Name: a triple primary cell culture model of the human blood-brain barrier for studying ischemic stroke in vitro
Uploaded: 2022-10-06T14:05:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل منح المعاهد الوطنية للصحة (NIH) MH128022 و MH122235 و MH072567 و MH122235 و HL126559 و DA044579 و DA039576 و DA040537 و DA050528 و DA047157.

ملاحظة: راجع جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع الخلايا والمواد والمعدات والحلول المستخدمة في هذا البروتوكول.
1. إعداد نموذج BBB لثقافة الخلايا الثلاثية
<ol><li>بذر pericytes<ol><li>قم بزراعة HBVP في قوارير ثقافة T75 بسطح نشط للالتصاق الخلايا داخل حاضنة CO...

<ol>
	<li>Mozaffarian, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+disease+and+stroke+statistics-2016+update:+a+report+from+the+American+Heart+Association.">Heart disease and stroke statistics-2016 update: a report from the American Heart Association.</a> Circulation. 133 (94), 38 (2016).</li><li>Yousufuddin, M., Young, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+and+ischemic+stroke.">Aging and ischemic stroke.</a> Aging. 11 (9), 2542-2544 (2019).</li><li>Donkor, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroke+in+the+21st+century:+a+snapshot+of+the+burden,+epidemiology,+and+quality+of+life.">Stroke in the 21st century: a snapshot of the burden, epidemiology, and quality of life.</a> Stroke Research and Treatment. , 3238165 (2018).</li><li>Kadry, H., Noorani, B., Cucullo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+blood-brain+barrier+overview+on+structure,+function,+impairment,+and+biomarkers+of+integrity.">A blood-brain barrier overview on structure, function, impairment, and biomarkers of integrity.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 17 (1), 69 (2020).</li><li>Brown, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+and+neurovascular+function+in+the+healthy+and+diseased+brain.">Pericytes and neurovascular function in the healthy and diseased brain.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 282 (2019).</li><li>Cabezas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+modulation+of+blood+brain+barrier:+perspectives+on+Parkinson's+disease.">Astrocytic modulation of blood brain barrier: perspectives on Parkinson's disease.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 211 (2014).</li><li>Abdullahi, W., Tripathi, D., Ronaldson, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+dysfunction+in+ischemic+stroke:+targeting+tight+junctions+and+transporters+for+vascular+protection.">Blood-brain barrier dysfunction in ischemic stroke: targeting tight junctions and transporters for vascular protection.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 315 (3), 343-356 (2018).</li><li>Candelario-Jalil, E., Dijkhuizen, R. M., Magnus, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammation,+stroke,+blood-brain+barrier+dysfunction,+and+imaging+modalities.">Neuroinflammation, stroke, blood-brain barrier dysfunction, and imaging modalities.</a> Stroke. 53 (5), 1473-1486 (2022).</li><li>He, Y., Yao, Y., Tsirka, S. E., Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-culture+models+of+the+blood-brain+barrier.">Cell-culture models of the blood-brain barrier.</a> Stroke. 45 (8), 2514-2526 (2014).</li><li>Thomsen, L. B., Burkhart, A., Moos, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+triple+culture+model+of+the+blood-brain+barrier+using+porcine+brain+endothelial+cells,+astrocytes+and+pericytes.">A triple culture model of the blood-brain barrier using porcine brain endothelial cells, astrocytes and pericytes.</a> PLoS One. 10 (8), 0134765 (2015).</li><li>Song, Y., Cai, X., Du, D., Dutta, P., Lin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+blood-brain+barrier+models+for+in+vitro+biological+analysis:+one+cell+type+vs+three+cell+types.">Comparison of blood-brain barrier models for in vitro biological analysis: one cell type vs three cell types.</a> ACS Applied Bio Materials. 2 (3), 1050-1055 (2019).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+nanoparticles+induce+tight+junction+disruption+and+astrocyte+neurotoxicity+in+a+rat+blood-brain+barrier+primary+triple+coculture+model.">Silver nanoparticles induce tight junction disruption and astrocyte neurotoxicity in a rat blood-brain barrier primary triple coculture model.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 6105-6118 (2015).</li><li>Appelt-Menzel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+human+blood-brain+barrier+co-culture+model+mimicking+the+neurovascular+unit+using+induced+pluri-+and+multipotent+stem+cells.">Establishment of a human blood-brain barrier co-culture model mimicking the neurovascular unit using induced pluri- and multipotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 894-906 (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+construction+of+a+reversible+arylazo-based+NIR+probe+for+cycling+hypoxia+imaging+in+vivo.">Rational construction of a reversible arylazo-based NIR probe for cycling hypoxia imaging in vivo.</a> Nature Communications. 12 (1), 2772 (2021).</li><li>Palacio-Casta&#241;eda, V., Kooijman, L., Venzac, B., Verdurmen, W. P. R., Le Gac, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+switching+of+tumor+cells+under+hypoxic+conditions+in+a+tumor-on-a-chip+model.">Metabolic switching of tumor cells under hypoxic conditions in a tumor-on-a-chip model.</a> Micromachines. 11 (4), 382 (2020).</li><li>Ramsauer, M., Krause, D., Dermietzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+of+the+blood-brain+barrier+in+vitro+and+the+function+of+cerebral+pericytes.">Angiogenesis of the blood-brain barrier in vitro and the function of cerebral pericytes.</a> FASEB Journal. 16 (10), 1274-1276 (2002).</li><li>Lyck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALCAM+(CD166)+is+involved+in+extravasation+of+monocytes+rather+than+T+cells+across+the+blood-brain+barrier.">ALCAM (CD166) is involved in extravasation of monocytes rather than T cells across the blood-brain barrier.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 37 (8), 2894-2909 (2017).</li><li>Rizzi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+triple+culture+cell+system+modeling+the+human+blood-brain+barrier.">A triple culture cell system modeling the human blood-brain barrier.</a> Journal of Visualized Experiments. (177), (2021).</li><li>Kumar, S., Shaw, L., Lawrence, C., Lea, R., Alder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P50:+Developing+a+physiologically+relevant+blood+brain+barrier+model+for+the+study+of+drug+disposition+in+glioma.">P50: Developing a physiologically relevant blood brain barrier model for the study of drug disposition in glioma.</a> Neuro-Oncology. 16 (6), (2014).</li><li>Stone, N. L., England, T. J., O'Sullivan, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+transwell+blood+brain+barrier+model+using+primary+human+cells.">A novel transwell blood brain barrier model using primary human cells.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 230 (2019).</li><li>Al Ahmad, A., Taboada, C. B., Gassmann, M., Ogunshola, O. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+and+pericytes+differentially+modulate+blood-brain+barrier+characteristics+during+development+and+hypoxic+insult.">Astrocytes and pericytes differentially modulate blood-brain barrier characteristics during development and hypoxic insult.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 31 (2), 693-705 (2011).</li></ol>

