestra aquí.Todas las muestras, excepto MT1, mostraron más de 12, 000 recuentos de gotas. Dado que el recuento total de gotitas fue bajo en MT1, esta muestra no se consideró para el análisis final de los datos. Curiosamente, hubo una clara diferencia en el patrón de expresión de Circ B y C2 en la condición de miotubo diferenciada de cuatro días en comparación con las células de mioblastos.El análisis de la abundancia de Circ B y C2 en términos de número de copias, indicó que las tres réplicas de mioblastos C2C12 tenían 76.8, 67 y 46 copias por nanogramo de ARN, mientras que las dos muestras de miotubos tenían 558 y 610 copias por nanogramo de ARN. Los datos en el gráfico de barras representan la media más menos la desviación estándar de dos a tres réplicas biológicas. ddPCR es uno de los métodos más avanzados para medir la expresión diferencial precisa del ARN circular objetivo.Este método será una herramienta esencial para acelerar la investigación circular de ARN y las industrias de diagnóstico en el próximo año.

Research

JoVE Journal

Biology

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

Perfiles de Pre-micro ARN y microRNAs utilizando cuantitativa en tiempo real PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Investigación

Biología

Rapid PCR Thermocycling using Microscale Thermal Convection

PCR rápido ciclo térmico con convección térmica microescala

Many molecular biology assays depend in some way on the polymerase chain reaction (PCR) to amplify an initially dilute target DNA sample to a detectable ...

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

El aislamiento de los pequeños RNAs no codificantes de suero humano

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Lectura granel simple de Digital ácidos nucleicos Cuantificación ensayos

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

El empleo de la gotita de PCR digital para detectar mutaciones BRAF V600E en embebidos en parafina líneas celulares de referencia estándar fijos-formalina

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

Using Digital Image Correlation to Characterize Local Strains on Vascular Tissue Specimens

El uso de Correlación Digital de Imágenes para caracterizar cepas locales en muestras de tejido vascular

Characterization of the mechanical behavior of biological and engineered soft tissues is a central component of fundamental biomedical research and ...

Genome-wide Purification of Extrachromosomal Circular DNA from Eukaryotic Cells

La purificación de todo el genoma de ADN circular Extracromosómica a partir de células eucariotas

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs ...

Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR

Cuantificación absoluta de Plasma niveles de microARN en monos cangrejeros, mediante transcripción reversa en tiempo real cuantitativa PCR

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This ...

Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit

Lipídico rápido gota protocolo de aislamiento utilizando un Kit de aislamiento de organelas bien establecidas

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral ...

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

Protocolos de PCR digital de gotas con transcripción inversa de dos pasos para la detección y cuantificación del SARS-CoV-2

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...