Name: quantification of circular rnas using digital droplet pcr
Uploaded: 2022-09-16T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR at JoVE.com

Detta arbete stöddes av intramural finansiering från Institute of Life Sciences, DBT-forskningsbidraget (BT/PR27622/MED/30/1961/2018) och Wellcome Trust/DBT India Alliance Fellowship [IA/I/18/2/504017] som tilldelades Amaresh C. Panda. Vi tackar andra labbmedlemmar för korrekturläsning av artikeln.

RNA är känsligt för RNaser; Därför bör alla reagenser, instrument och arbetsytor vara RNase-fria och hanteras med försiktighet.
1. Avvikande primerdesign för circRNA (se figur 1)
<ol><li>Hämta den mogna sekvensen från circRNA-annoteringsdata med BEDTools eller från UCSC-genomwebbläsaren genom att gå med i exon / intron-sekvensen som finns mellan backsplice-korsningskoordinaterna18,19</su...

<ol>
	<li>Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+the+predominant+transcript+isoform+from+hundreds+of+human+genes+in+diverse+cell+types.">Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types.</a> PLoS One. 7 (2), 30733 (2012).</li><li>Chen, L. L., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+circRNA+biogenesis.">Regulation of circRNA biogenesis.</a> RNA Biology. 12 (4), 381-388 (2015).</li><li>Kristensen, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biogenesis,+biology+and+characterization+of+circular+RNAs.">The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs.</a> Nature Reviews Genetics. 20 (11), 675-691 (2019).</li><li>Chen, X., Zhou, M., Yant, L., Huang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNA+in+disease:+Basic+properties+and+biomedical+relevance.">Circular RNA in disease: Basic properties and biomedical relevance.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. , (2022).</li><li>Sinha, T., Panigrahi, C., Das, D., Chandra Panda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNA+translation,+a+path+to+hidden+proteome.">Circular RNA translation, a path to hidden proteome.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 13 (1), 1685 (2022).</li><li>Panda, A. C., Xiao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+Act+as+miRNA+Sponges.">Circular RNAs Act as miRNA Sponges.</a> Circular RNAs: Biogenesis and Functions. , 67-79 (2018).</li><li>Das, A., Sinha, T., Shyamal, S., Panda, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+role+of+circular+RNA-protein+interactions.">Emerging role of circular RNA-protein interactions.</a> Non-Coding RNA. 7 (3), 48 (2021).</li><li>Verduci, L., Tarcitano, E., Strano, S., Yarden, Y., Blandino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CircRNAs:+Role+in+human+diseases+and+potential+use+as+biomarkers.">CircRNAs: Role in human diseases and potential use as biomarkers.</a> Cell Death &amp; Disease. 12 (5), 468 (2021).</li><li>Pandey, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+analysis+of+circular+RNAs.">Methods for analysis of circular RNAs.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 11 (1), 1566 (2020).</li><li>Das, A., Das, D., Panda, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+circular+RNAs+by+PCR.">Validation of circular RNAs by PCR.</a> PCR Primer Design. Methods in Molecular Biology. 2392, 103-114 (2022).</li><li>Jeck, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+abundant,+conserved,+and+associated+with+ALU+repeats.">Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats.</a> RNA. 19 (2), 141-157 (2013).</li><li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+droplet+digital+polymerase+chain+reaction+format+for+DNA+copy+number+quantification.">Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification.</a> Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).</li><li>Hayden, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+droplet+digital+PCR+to+real-time+PCR+for+quantitative+detection+of+cytomegalovirus.">Comparison of droplet digital PCR to real-time PCR for quantitative detection of cytomegalovirus.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (2), 540-546 (2013).</li><li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets:+From+variable+nonsense+to+publication+quality+data.">Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: From variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7, 2409 (2017).</li><li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number.">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li><li>Ishak, A., AlRawashdeh, M. M., Esagian, S. M., Nikas, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic,+prognostic,+and+therapeutic+value+of+droplet+digital+PCR+(ddPCR)+in+COVID-19+patients:+A+systematic+review.">Diagnostic, prognostic, and therapeutic value of droplet digital PCR (ddPCR) in COVID-19 patients: A systematic review.</a> Journal of Clinical Medicine. 10 (23), 5712 (2021).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+droplet+digital+PCR+to+detect+the+pathogens+of+infectious+diseases.">Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases.</a> Bioscience Reports. 38 (6), (2018).</li><li>Lee, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+UCSC+genome+browser+database:+2022+update.">The UCSC genome browser database: 2022 update.</a> Nucleic Acids Research. 50, 1115-1122 (2022).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+A+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li><li>Untergasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer3--new+capabilities+and+interfaces.">Primer3--new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Research. 40 (15), 115 (2012).</li><li>Das, A., Das, D., Das, A., Panda, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quick+and+cost-effective+method+for+DNA-free+total+RNA+isolation+using+magnetic+silica+beads.">A quick and cost-effective method for DNA-free total RNA isolation using magnetic silica beads.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Oberacker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Synthesis+of+Functionalized+Paramagnetic+Beads+for+Nucleic+Acid+Purification+and+Manipulation.">Simple Synthesis of Functionalized Paramagnetic Beads for Nucleic Acid Purification and Manipulation.</a> Bio-protocol. 9 (20), 3394 (2019).</li><li>Ra&#269;ki, N., Dreo, T., Gutierrez-Aguirre, I., Blejec, A., Ravnikar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+transcriptase+droplet+digital+PCR+shows+high+resilience+to+PCR+inhibitors+from+plant,+soil+and+water+samples.">Reverse transcriptase droplet digital PCR shows high resilience to PCR inhibitors from plant, soil and water samples.</a> Plant Methods. 10 (1), 42 (2014).</li><li>Taylor, S. C., Carbonneau, J., Shelton, D. N., Boivin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+droplet+digital+PCR+from+RNA+and+DNA+extracts+with+direct+comparison+to+RT-qPCR:+Clinical+implications+for+quantification+of+Oseltamivir-resistant+subpopulations.">Optimization of droplet digital PCR from RNA and DNA extracts with direct comparison to RT-qPCR: Clinical implications for quantification of Oseltamivir-resistant subpopulations.</a> Journal of Virological Methods. 224, 58-66 (2015).</li></ol>