في هذا البروتوكول ، وصفنا طريقة لإعداد نموذج BBB موثوق به لثقافة الخلايا البطانية الثلاثية - pericyte - النجمية لدراسة خلل BBB في وضع السكتة الدماغية الإقفارية في المختبر. بالنظر إلى أن pericytes هي أقرب جيران الخلايا البطانية في الجسم الحي ، فإن HBVP مطلي على الجانب السفلي من إدخالات البئر في ...

السكتة الدماغية هي واحدة من الأسباب الرئيسية للوفاة والعجز على المدى الطويل في جميع أنحاء العالم1. يزداد معدل الإصابة بالسكتة الدماغية بسرعة مع تقدم العمر ، حيث يتضاعف كل 10 سنوات بعد سن 552. تحدث السكتة الدماغية الإقفارية نتيجة لاضطراب تدفق الدم الدماغي بسبب الأحداث الخثارية والصمية ، والتي تشمل أكثر من 80 ٪ من جميع حالات السكتة الدماغية3. حتى الآن ، هناك عدد قليل نسبيا من خيارات العلاج المتاحة لتقليل موت الأنسجة بعد السكتة الدماغية. العلاجات الموجودة حساسة للوقت وبالتالي لا تؤدي دائما إلى نتائج سريرية جيدة. لذلك ، هناك حاجة ماسة للبحث عن الآليات الخلوية المعقدة للسكتة الدماغية التي تؤثر على التعافي بعد السكتة الدماغية.
BBB هي واجهة ديناميكية لتبادل الجزيئات بين الدم وحمة الدماغ. من الناحية الهيكلية ، يتكون BBB من خلايا بطانة الأوعية الدموية الدقيقة في الدماغ مترابطة بواسطة مجمعات متقاطعة محاطة بغشاء قاعدي ، وخلايا محيطية ، وأقدام نجمية4. تلعب الخلايا النجمية والخلايا النجمية دورا أساسيا في الحفاظ على سلامة BBB من خلال إفراز العوامل المختلفة اللازمة لتشكيل تقاطعات قوية وضيقة 5,6. انهيار BBB هو واحد من السمات المميزة للسكتة الدماغية. تؤدي الاستجابة الالتهابية الحادة والإجهاد التأكسدي المرتبط بنقص التروية الدماغية إلى تعطيل مجمعات بروتين الوصلات الضيقة والحديث المتبادل غير المنظم بين الخلايا النجمية والخلايا المحيطة والخلايا البطانية ، مما يؤدي إلى زيادة نفاذية المذاب عبر BBB7. يعزز ضعف BBB تكوين وذمة الدماغ ويزيد من خطر التحول النزفي8. بالنظر إلى كل ما سبق ، هناك اهتمام كبير بفهم التغيرات الجزيئية والخلوية التي تحدث على مستوى BBB أثناء وبعد السكتة الدماغية.
على الرغم من أن العديد من نماذج BBB في المختبر قد تم تطويرها على مدى العقود الأخيرة واستخدامها في مجموعة متنوعة من الدراسات ، إلا أنه لا يمكن لأي منها التكرار الكامل في ظروف الجسم الحي 9. في حين أن بعض النماذج تعتمد على أحاديات الخلايا البطانية المستزرعة على دعامات نفاذة جيدة الإدخال بمفردها أو بالاشتراك مع pericytes أو الخلايا النجمية ، إلا أن الدراسات الحديثة فقط هي التي أدخلت تصميمات نماذج زراعة الخلايا الثلاثية. تتضمن جميع نماذج BBB الثلاثية الموجودة تقريبا خلايا بطانة الدماغ الأولية جنبا إلى جنب مع الخلايا النجمية والخلايا المحيطة المعزولة من الأنواع الحيوانية أو الخلايا المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات10،11،12،13.
إدراكا للحاجة إلى تلخيص BBB البشري بشكل أفضل في المختبر ، أنشأنا نموذج BBB لثقافة الخلايا الثلاثية في المختبر يتكون من الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة في الدماغ البشري (HBMEC) ، والخلايا النجمية البشرية الأولية (HA) ، والخلايا الوعائية الأولية للدماغ البشري (HBVP). تم إعداد نموذج BBB الثلاثي هذا على 6 آبار ، وإدراج غشاء بوليستر بحجم مسام 0.4 ميكرومتر. توفر هذه الحشوات الجيدة بيئة مثالية لربط الخلايا وتتيح سهولة الوصول إلى كل من المقصورات القمية (الدموية) والقاعدية (الدماغية) لأخذ العينات المتوسطة أو التطبيق المركب. يتم تقييم ميزات نموذج BBB المقترح لثقافة الخلايا الثلاثية عن طريق قياس TEER والتدفق شبه الخلوي بعد OGD الذي يحاكي السكتة الدماغية الإقفارية في المختبر ، مع نقص الأكسجين (<1٪ O2) والمواد المغذية (باستخدام وسط خال من الجلوكوز) يتم تحقيقه باستخدام غرفة رطبة ومغلقة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم التحقق بدقة من الحالات الشبيهة بنقص التروية المستحثة في هذا النموذج عن طريق التصور المباشر لخلايا نقص الأكسجين.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 mm Transwell with 0.4 &#181;m Pore Polyester Membrane Insert</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Glass Bottom Dishes</td>
			<td>MatTek Life Sciences (FISHERSCI)</td>
			<td>P35GC-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Astrocyte Medium</td>
			<td>Science Cell</td>
			<td>1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attachment Factor</td>
			<td>Cell Systems (Fisher Scientific)</td>
			<td>4Z0-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 60 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrainPhys Imaging Optimized Medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Classic Medium With Serum and CultureBoost</td>
			<td>4Z0-500</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes (Conical Bottom with CentriStar Cap</td>
			<td>VWR</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 75cm&#178; U-Shaped Canted Neck Not Treated Cell Culture Flask&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431464U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning CellBIND 96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countes Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ZGEXSCCOUNTESS2FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decon CiDehol 70 Isopropyl Alcohol Solution&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>04-355-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Petri Dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Medium (No glucose, No glutamine, No phenol red)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A14430-01</td>
			<td>Glucose-free medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (No Calcium, No Magnesium)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM Endothelial Cell Growth Basal Medium, Phenol Red Free, 500 mL</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM2 Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter with STX2 electrodes</td>
			<td>World Precison Instruments</td>
			<td>NC9792051</td>
			<td>Epithelial voltohmmeter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate&#8211;dextran (wt 20,000)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>FD20-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate&#8211;dextran (wt 70,000)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>FD70S-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorview FV3000 Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Tank (95% N2, 5% CO2)</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>X02NI95C2003071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (No calcium, No magnesium, no phenol red)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Astrocytes</td>
			<td>Science Cell</td>
			<td>1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Brain Vascular Pericytes</td>
			<td>Science Cell</td>
			<td>1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxia Incubator Chamber</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>27310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image-iT Green Hypoxia Reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>I14834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pericyte Medium</td>
			<td>Science Cell</td>
			<td>1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Human Brain Microvascular Endothelial Cells</td>
			<td>ACBRI 376</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking Platform Shaker, Double</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10860-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Flow Meter</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>27311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax iD3 Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>75886-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, 25 mm, 0.22 &#956;m, PVDF, Sterile</td>
			<td>NEST Scientific</td>
			<td>380121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP Mutli-well Plates (6 wells)</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>TP92406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP Tissue Culture Flasks T-75 Flasks</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>TP90075</td>
			<td>Flasks with activated surface for cell adhesion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Distilled Water</td>
			<td>Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td>10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uno Stage Top Incubator-</td>
			<td>Oko Lab</td>
			<td>UNO-T-H-CO2-TTL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a triple primary cell culture model of the human blood-brain barrier for studying ischemic stroke in vitro

