Name: quantification of circular rnas using digital droplet pcr
Uploaded: 2022-09-16T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR at JoVE.com

Bu çalışma, Yaşam Bilimleri Enstitüsü'nden intramural fonlar, DBT araştırma hibesi (BT / PR27622 / MED / 30/1961/2018) ve Amaresh C. Panda'ya verilen Wellcome Trust / DBT Hindistan İttifakı Bursu [IA / I / 18 / 2 / 504017] ile desteklenmiştir. Makaleyi düzelttikleri için diğer laboratuvar üyelerine teşekkür ederiz.

RNA RNazlara duyarlıdır; bu nedenle, tüm reaktifler, cihazlar ve çalışma alanları RNase içermeyen olmalı ve dikkatle kullanılmalıdır.
1. SirkRNA için farklı primer tasarım (bkz. Şekil 1)
<ol><li>BEDTools kullanarak circRNA ek açıklama verilerinden veya UCSC genom tarayıcısından, backsplice bağlantı koordinatları18,19 arasında mevcut ekzon / intro...

<ol>
	<li>Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+the+predominant+transcript+isoform+from+hundreds+of+human+genes+in+diverse+cell+types.">Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types.</a> PLoS One. 7 (2), 30733 (2012).</li><li>Chen, L. L., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+circRNA+biogenesis.">Regulation of circRNA biogenesis.</a> RNA Biology. 12 (4), 381-388 (2015).</li><li>Kristensen, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biogenesis,+biology+and+characterization+of+circular+RNAs.">The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs.</a> Nature Reviews Genetics. 20 (11), 675-691 (2019).</li><li>Chen, X., Zhou, M., Yant, L., Huang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNA+in+disease:+Basic+properties+and+biomedical+relevance.">Circular RNA in disease: Basic properties and biomedical relevance.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. , (2022).</li><li>Sinha, T., Panigrahi, C., Das, D., Chandra Panda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNA+translation,+a+path+to+hidden+proteome.">Circular RNA translation, a path to hidden proteome.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 13 (1), 1685 (2022).</li><li>Panda, A. C., Xiao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+Act+as+miRNA+Sponges.">Circular RNAs Act as miRNA Sponges.</a> Circular RNAs: Biogenesis and Functions. , 67-79 (2018).</li><li>Das, A., Sinha, T., Shyamal, S., Panda, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+role+of+circular+RNA-protein+interactions.">Emerging role of circular RNA-protein interactions.</a> Non-Coding RNA. 7 (3), 48 (2021).</li><li>Verduci, L., Tarcitano, E., Strano, S., Yarden, Y., Blandino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CircRNAs:+Role+in+human+diseases+and+potential+use+as+biomarkers.">CircRNAs: Role in human diseases and potential use as biomarkers.</a> Cell Death &amp; Disease. 12 (5), 468 (2021).</li><li>Pandey, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+analysis+of+circular+RNAs.">Methods for analysis of circular RNAs.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 11 (1), 1566 (2020).</li><li>Das, A., Das, D., Panda, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+circular+RNAs+by+PCR.">Validation of circular RNAs by PCR.</a> PCR Primer Design. Methods in Molecular Biology. 2392, 103-114 (2022).</li><li>Jeck, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+abundant,+conserved,+and+associated+with+ALU+repeats.">Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats.</a> RNA. 19 (2), 141-157 (2013).</li><li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+droplet+digital+polymerase+chain+reaction+format+for+DNA+copy+number+quantification.">Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification.</a> Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).</li><li>Hayden, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+droplet+digital+PCR+to+real-time+PCR+for+quantitative+detection+of+cytomegalovirus.">Comparison of droplet digital PCR to real-time PCR for quantitative detection of cytomegalovirus.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (2), 540-546 (2013).</li><li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets:+From+variable+nonsense+to+publication+quality+data.">Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: From variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7, 2409 (2017).</li><li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number.">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li><li>Ishak, A., AlRawashdeh, M. M., Esagian, S. M., Nikas, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic,+prognostic,+and+therapeutic+value+of+droplet+digital+PCR+(ddPCR)+in+COVID-19+patients:+A+systematic+review.">Diagnostic, prognostic, and therapeutic value of droplet digital PCR (ddPCR) in COVID-19 patients: A systematic review.</a> Journal of Clinical Medicine. 10 (23), 5712 (2021).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+droplet+digital+PCR+to+detect+the+pathogens+of+infectious+diseases.">Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases.</a> Bioscience Reports. 38 (6), (2018).</li><li>Lee, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+UCSC+genome+browser+database:+2022+update.">The UCSC genome browser database: 2022 update.</a> Nucleic Acids Research. 50, 1115-1122 (2022).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+A+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li><li>Untergasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer3--new+capabilities+and+interfaces.">Primer3--new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Research. 40 (15), 115 (2012).</li><li>Das, A., Das, D., Das, A., Panda, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quick+and+cost-effective+method+for+DNA-free+total+RNA+isolation+using+magnetic+silica+beads.">A quick and cost-effective method for DNA-free total RNA isolation using magnetic silica beads.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Oberacker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Synthesis+of+Functionalized+Paramagnetic+Beads+for+Nucleic+Acid+Purification+and+Manipulation.">Simple Synthesis of Functionalized Paramagnetic Beads for Nucleic Acid Purification and Manipulation.</a> Bio-protocol. 9 (20), 3394 (2019).</li><li>Ra&#269;ki, N., Dreo, T., Gutierrez-Aguirre, I., Blejec, A., Ravnikar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+transcriptase+droplet+digital+PCR+shows+high+resilience+to+PCR+inhibitors+from+plant,+soil+and+water+samples.">Reverse transcriptase droplet digital PCR shows high resilience to PCR inhibitors from plant, soil and water samples.</a> Plant Methods. 10 (1), 42 (2014).</li><li>Taylor, S. C., Carbonneau, J., Shelton, D. N., Boivin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+droplet+digital+PCR+from+RNA+and+DNA+extracts+with+direct+comparison+to+RT-qPCR:+Clinical+implications+for+quantification+of+Oseltamivir-resistant+subpopulations.">Optimization of droplet digital PCR from RNA and DNA extracts with direct comparison to RT-qPCR: Clinical implications for quantification of Oseltamivir-resistant subpopulations.</a> Journal of Virological Methods. 224, 58-66 (2015).</li></ol>