CircRNA-forskningen har vuxit under det senaste decenniet med upptäckten av sekvenseringsteknik med hög genomströmning. Som ett resultat har det ansetts vara en potentiell molekyl för framtida RNA-terapier. Dessutom är det känt att fungera som en biomarkör vid flera sjukdomar, inklusive cancer och hjärt-kärlsjukdomar 4,8. Identifieringen av circRNA är dock knepig på grund av dess låga överflöd och den har bara en specifik backsplice-korsningssekvens...

De senaste framstegen inom RNA-sekvenseringsteknik och nya beräkningsalgoritmer har upptäckt en ny medlem av den växande familjen av icke-kodande RNA, kallat cirkulärt RNA (circRNA)1. Som namnet antyder är circRNA en familj av enkelsträngade RNA-molekyler utan fria ändar. De bildas av icke-kanonisk head-to-tail-skarvning som kallas back-skarvning, där uppströms skarvacceptorplatsen förenas kovalent med nedströms skarvdonatorstället för att bilda en stabil RNA-cirkel 1,2. Denna process kan förmedlas av flera faktorer, inklusive inverterade Alu-repetitiva element som finns i uppströms och nedströms cirkulära exoner, eller kan förmedlas av vissa skarvningsfaktorer eller RNA-bindande proteiner (RBP)2,3. Cirkulära RNA som genereras uteslutande från den exoniska eller introniska sekvensen klassificeras som exoniskt circRNA och cirkulära introniska RNA eller ci-RNA, medan vissa exoniska circRNA behåller intron och kallas exon-intron circRNA (EIcircRNA)3,4. CircRNA: s funktioner är mångfacetterade, inklusive sponging miRNA och / eller RBP, reglering av transkription och reglering av cellulär funktion genom att översätta till peptider 3,5,6,7. Flera rapporter har belyst betydelsen av circRNA i olika sjukdomar och fysiologiska processer8. Dessutom gör vävnadsspecifika uttrycksmönster och resistens mot exonukleassmältning det till en funktionell biomarkör för sjukdomsdiagnos och det kan också användas som ett lämpligt terapeutiskt mål8. Med tanke på dess betydelse för att reglera hälsa och sjukdomar är den exakta kvantifieringen av circRNA-uttryck behovet av timmen.
Flera biokemiska metoder har utvecklats för att kvantifiera circRNA i biologiska prover9. En av de mest praktiska och allmänt accepterade metoderna för circRNA-kvantifiering är omvänd transkription följt av kvantitativ polymeraskedjereaktion (RT-qPCR) med användning av divergerande primerpar10. Majoriteten av circRNA är dock i låg överflöd jämfört med linjära mRNA, vilket gör det utmanande att kvantifiera dem11. För att lösa detta problem försökte vi använda digital dropp-PCR (dd-PCR) för att kvantifiera antalet circRNA i ett givet prov exakt. dd-PCR är en avancerad PCR-teknik som följer mikrofluidikprincipen; det genererar flera vattenhaltiga droppar i olja, och PCR förekommer i varje droppe som en individuell reaktion12. Reaktionen sker i enskilda droppar och analyseras med hjälp av en droppläsare, vilket ger antalet positiva eller negativa droppar för genen av intresse12. Det är den mest känsliga tekniken för att exakt kvantifiera en gen av intresse, även om det bara finns en enda kopia i ett givet prov. Minskad känslighet för hämmare, bättre precision och utelämnande av referensgenen för kvantifiering gör den mer fördelaktig än konventionell qPCR13,14,15. Det har använts i stor utsträckning som ett forsknings- och diagnostiskt verktyg för absolut kvantifiering av en gen av intresse16,17. Här beskriver vi det detaljerade dd-PCR-protokollet för circRNA-kvantifiering vid differentiering av mus C2C12-myorör och prolifererande mus C2C12-myoblaster med hjälp av divergerande primers.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >1.5 ml microcentifuge tube</td>
			<td >Tarson</td>
			<td >500010</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.2 ml tube strips with cap</td>
			<td >Tarson</td>
			<td >610020, 510073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filter Tips</td>
			<td >Tarson</td>
			<td >528104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >10977023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell scrapper</td>
			<td >HiMedia</td>
			<td >TCP223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chloroform</td>
			<td >SRL</td>
			<td >96764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA diluent</td>
			<td >HiMedia</td>
			<td >MB228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Random primers</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >48190011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >dNTP set</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >R0181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Murine RNase inhibitor</td>
			<td >NEB</td>
			<td >M0314S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Maxima reverse transcriptase</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >EP0743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 dd-PCR Evagreen Supermix</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Droplet generation oil for Evagreen</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1814040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DG8 Cartridges and Gaskets</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DG8 Cartridge holder</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1863051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 Droplet Generator</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ddPCR 96-Well Plates</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >12001925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PX1 PCR Plate Sealer</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1814000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C1000 Touch Thermal Cycler with 96&#8211;Deep Well Reaction Module</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1851197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 Droplet Reader</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Quantasoft Software</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silica column</td>
			<td >Umbrella Life Science</td>
			<td >38220090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UCSC Genome Browser</td>
			<td ></td>
			<td >https://genome.ucsc.edu/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primer 3</td>
			<td ></td>
			<td >https://primer3.ut.ee/</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of circular rnas using digital droplet pcr