السكتة الدماغية الإقفارية هي سبب رئيسي للوفاة والعجز في جميع أنحاء العالم مع خيارات علاجية محدودة. يتميز علم الأمراض العصبية للسكتة الدماغية بانقطاع في تدفق الدم إلى الدماغ مما يؤدي إلى موت الخلايا والخلل المعرفي. أثناء وبعد السكتة الدماغية الإقفارية ، يسهل الخلل الوظيفي للحاجز الدموي الدماغي (BBB) تطور الإصابة ويساهم في ضعف تعافي المريض. تشمل نماذج BBB الحالية في المقام الأول الزراعات الأحادية البطانية والثقافات المشتركة المزدوجة مع الخلايا النجمية أو pericytes.
تفتقر هذه النماذج إلى القدرة على التقليد الكامل لبيئة الدماغ الدقيقة الديناميكية ، وهو أمر ضروري للتواصل من خلية إلى خلية. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما تحتوي نماذج BBB شائعة الاستخدام على خلايا بطانية بشرية خالدة أو مزارع خلايا مشتقة من الحيوانات (القوارض أو الخنازير أو الأبقار) التي تشكل قيودا متعدية. تصف هذه الورقة نموذج BBB الجديد القائم على الإدراج الجيد والذي يحتوي فقط على الخلايا البشرية الأولية (الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة في الدماغ ، والخلايا النجمية ، والخلايا المحيطة بالأوعية الدموية في الدماغ) مما يتيح التحقيق في إصابة الدماغ الإقفارية في المختبر. 
تم تقييم آثار الحرمان من الأكسجين والجلوكوز (OGD) على سلامة الحاجز من خلال النفاذية السلبية ، وقياسات المقاومة الكهربائية عبر البطانية (TEER) ، والتصور المباشر للخلايا التي تعاني من نقص الأكسجين. يقدم البروتوكول المقدم ميزة واضحة تحاكي البيئة بين الخلايا ل BBB في الجسم الحي ، حيث يعمل كنموذج BBB أكثر واقعية في المختبر لتطوير استراتيجيات علاجية جديدة في وضع إصابة الدماغ الإقفارية.