CircRNA araştırması, son on yılda yüksek verimli dizileme teknolojilerinin keşfi ile büyümüştür. Sonuç olarak, gelecekteki RNA terapötikleri için potansiyel bir molekül olarak kabul edilmiştir. Ek olarak, kanser ve kardiyovasküler hastalıklar da dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarda biyobelirteç olarak hareket ettiği bilinmektedir 4,8. Bununla birlikte, sirkRNA'nın tanımlanması, düşük bolluğu ve onu ebeveyn mRNA9...

RNA dizileme teknolojilerindeki son gelişmeler ve yeni hesaplama algoritmaları, dairesel RNA (circRNA)1 olarak adlandırılan, büyüyen kodlamayan RNA ailesinin yeni bir üyesini keşfetti. Adından da anlaşılacağı gibi, sirkRNA'lar, serbest uçları olmayan tek sarmallı RNA moleküllerinin bir ailesidir. Bunlar, yukarı akış ekleme alıcı bölgesinin, kararlı bir RNA çemberi1,2 oluşturmak için aşağı akış ekleme donör bölgesi ile kovalent olarak birleştiği, geri ekleme adı verilen kanonik olmayan baştan kuyruğa ekleme ile oluşturulurlar. Bu süreç, dairesel ekzonların yukarı ve aşağı akımında bulunan ters Alu tekrarlayan elementler de dahil olmak üzere çeşitli faktörler tarafından aracılık edilebilir veya bazı ekleme faktörleri veya RNA bağlayıcı proteinler (RPP'ler) tarafından aracılık edilebilir2,3. Sadece ekzonik veya intronik diziden üretilen dairesel RNA'lar ekzonik sirkRNA ve dairesel intronik RNA'lar veya ci-RNA'lar olarak sınıflandırılırken, bazı ekzonik sirkRNA'lar introniği korur ve ekzon-intron sirkRNA'lar (EIcircRNA'lar)3,4 olarak adlandırılır. SirkRNA'ların işlevleri, miRNA ve / veya RBP'yi süngerlemek, transkripsiyonu düzenlemek ve peptidlereçevirerek hücresel fonksiyonu düzenlemek de dahil olmak üzere çok yönlüdür 3,5,6,7. Çeşitli raporlar, sirkRNA'ların çeşitli hastalıklarda ve fizyolojik süreçlerdeki önemini vurgulamıştır8. Ayrıca, dokuya özgü ekspresyon paternleri ve ekzonükleaz sindirimine direnç, onu hastalık tanısı için fonksiyonel bir biyobelirteç haline getirir ve uygun bir terapötik hedef olarak da kullanılabilir8. Sağlık ve hastalıkların düzenlenmesindeki önemi göz önüne alındığında, sirkRNA ekspresyonunun doğru bir şekilde ölçülmesi saatin ihtiyacıdır.
Biyolojik örneklerdeki sirkRNA'ları ölçmek için çeşitli biyokimyasal yöntemler geliştirilmiştir9. SirkRNA nicelleştirmesi için en uygun ve yaygın olarak kabul edilen yöntemlerden biri, ters transkripsiyon ve ardından farklı primer çiftleri10 kullanılarak kantitatif polimeraz zincir reaksiyonudur (RT-qPCR). Bununla birlikte, sirkRNA'ların çoğunluğu lineer mRNA'lara kıyasla düşük bolluk içindedir, bu da onları ölçmeyi zorlaştırır11. Bu sorunun üstesinden gelmek için, belirli bir numunedeki sirkRNA sayısını doğru bir şekilde ölçmek için dijital damlacık PCR'yi (dd-PCR) kullanmaya çalıştık. dd-PCR, mikroakışkanlar ilkesini takip eden gelişmiş bir PCR teknolojisidir; yağda birden fazla sulu damlacık üretir ve PCR her damlacıkta ayrı bir reaksiyon12 olarak oluşur. Reaksiyon bireysel damlacıklarda meydana gelir ve ilgilenilen gen için pozitif veya negatif damlacıkların sayısını veren bir damlacık okuyucu kullanılarak analiz edilir12. Belirli bir örnekte yalnızca tek bir kopya olsa bile, ilgilenilen bir geni doğru bir şekilde ölçmek için en hassas tekniktir. İnhibitörlere karşı duyarlılığın azalması, daha iyi hassasiyet ve niceleme için referans genin ihmal edilmesi, onu geleneksel qPCR 13,14,15'ten daha avantajlı hale getirir. İlgilenilen bir genin mutlak nicelleştirilmesi için bir araştırma ve teşhis aracı olarak yaygın olarak kullanılmıştır16,17. Burada, fare C2C12 miyotüplerini ayırt etmede ve farklı primerler kullanarak fare C2C12 miyoblastlarını çoğaltmada sirkRNA nicelemesi için ayrıntılı dd-PCR protokolünü açıklıyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >1.5 ml microcentifuge tube</td>
			<td >Tarson</td>
			<td >500010</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.2 ml tube strips with cap</td>
			<td >Tarson</td>
			<td >610020, 510073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filter Tips</td>
			<td >Tarson</td>
			<td >528104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >10977023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell scrapper</td>
			<td >HiMedia</td>
			<td >TCP223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chloroform</td>
			<td >SRL</td>
			<td >96764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA diluent</td>
			<td >HiMedia</td>
			<td >MB228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Random primers</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >48190011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >dNTP set</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >R0181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Murine RNase inhibitor</td>
			<td >NEB</td>
			<td >M0314S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Maxima reverse transcriptase</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >EP0743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 dd-PCR Evagreen Supermix</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Droplet generation oil for Evagreen</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1814040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DG8 Cartridges and Gaskets</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DG8 Cartridge holder</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1863051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 Droplet Generator</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ddPCR 96-Well Plates</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >12001925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PX1 PCR Plate Sealer</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1814000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C1000 Touch Thermal Cycler with 96&#8211;Deep Well Reaction Module</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1851197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 Droplet Reader</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Quantasoft Software</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1864011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silica column</td>
			<td >Umbrella Life Science</td>
			<td >38220090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UCSC Genome Browser</td>
			<td ></td>
			<td >https://genome.ucsc.edu/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primer 3</td>
			<td ></td>
			<td >https://primer3.ut.ee/</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of circular rnas using digital droplet pcr