Digital dropppolymeraskedjereaktion (dd-PCR) är en av de mest känsliga kvantifieringsmetoderna; det fraktionerar reaktionen i nästan 20 000 vatten-i-oljedroppar, och PCR förekommer i de enskilda dropparna. dd-PCR har flera fördelar jämfört med konventionell qPCR i realtid, inklusive ökad noggrannhet vid detektering av mål med låg förekomst, utelämnande av referensgener för kvantifiering, eliminering av tekniska replikat för prover och visning av hög motståndskraft mot hämmare i proverna. Nyligen har dd-PCR blivit en av de mest populära metoderna för att exakt kvantifiera mål-DNA eller RNA för genuttrycksanalys och diagnostik. Cirkulära RNA (circRNA) är en stor familj av nyligen upptäckta kovalent slutna RNA-molekyler som saknar 5 'och 3' ändar. De har visat sig reglera genuttryck genom att fungera som svampar för RNA-bindande proteiner och mikroRNA. Dessutom utsöndras circRNA i kroppsvätskor, och deras motståndskraft mot exonukleas gör att de fungerar som biomarkörer för sjukdomsdiagnos. Denna artikel syftar till att visa hur man utför divergerande primerdesign, RNA-extraktion, cDNA-syntes och dd-PCR-analys för att exakt kvantifiera specifika cirkulära RNA (circRNA) nivåer i celler. Sammanfattningsvis demonstrerar vi den exakta kvantifieringen av circRNA med hjälp av dd-PCR.

Det absoluta antalet circRNA i varje prov kan härledas från exporterade dd-PCR-data. Kvantitativ PCR-analys i realtid föreslog differentiellt uttryck av circBnc2 i de differentierade C2C12-myorören (data visas inte). Här ville vi kontrollera det absoluta kopieringsnumret för circBnc2 i prolifererande C2C12-myoblaster och myotubes. Eftersom uttrycket av circBnc2 jämförs under två förhållanden är det verkligen viktigt att bearbeta alla prover för RNA-isolering, cDNA-syntes och PCR sa...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR at JoVE.com

Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR

Detta protokoll beskriver den detaljerade metoden för digital dropp-PCR (dd-PCR) för exakt kvantifiering av cirkulära RNA -nivåer (circRNA) i celler med hjälp av divergerande primers.