لدراسة تأثيرات الخلايا النجمية والخلايا المحيطة على وظيفة الحاجز الواقي ل HBMEC ، قمنا ببناء نموذج BBB لزراعة الخلايا الثلاثية على إدخالات زراعة الخلايا (الشكل 1 أ) جنبا إلى جنب مع الزراعة الأحادية HBMEC ونموذجين مزدوجين للثقافة المشتركة كعناصر تحكم (الشكل 1B). وش?...

Watch this Scientific Journal Video about A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro at JoVE.com

A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro

هنا ، نصف طريقة إنشاء نموذج زراعة الخلايا الثلاثية للحاجز الدموي الدماغي بناء على الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة الأولية للدماغ البشري ، والخلايا النجمية ، والخلايا المحيطة. هذا النموذج متعدد الخلايا مناسب لدراسات الخلل الوظيفي لوحدة الأوعية الدموية العصبية أثناء السكتة الدماغية الإقفارية في المختبر أو لفحص الأدوية المرشحة.

نموذج زراعة الخلايا الأولية الثلاثية للحاجز الدموي الدماغي البشري لدراسة السكتة الدماغية الإقفارية في المختبر

Ischemic stroke is a major cause of death and disability worldwide with limited therapeutic options. The neuropathology of ischemic stroke is ...