Dijital damlacık polimeraz zincir reaksiyonu (dd-PCR) en hassas niceleme yöntemlerinden biridir; reaksiyonu yaklaşık 20.000 yağda su damlacığına ayırır ve PCR bireysel damlacıklarda meydana gelir. dd-PCR, geleneksel gerçek zamanlı qPCR'ye göre, düşük bolluk hedeflerinin tespitinde artan doğruluk, niceleme için referans genleri atlama, numuneler için teknik replikaları ortadan kaldırma ve numunelerdeki inhibitörlere karşı yüksek esneklik gösterme gibi çeşitli avantajlara sahiptir. Son zamanlarda, dd-PCR, gen ekspresyon analizi ve teşhisi için hedef DNA veya RNA'yı doğru bir şekilde ölçmek için en popüler yöntemlerden biri haline gelmiştir. Dairesel RNA'lar (sirkRNA'lar), 5' ve 3' uçları olmayan, yakın zamanda keşfedilen kovalent olarak kapalı RNA moleküllerinin büyük bir ailesidir. RNA bağlayıcı proteinler ve mikroRNA'lar için sünger görevi görerek gen ekspresyonunu düzenledikleri gösterilmiştir. Ayrıca, sirkRNA'lar vücut sıvılarına salgılanır ve ekzonükleazlara karşı dirençleri, hastalık teşhisi için biyobelirteçler olarak hizmet etmelerini sağlar. Bu makale, hücrelerdeki spesifik dairesel RNA (circRNA) seviyelerini doğru bir şekilde ölçmek için farklı primer tasarımı, RNA ekstraksiyonu, cDNA sentezi ve dd-PCR analizinin nasıl gerçekleştirileceğini göstermeyi amaçlamaktadır. Sonuç olarak, dd-PCR kullanarak circRNA'ların kesin niceliğini gösteriyoruz.

Her numunedeki sirkRNA'ların mutlak sayısı, dışa aktarılan dd-PCR verilerinden türetilebilir. Gerçek zamanlı kantitatif PCR analizi, diferansiye C2C12 miyotüplerinde circBnc2'nin diferansiyel ekspresyonunu önerdi (veriler gösterilmedi). Burada, çoğalan C2C12 miyoblastlarında ve miyotüplerinde circBnc2'nin mutlak kopya sayısını kontrol etmek istedik. CircBnc2'nin ekspresyonu iki koşulda karşılaştırıldığından, aynı reaktifleri ve prosedürü kullanarak RNA izolasyonu,...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR at JoVE.com

Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR

Bu protokol, farklı primerler kullanılarak hücrelerdeki dairesel RNA (circRNA) seviyelerinin hassas bir şekilde ölçülmesi için ayrıntılı dijital damlacık PCR (dd-PCR) yöntemini açıklamaktadır.

Dairesel RNA'ların Dijital Damlacık PCR Kullanılarak Nicelleştirilmesi

Digital droplet polymerase chain reaction (dd-PCR) is one of the most sensitive quantification methods; it fractionates the reaction into nearly 20,000 ...