Kvantifiering av cirkulära RNA med hjälp av digital dropp-PCR

Digital droplet polymerase chain reaction (dd-PCR) is one of the most sensitive quantification methods; it fractionates the reaction into nearly 20,000 ...

dd-PCR är en mycket känslig och exakt metod för absolut kvantifiering av mål-DNA eller RNA. Det har använts för sjukdomsdiagnos där andra konventionella metoder inte ger exakta resultat. dd-PCR är den mest känsliga tekniken för att detektera mycket låga rikliga nukleinsyramolekyler.Till skillnad från kvantitativ PCR kräver dd-PCR ingen genkontroll för hushållning för kvantifiering. På grund av dess känslighet och noggrannhet kan dd-PCR användas som ett verktyg för molekylär diagnostik och forskning som involverar lågrikliga RNA-molekyler som mikro-RNA och cirkulära RNA. Innan man använder dd-PCR bör man utföra RT-PCR eller RT-qPCR för att bekräfta att primers förstärker sina målgener utan någon icke-specifik PCR-förstärkning.För att börja, förbered en PCR-mallsekvens med 200 nukleotider i längd genom att förena de sista 100 nukleotiderna av den totala cirkulära RNA-sekvenslängden till de första 100 nukleotiderna i den cirkulära RNA-sekvensen. Använd mallsekvensen för primer, designad av webbverktyget Primer 3. Ta en 10 centimeter skål som innehåller cirka 5 miljoner prolifererande C2C12-myoblastceller och en fyra dagars differentierad C2C12-myotube för RNA-isolering.Tvätta cellerna med 10 ml 1X PBS tre gånger och kassera PBS med en pipett. Tillsätt en milliliter RNA-isoleringsreagens och lysera cellerna genom kraftig pipettering. Tillsätt sedan 200 mikroliter kloroform och virvel i 15 sekunder.Centrifugera röret vid fyra grader Celsius i 10 minuter vid 12 000 G.Ta 400 mikroliter av det övre vattenhaltiga skiktet, ladda det på en kiseldioxidkolonn och centrifugera i en minut vid 12 000 G vid rumstemperatur. Ta flödet till ett nytt rör och tillsätt 600 mikroliter 100% etanol. Tillsätt 20 mikroliter magnetiska kiseldioxidpärlor och placera röret på en termomixer, inställd på 25 grader Celsius och 1 200 rpm i fem minuter.Placera sedan röret på ett magnetiskt stativ i 30 sekunder eller tills lösningen blir klar. Återsuspendera de magnetiska kiseldioxidpärlorna i 500 mikroliter tvättbuffert innehållande 90% etanol. Efter att ha placerat röret på magnetstativet i 30 sekunder, låt pärlorna sätta sig mot magneten och kassera bufferten med en pipett.Lufttorka röret vid 50 grader Celsius i tre minuter på en termomixer och håll locket öppet. Tillsätt 20 mikroliter nukleasfritt vatten och återsuspendera pärlorna. Samla det upplösta RNA i ett nytt rör för kvantitets- och kvalitetsbedömning med hjälp av en spektrofotometer.Mät RNA-koncentrationen med hjälp av en spektrofotometer och ta ett mikrogram RNA för cDNA-syntes. Blanda ett mikrogram totalt RNA med en mikroliter dNTP-blandning, fyra mikroliter 5X omvänd transkriptasbuffert, två mikroliter 10X omvänd transkriptas slumpmässig primer, 0,25 mikroliter omvänd transkriptasenzym och 0,5 mikroliter RNashämmare. Fyll på volymen till 20 mikroliter med nukleasfritt vatten.Placera röret vid 25 grader Celsius i 10 minuter, följt av 50 grader Celsius i en timme. Placera sedan röret vid 85 grader Celsius i fem minuter för att inaktivera enzymet. Ställ in PCR-reaktionen på 22 mikroliter i 0,2 ml PCR-rör eller remsor, tillsammans med ett negativt kontrollrör och kontrollrör som inte är mallar.Tillsätt 11 mikroliter dd-PCR-masterblandning, 5,5 mikroliter cirkulär RNA-specifik framåt- och bakåtprimerblandning med en mikromolär koncentration och 5,5 mikroliter nukleasfritt vatten för att ställa in NTC-reaktionsrören. På samma sätt, för att ställa in testreaktionsrören, tillsätt 11 mikroliter dd-PCR-masterblandning, 5,5 mikroliter cirkulär RNA-specifik framåt- och bakåtprimerblandning med en mikromolär koncentration och 5,5 mikroliter cDNA. För droppgenereringen, överför 20 mikroliter av PCR-blandningen från 0,2 ml PCR-rör till provbrunnarna i droppgeneratorpatronen.Tillsätt 70 mikroliter droppgenereringsolja till droppgeneratorpatronens oljebrunnar försiktigt med en pipett. Täck droppgeneratorpatronen med en gummipackning och placera den i droppgeneratormaskinen för att få provoljedroppblandningen, genererad i patronens droppbrunnar. För PCR-förstärkning, överför 40 mikroliter av provoljedroppblandningen från droppbrunnarna i droppgeneratorpatronen till en 96-brunns PCR-platta med hjälp av en pipett.Försegla PCR-plattan med 96 brunnar med aluminiumfolieförseglaren. Placera den i plattförseglarens maskinblock, förvärmd vid 180 grader Celsius, och klicka på tätningen för att täta PCR-plattan. Placera sedan plattan i dd-PCR termisk cykler och ställ in locktemperaturen till 105 grader Celsius och en ramphastighet till två grader Celsius per sekund.När PCR är över, placera plattan på dd-PCR-droppräknaren med platthållaren i rätt läge för att räkna dropparna. Öppna droplet-analysprogramvaran och ställ in körningen genom att ange exempelinformationen. Klicka på analysknappen för att analysera data efter avslutad droppläsning.Klicka sedan på 1D-amplitudknappen för att se de positiva och negativa dropparna. För att separera de positiva dropparna från de negativa dropparna, sätt en gemensam tröskellinje för alla prover med samma mål. Klicka på exportknappen för att exportera cirkulärt RNA räknar data som en csv-fil.De exporterade data visar antalet cirkulära RNA som finns i varje prov. Beräkna manuellt antalet cirkulära RNA i varje prov per nanogram RNA genom att ta hänsyn till den totala mängden cDNA som används i varje reaktion. Dataanalysen med QuantaSoft Software visas här.Alla prover utom MT1 visade mer än 12 000 droppantal. Eftersom det totala antalet droppar var lågt i MT1 beaktades inte detta urval för den slutliga dataanalysen. Intressant nog fanns det en tydlig skillnad i uttrycksmönstret för Circ B och C2 i det fyra dagars differentierade myotube-tillståndet jämfört med myoblastcellerna.Analysen av Circ B- och C2-överflöd när det gäller kopieringsnummer indikerade att de tre replikaten av C2C12-myoblaster hade 76,8, 67 och 46 kopior per nanogram RNA, medan de två myotubeproverna hade 558 och 610 kopior per nanogram RNA. Data i stapeldiagrammet representerar medelvärdet plus minus standardavvikelsen för två till tre biologiska replikat. ddPCR är en av de mest avancerade metoderna för att mäta det exakta differentiella uttrycket av målcirkulärt RNA.Denna metod kommer att vara ett viktigt verktyg för att påskynda cirkulär RNA-forskning och diagnostiska industrier under det kommande året.