يعترف بروتوكولنا بالحاجة إلى تلخيص أفضل للحاجز الدموي الدماغي البشري في المختبر لدراسة الآليات الخلوية المعقدة التي تؤثر على التعافي بعد السكتة الدماغية. يظهر نموذجنا الثلاثي سلامة قوية ترتبط جزئيا بالتقسيم الكبير لإدخالات الآبار ، مما يسمح لنا بتقليل وتيرة التغيير وتجنب تعطيل السكان. نموذجنا هو أداة رائعة لدراسة التغيرات الجزيئية والخلوية التي تحدث في الحاجز الدموي الدماغي أثناء وبعد السكتة الدماغية.يسمح بروتوكولنا باكتشاف أهداف وعلاجات جديدة لتحسين التعافي بعد السكتة الدماغية. العلاجات الحالية للسكتة الدماغية الإقفارية حساسة للوقت وبالتالي ليست فعالة دائما. ابدأ بزراعة HBVP في قوارير ثقافة T75 بسطح نشط للالتصاق الخلايا داخل حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية حتى تتلاقى.بمجرد الوصول إلى نقطة التقاء ، استنشق الوسط القديم pericyte واغسل الخلايا بخمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني Dulbecco الدافئ. قم بشفط PBS الخاص ب Dulbecco وافصل الخلايا عن القارورة باستخدام مزيج من أربعة ملليلتر من محلول EDTA التربسين الدافئ وملليلتر واحد من PBS من Dulbecco. احتضان القارورة لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون.عرض تحت المجهر للتأكد مما إذا كانت الخلايا منفصلة عن القارورة. أضف خمسة ملليلتر من وسط pericyte الدافئ الذي يحتوي على 2٪ FBS إلى القارورة وانقل الخلايا المنفصلة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلتر. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية لمدة ثلاث دقائق عند 200 جم مما يسمح للخلايا بتكوين حبيبات في قاع الأنبوب.قم بشفط الوسط من الأنبوب لضمان بقاء حبيبات الخلية سليمة. إعادة تعليق بيليه الخلية في وسط pericyte. احسب كمية الوسط اعتمادا على التقاء الخلايا وعدد إدخالات البئر المطلوبة.خذ 10 ميكرولتر من الخلايا المعاد تعليقها ، وضعها في شريحة عد الخلايا ، وعد عدد الخلايا. تحديد كثافة الخلية والبذور 300،000 خلية لكل إدراج في ملليلتر واحد من وسط pericyte على الجانب abluminal من إدراج البئر. قم بزراعة الخلايا النجمية البشرية الأولية باستخدام وسط الخلايا النجمية الذي يحتوي على 2٪ FBS كما هو موضح في مخطوطة النص.تحديد كثافة الخلية والبذور 300،000 خلية لكل بئر على الجزء السفلي من الأنسجة زراعة ستة ألواح الآبار. قم بتغطية اللوحة لمنع التبخر واحتضانها طوال الليل. وبالمثل ، قم بزراعة HBMEC في أطباق زراعة الأنسجة باستخدام وسيط كلاسيكي كامل يحتوي على 10٪ FBS كما هو موضح في مخطوطة النص.أخرج لوحات زراعة الأنسجة المكونة من ستة آبار تحتوي على الخلايا النجمية وإدراج البئر الذي يحتوي على pericytes من الحاضنة. استنشاق وسط الخلية النجمية من ألواح زراعة الأنسجة المكونة من ستة آبار وإضافة ملليلتر واحد من وسط pericyte ومليلتر واحد من وسط الخلايا النجمية إلى كل بئر. استنشاق وسط pericyte من إدخالات البئر ووضعها في لوحات زراعة الأنسجة ستة آبار تحتوي على الخلايا النجمية البذرة.قم بزرع HBMEC بكثافة 300،000 خلية لكل بئر في مليلتر من الوسط الكلاسيكي الكامل على الجانب القمي من نفس إدخالات البئر. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني من Dulbecco. بالنسبة لمزارع الخلايا الثلاثية المعرضة للحرمان من الأكسجين والجلوكوز ، أضف وسيطا خاليا من الجلوكوز إلى كل من المقصورات القمية والقاعدية.استبدل وسط الاستزراع بوسط جديد وثقافات خلية تحكم طبيعية. ضع الثقافات الثلاثية للتحكم في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية. ضع طبق بتري يحتوي على 20 مل من الماء المعقم في غرفة حاضنة نقص الأكسجة لتوفير ترطيب مناسب للثقافات.افتح الغرفة عن طريق تحرير المشبك الدائري ، ثم رتب ثقافات الخلايا على الرفوف. أغلق الغرفة عن طريق تأمين المشبك الدائري. افتح منافذ مدخل ومخرج الغرفة وقم بتوصيل الأنبوب من أعلى مقياس تدفق الغرفة.قم بتوصيل الأنبوب من أسفل مقياس التدفق بخزان الغاز عبر مرشح الهواء. افتح صمام التحكم في تدفق الخزان عن طريق تدويره عكس اتجاه عقارب الساعة للسماح بالحد الأدنى من تدفق الغاز. افتح صمام منظم الضغط ببطء عن طريق الدوران في اتجاه عقارب الساعة.اغسل الغرفة بخليط الغاز لمدة خمس دقائق بمعدل تدفق 20 لترا في الدقيقة. افصل الغرفة عن مصدر الغاز وأغلق كلا المشابك البلاستيكية البيضاء بإحكام. قم بإيقاف تشغيل صمام التحكم في تدفق الخزان عن طريق الدوران في اتجاه عقارب الساعة.أغلق صمام منظم الضغط عن طريق الدوران عكس اتجاه عقارب الساعة. ضع غرفة نقص الأكسجة في حاضنة تقليدية عند 37 درجة مئوية لمدة أربع ساعات. ضع أداة TEER المعقمة في خزانة السلامة الحيوية وقم بتوصيل الأقطاب الكهربائية بمقياس فولت أوم الظهاري.تعقيم الأقطاب الكهربائية في 30 ملليلتر من محلول كحول الأيزوبروبيل 70٪ لمدة لا تقل عن 30 دقيقة. قم بتشغيل أداة TEER واضبط الوظيفة على أوم. قم بإزالة الأقطاب الكهربائية من محلول كحول الأيزوبروبيل بنسبة 70٪ وضعها في 20 ملليلتر من برنامج تلفزيوني دولبيكو لمدة لا تقل عن 30 دقيقة حتى تقرأ القراءة الرقمية على جهاز TEER صفر أوم.أدخل الشق الطويل للقطب من خلال إحدى الفتحات الثلاث في حظيرة إدخال البئر في التحكم في إدخال البئر الفارغ وخفضه حتى يلامس قاع البئر. تأكد من أن الشق القصير يستريح فوق الثقافة القمية في الجزء السفلي من إدخال البئر. انتظر حتى يتم إيقاف قيم القراءة الرقمية على مستوى أداة TEER قبل تسجيل القيمة.ضع الأقطاب الكهربائية مرة أخرى في برنامج تلفزيوني Dulbecco لغسلها بين القياسات. استمر في جمع جميع قياسات TEER لاثنين من عناصر التحكم في إدراج البئر الفارغة. اجمع قياسات TEER لألواح العينة كما هو موضح سابقا.بمجرد إجراء جميع القياسات ، يعود القطب إلى محلول كحول الأيزوبروبيل بنسبة 70٪ لمدة 30 دقيقة. ثم افصل الأقطاب الكهربائية عن أداة TEER واتركها تجف في الهواء. احسب قيم TEER.استنشاق الوسط من الحجرة القاعدية واستبداله بمليلين من وسط نمو الخلايا البطانية الحرة باللون الأحمر الفينول في نموذج الحاجز الدموي الدماغي لثقافة الخلايا الثلاثية. اغسل الخلايا في المقصورة القمية مرتين باستخدام HBSS. أضف ملليلتر واحد من محلول ديكستران FITC في المقصورة القمية وقم بتغطية اللوحة بورق الألمنيوم ، ثم ضع اللوحة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة.خذ 100 ميكرولتر من الوسط من المقصورات القاعدية وانقلها إلى لوحة سوداء ذات 96 بئرا. قم بقياس التألق باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة مع ضبط الأطوال الموجية للإثارة والانبعاث على 480 و 530 نانومتر على التوالي. قم بزرع 200 ميكرولتر من HBMEC والخلايا النجمية الأولية و HBVP في وسط أطباق القاع الزجاجي المطلي ب poly-D-lysine مقاس 35 ملم بكثافة 150،000 خلية لكل طبق.قبل بذر "إتش بي إم إي سي"، قم بتغطية الجزء السفلي من الأطباق بعامل الربط. اسمح للخلايا بالالتصاق بالسطح الزجاجي عن طريق تركها طوال الليل عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون. بمجرد الوصول إلى نقطة التقاء ، تخلص من وسط الاستزراع وأضف مليلتر من الوسط الخالي من الجلوكوز الذي تم تسخينه مسبقا للحرمان من الأكسجين والجلوكوز أو الوسط العادي للضوابط.بعد علاج الحرمان من الأكسجين والجلوكوز ، استبدل الوسيط بوسيط التصوير المحسن في جميع الأطباق ، ثم قم بإجراء تصوير الخلايا الحية الفلورية باستخدام مرشح GFP وحاضنة المجهر متحد البؤر في المرحلة العليا كما هو موضح في مخطوطة النص. تم تقييم سلامة الحاجز الأحادي البطاني في تكوينات نموذج الحاجز الدموي الدماغي المشار إليه من خلال تحديد TEER قبل وبعد الحرمان من الأكسجين والجلوكوز ، وكذلك بعد 24 ساعة من إعادة الأكسجين. لمدة أربع ساعات، تسبب الحرمان من الأكسجين والجلوكوز في انخفاض كبير في قيم TEER فقط في الزراعة الأحادية ل HBMEC ونموذج الاستزراع المشترك مع HBMEC و HBVP.وصلت هذه المستويات المنخفضة إلى مستويات خط الأساس بعد 24 ساعة من إعادة الأكسجين. كانت قيم TEER في نموذج الزراعة المشتركة الثلاثية أعلى بكثير من تلك الموجودة في ضوابط الزراعة المشتركة المزدوجة أو التحكم في الزراعة الأحادية مباشرة بعد الحرمان من الأكسجين والجلوكوز. زادت نفاذية الطبقات الأحادية البطانية إلى 20 كيلو دالتون من الكتلة الجزيئية ، FITC dexthan ، بشكل كبير في الزراعة الأحادية HBMEC وبدرجة أقل في نموذج الاستزراع المشترك مع HBMEC و HBVP مقارنة بالضوابط المعيارية.علاوة على ذلك ، كانت مستويات نفاذية ديكستران 20 كيلودالتون FITC هي الأدنى في نموذج حاجز الدم الثلاثي بين الدماغ بين جميع النماذج في ظل ظروف الحرمان من الجلوكوز والأكسجين المعياري. لم يلاحظ أي تغييرات في تدفق 70 كيلودالتون ، FITC ديكستران عبر أحاديات الطبقة البطانية في أي من النماذج. أظهرت جميع الأنواع البشرية الأولية المعرضة للحرمان من الأكسجين والجلوكوز مضانا أخضر قويا ، مما يثبت أن الخلايا الحية المصورة كانت تعاني من نقص الأكسجين.بعد زرع pericytes الأوعية الدموية في الدماغ البشري على الجانب abluminal من إدراج البئر ، من المهم جدا تغطيتها مع لوحة الوجه لمنع التبخر. في نموذجنا ، نستخدم قطر مسام صغير نسبيا يبلغ 0.4 ميكرومتر من إدخالات بئر البوليستر مما يجعله مناسبا لفحص الأدوية المرشحة لأي مرض يتطلب عبور الحاجز الدموي الدماغي للعلاج. توفر هذه التقنية فرصة ممتازة لتصور تعديل البروتينات والناقلات إذا لزم الأمر.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization والتعبير وتنقية، وتبلور من السيروتونين الناقل الإنسان ملزمة ل<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