dd-PCR, hedef DNA veya RNA'nın mutlak nicelleştirilmesi için oldukça hassas ve doğru bir yöntemdir. Diğer konvansiyonel yöntemlerin doğru sonuç veremediği durumlarda hastalık tanısında kullanılmıştır. dd-PCR, çok düşük miktarda bulunan nükleik asit moleküllerini tespit etmek için en hassas tekniktir.Kantitatif PCR'nin aksine, dd-PCR nicelik için herhangi bir temizlik gen kontrolü gerektirmez. Duyarlılığı ve doğruluğu nedeniyle, dd-PCR, mikro RNA'lar ve dairesel RNA'lar gibi düşük miktarda RNA moleküllerini içeren moleküler teşhis ve araştırmalar için bir araç olarak kullanılabilir. dd-PCR kullanmadan önce, primerlerin spesifik olmayan herhangi bir PCR amplifikasyonu olmadan hedef genlerini yükselttiğini doğrulamak için RT-PCR veya RT-qPCR yapılmalıdır.Başlamak için, toplam dairesel RNA dizisi uzunluğunun son 100 nükleotidini dairesel RNA dizisinin ilk 100 nükleotidine birleştirerek 200 nükleotid uzunluğunda bir PCR şablon dizisi hazırlayın. Primer 3 web aracı tarafından tasarlanan astar şablon dizisini kullanın. RNA izolasyonu için yaklaşık 5 milyon çoğalan C2C12 miyoblast hücresi ve dört günlük bir farklılaştırılmış C2C12 miyotüpü içeren 10 santimetrelik bir çanak alın.Hücreleri 10 mililitre 1X PBS ile üç kez yıkayın ve PBS'yi bir pipet kullanarak atın. Bir mililitre RNA izolasyon reaktifi ekleyin ve hücreleri kuvvetli pipetleme ile lize edin. Ardından, 15 saniye boyunca 200 mikrolitre kloroform ve vorteks ekleyin.Tüpü 12.000 G'de 10 dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüj yapın.Üst sulu tabakanın 400 mikrolitresini alın, bir silika kolona yükleyin ve oda sıcaklığında 12.000 G'de bir dakika boyunca santrifüj yapın. Akışı yeni bir tüpe alın ve 600 mikrolitre% 100 etanol ekleyin. 20 mikrolitre manyetik silika boncuk ekleyin ve tüpü beş dakika boyunca 25 santigrat derece ve 1.200 RPM'ye ayarlanmış bir termomikser üzerine yerleştirin.Ardından, tüpü 30 saniye boyunca veya çözelti netleşene kadar manyetik bir stand üzerine yerleştirin. Manyetik silika boncukları% 90 etanol içeren 500 mikrolitre yıkama tamponunda yeniden askıya alın. Tüpü manyetik standa 30 saniye yerleştirdikten sonra, boncukların mıknatısa doğru yerleşmesine izin verin ve tamponu bir pipet kullanarak atın.Tüpü bir termomikser üzerinde üç dakika boyunca 50 santigrat derecede hava ile kurutun ve kapağı açık tutun. 20 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyin ve boncukları yeniden askıya alın. Bir spektrofotometre kullanarak miktar ve kalite değerlendirmesi için çözünmüş RNA'yı yeni bir tüpte toplayın.RNA konsantrasyonunu bir spektrofotometre kullanarak ölçün ve cDNA sentezi için bir mikrogram RNA alın. Bir mikrogram toplam RNA'yı bir mikrolitre dNTP karışımı, dört mikrolitre 5X ters transkriptaz tamponu, iki mikrolitre 10X ters transkriptaz rastgele primer, 0.25 mikrolitre ters transkriptaz enzimi ve 0.5 mikrolitre RNaz inhibitörü ile karıştırın. Nükleaz içermeyen su kullanarak hacmi 20 mikrolitreye kadar yapın.Tüpü 10 dakika boyunca 25 santigrat dereceye, ardından bir saat boyunca 50 santigrat dereceye yerleştirin. Daha sonra enzimi inaktive etmek için tüpü beş dakika boyunca 85 santigrat dereceye yerleştirin. 