Research

JoVE Journal

Biology

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

Profilering av Pre-mikro-RNA och mikroRNA hjälp av kvantitativ realtids-PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Rapid PCR Thermocycling using Microscale Thermal Convection

Snabb PCR termocykling med Microscale termisk konvektion

Many molecular biology assays depend in some way on the polymerase chain reaction (PCR) to amplify an initially dilute target DNA sample to a detectable ...

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

Isolering av små icke-kodande RNA från humant serum

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Enkel Bulk Avläsning av digitala Nucleic Acid Kvantifiering Analyser

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

Anställa Digital Droppe PCR för att upptäcka BRAF V600E Mutationer i formalinfixerade paraffininbäddade referensstandard cellinjer

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

Using Digital Image Correlation to Characterize Local Strains on Vascular Tissue Specimens

Med hjälp av digital bild Korrelation att karaktärisera lokala stammar på Kärlvävnadsprover

Characterization of the mechanical behavior of biological and engineered soft tissues is a central component of fundamental biomedical research and ...

Genome-wide Purification of Extrachromosomal Circular DNA from Eukaryotic Cells

Genomvid Rening av extrakromosomala cirkulär DNA från eukaryota celler

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs ...

Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR

Absolut kvantifiering av mikroRNA plasmanivåer hos Cynomolgus-apor använder kvantitativ realtids omvänd Transkription PCR

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This ...

Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit

Snabb Lipid Droplet isolering protokoll använder en väletablerad organell isolering Kit

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral ...

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

Tvåstegs omvänd transkriptionsdroppe digitala PCR-protokoll för SARS-CoV-2-detektering och kvantifiering

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...