باستخدام سقالة الليبوزومات لإعادة تفاعلات البروتين البروتين، الدهون القريب<em&gt; في المختبر</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

وقت حل التأين electrospray الهيدروجين، الديوتيريوم تبادل الطيف الكتلي لدراسة بنية البروتين وديناميكية

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

سهل التلاعب بأبنية في الهلاميات المائية المستندة إلى البروتين لتطبيقات ثقافة الخلية

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

أسلوب قياس ألوان لقياس محتوى الحديد في النباتات

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

خالية من المعايرة في المختبر الكمي للبروتين هومو-أوليجوميريزيشن باستخدام الأجهزة التجارية والحرة والمفتوحة المصدر برمجيات التحليل السطوع

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

دراسة التمثيلات الحمض النووي الريبي للبروتين كيناز المنشط الجيش الملكي النيبالي خلال دورة الخلية الثديية

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput

استراتيجية لتحديد المركبات التي تؤثر على نمو الخلايا والبقاء على قيد الحياة في خلايا الثدييات المستزرعة في الإنتاجية المنخفضة إلى المتوسطة

Cytotoxicity is a critical parameter that needs to be quantified when studying drugs that may have therapeutic benefits. Because of this, many drug ...

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability DARTS assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

شبه كمية المخدرات تقارب استجابة الهدف الاستقرار (DARTS) دراسة التفاعل راباميسين / mTOR

Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) is a robust method for detection of novel small molecule protein targets. It can be used to verify known ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

تطبيق قياس التداخل الحيوي (BLI) لدراسة تفاعلات البروتين والبروتين في النسخ

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...