22 mikrolitrelik PCR reaksiyonunu, negatif bir kontrol tüpü ve şablonsuz kontrol tüpleri ile birlikte 0.2 mililitrelik PCR tüplerinde veya şeritlerinde ayarlayın.NTC reaksiyon tüplerini kurmak için 11 mikrolitre dd-PCR ana karışımı, bir mikromolar konsantrasyonda 5.5 mikrolitre dairesel RNA'ya özgü ileri ve ters primer karışımı ve 5.5 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyin. Benzer şekilde, test reaksiyon tüplerini kurmak için, 11 mikrolitre dd-PCR ana karışımı, bir mikromolar konsantrasyonda 5.5 mikrolitre dairesel RNA'ya özgü ileri ve ters primer karışımı ve 5.5 mikrolitre cDNA ekleyin. Damlacık üretimi için, 0.2 mililitrelik PCR tüplerinden 20 mikrolitre PCR karışımını damlacık jeneratörü kartuşunun numune kuyucuklarına aktarın.Bir pipet kullanarak damlacık jeneratörü kartuşunun yağ kuyularına 70 mikrolitre damlacık üretim yağı ekleyin. Damlacık jeneratörü kartuşunu kauçuk bir conta ile örtün ve kartuşun damlacık kuyucuklarında oluşan örnek yağ damlacığı karışımını elde etmek için damlacık jeneratörü makinesine yerleştirin. PCR amplifikasyonu için, damlacık jeneratörü kartuşunun damlacık kuyucuklarından 40 mikrolitre numune yağ damlacığı karışımını, pipet kullanarak 96 delikli bir PCR plakasına aktarın.96 delikli PCR plakasını alüminyum folyo sızdırmazlık maddesi ile kapatın. 180 santigrat derecede önceden ısıtılmış plaka kapatıcı makine bloğuna yerleştirin ve PCR plakasını kapatmak için contayı tıklayın. Ardından, plakayı dd-PCR termal bisikletçiye yerleştirin ve kapak sıcaklığını 105 santigrat dereceye ve rampa hızını saniyede iki santigrat dereceye ayarlayın.PCR bittikten sonra, plakayı dd-PCR damlacık sayacı makinesine, damlacıkları saymak için plaka tutucu ile doğru konuma getirin. Damlacık analiz yazılımını açın ve numune bilgilerinin girişini vererek çalıştırmayı ayarlayın. Damlacık okumasının tamamlanmasından sonra verileri analiz etmek için analiz et düğmesine tıklayın.Ardından, pozitif ve negatif damlacıkları görmek için 1D Genlik düğmesine tıklayın. Pozitif damlacıkları negatif damlacıklardan ayırmak için, aynı hedefe sahip tüm numuneler için ortak bir eşik çizgisi koyun. Dairesel RNA sayım verilerini csv dosyası olarak dışa aktarmak için dışa aktar düğmesine tıklayın.Dışa aktarılan veriler, her örnekte bulunan dairesel RNA'ların sayısını gösterir. Her reaksiyonda kullanılan toplam cDNA miktarını göz önünde bulundurarak, RNA'nın nanogramı başına her numunedeki dairesel RNA sayısını manuel olarak hesaplayın. QuantaSoft Yazılımı kullanılarak yapılan veri analizi burada gösterilmiştir.MT1 dışındaki tüm örnekler 12.000'den fazla damlacık sayısı gösterdi. MT1'de toplam damlacık sayısı düşük olduğundan, bu örnek son veri analizi için dikkate alınmamıştır. İlginçtir ki, dört günlük farklılaşmış miyotüp durumunda, miyoblast hücrelerine kıyasla Circ B ve C2'nin ekspresyon paterninde açık bir fark vardı.Circ B ve C2 bolluğunun kopya sayısı açısından analizi, C2C12 miyoblastlarının üç replikatörünün RNA'nın nanogramı başına 76.8, 67 ve 46 kopyaya sahip olduğunu, iki miyotüp örneğinin RNA'nın nanogramı başına 558 ve 610 kopyaya sahip olduğunu göstermiştir. Çubuk grafikteki veriler, iki ila üç biyolojik kopyanın ortalama artı eksi standart sapmasını temsil eder. ddPCR, hedef dairesel RNA'nın doğru diferansiyel ekspresyonunu ölçmek için en gelişmiş yöntemlerden biridir.Bu yöntem, önümüzdeki yıl döngüsel RNA araştırma ve teşhis endüstrilerini hızlandırmak için önemli bir araç olacaktır.

Research

JoVE Journal

Biology

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR (qPCR) Diziler kullanarak Pre-mikro RNA&#39;lar ve microRNA, Profilleme

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Rapid PCR Thermocycling using Microscale Thermal Convection

Mikro Termal Isı Yayımı kullanarak Rapid PCR Thermocycling

Many molecular biology assays depend in some way on the polymerase chain reaction (PCR) to amplify an initially dilute target DNA sample to a detectable ...

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

Insan serumundan küçük kodlayıcı olmayan RNA&#39;lar izolasyonu

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Dijital Nükleik Asit Kantifikasyon Tahliller Basit Toplu Saati

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

Dijital Damlacık PCR Formalin sabit Parafin gömülü Referans Standart Hücre Hatlarında BRAF V600E mutasyonları tespit etmek istihdam

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

Using Digital Image Correlation to Characterize Local Strains on Vascular Tissue Specimens

Dijital Görüntü Korelasyon kullanma Vasküler Doku Örneklerinin Yerel düzensizliğin karakterize etmek

Characterization of the mechanical behavior of biological and engineered soft tissues is a central component of fundamental biomedical research and ...

Genome-wide Purification of Extrachromosomal Circular DNA from Eukaryotic Cells

Ökaryotik Hücrelerde gelen ekstrakromozomal dairesel DNA genom Arıtma

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs ...

Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR

Cynomolgus maymunlar, nicel gerçek zamanlı ters transkripsiyon PCR kullanarak plazma mikroRNA düzeylerinin mutlak miktar

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This ...

Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit

Bir Well-established organel izolasyon Kit kullanarak hızlı Lipid damlacık yalıtım Protokolü

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral ...

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

SARS-CoV-2 Tespiti ve Ölçümü için İki Adımlı Ters Transkripsiyon Damlacığı Dijital PCR Protokolleri

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...