Name: a triple primary cell culture model of the human blood-brain barrier for studying ischemic stroke in vitro
Uploaded: 2022-10-06T14:05:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH) tilskud MH128022, MH122235, MH072567, MH122235, HL126559, DA044579, DA039576, DA040537, DA050528 og DA047157.

BEMÆRK: Se materialetabellen for detaljer relateret til alle celler, materialer, udstyr og løsninger, der bruges i denne protokol.
1. Indstilling af BBB-model med tredobbelt cellekultur
<ol><li>Såning pericytter<ol><li>Dyrk HBVP i T75-kulturkolber med en aktiveret overflade til celleadhæsion i en 5% CO2 -inkubator ved 37 ° C, indtil den er sammenflydende. Når sammenløbet er nået, skal du opsuge det gamle pericytmedium og vaske cellerne med...

<ol>
	<li>Mozaffarian, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+disease+and+stroke+statistics-2016+update:+a+report+from+the+American+Heart+Association.">Heart disease and stroke statistics-2016 update: a report from the American Heart Association.</a> Circulation. 133 (94), 38 (2016).</li><li>Yousufuddin, M., Young, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+and+ischemic+stroke.">Aging and ischemic stroke.</a> Aging. 11 (9), 2542-2544 (2019).</li><li>Donkor, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroke+in+the+21st+century:+a+snapshot+of+the+burden,+epidemiology,+and+quality+of+life.">Stroke in the 21st century: a snapshot of the burden, epidemiology, and quality of life.</a> Stroke Research and Treatment. , 3238165 (2018).</li><li>Kadry, H., Noorani, B., Cucullo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+blood-brain+barrier+overview+on+structure,+function,+impairment,+and+biomarkers+of+integrity.">A blood-brain barrier overview on structure, function, impairment, and biomarkers of integrity.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 17 (1), 69 (2020).</li><li>Brown, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+and+neurovascular+function+in+the+healthy+and+diseased+brain.">Pericytes and neurovascular function in the healthy and diseased brain.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 282 (2019).</li><li>Cabezas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+modulation+of+blood+brain+barrier:+perspectives+on+Parkinson's+disease.">Astrocytic modulation of blood brain barrier: perspectives on Parkinson's disease.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 211 (2014).</li><li>Abdullahi, W., Tripathi, D., Ronaldson, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+dysfunction+in+ischemic+stroke:+targeting+tight+junctions+and+transporters+for+vascular+protection.">Blood-brain barrier dysfunction in ischemic stroke: targeting tight junctions and transporters for vascular protection.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 315 (3), 343-356 (2018).</li><li>Candelario-Jalil, E., Dijkhuizen, R. M., Magnus, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammation,+stroke,+blood-brain+barrier+dysfunction,+and+imaging+modalities.">Neuroinflammation, stroke, blood-brain barrier dysfunction, and imaging modalities.</a> Stroke. 53 (5), 1473-1486 (2022).</li><li>He, Y., Yao, Y., Tsirka, S. E., Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-culture+models+of+the+blood-brain+barrier.">Cell-culture models of the blood-brain barrier.</a> Stroke. 45 (8), 2514-2526 (2014).</li><li>Thomsen, L. B., Burkhart, A., Moos, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+triple+culture+model+of+the+blood-brain+barrier+using+porcine+brain+endothelial+cells,+astrocytes+and+pericytes.">A triple culture model of the blood-brain barrier using porcine brain endothelial cells, astrocytes and pericytes.</a> PLoS One. 10 (8), 0134765 (2015).</li><li>Song, Y., Cai, X., Du, D., Dutta, P., Lin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+blood-brain+barrier+models+for+in+vitro+biological+analysis:+one+cell+type+vs+three+cell+types.">Comparison of blood-brain barrier models for in vitro biological analysis: one cell type vs three cell types.</a> ACS Applied Bio Materials. 2 (3), 1050-1055 (2019).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+nanoparticles+induce+tight+junction+disruption+and+astrocyte+neurotoxicity+in+a+rat+blood-brain+barrier+primary+triple+coculture+model.">Silver nanoparticles induce tight junction disruption and astrocyte neurotoxicity in a rat blood-brain barrier primary triple coculture model.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 6105-6118 (2015).</li><li>Appelt-Menzel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+human+blood-brain+barrier+co-culture+model+mimicking+the+neurovascular+unit+using+induced+pluri-+and+multipotent+stem+cells.">Establishment of a human blood-brain barrier co-culture model mimicking the neurovascular unit using induced pluri- and multipotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 894-906 (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+construction+of+a+reversible+arylazo-based+NIR+probe+for+cycling+hypoxia+imaging+in+vivo.">Rational construction of a reversible arylazo-based NIR probe for cycling hypoxia imaging in vivo.</a> Nature Communications. 12 (1), 2772 (2021).</li><li>Palacio-Casta&#241;eda, V., Kooijman, L., Venzac, B., Verdurmen, W. P. R., Le Gac, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+switching+of+tumor+cells+under+hypoxic+conditions+in+a+tumor-on-a-chip+model.">Metabolic switching of tumor cells under hypoxic conditions in a tumor-on-a-chip model.</a> Micromachines. 11 (4), 382 (2020).</li><li>Ramsauer, M., Krause, D., Dermietzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+of+the+blood-brain+barrier+in+vitro+and+the+function+of+cerebral+pericytes.">Angiogenesis of the blood-brain barrier in vitro and the function of cerebral pericytes.</a> FASEB Journal. 16 (10), 1274-1276 (2002).</li><li>Lyck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALCAM+(CD166)+is+involved+in+extravasation+of+monocytes+rather+than+T+cells+across+the+blood-brain+barrier.">ALCAM (CD166) is involved in extravasation of monocytes rather than T cells across the blood-brain barrier.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 37 (8), 2894-2909 (2017).</li><li>Rizzi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+triple+culture+cell+system+modeling+the+human+blood-brain+barrier.">A triple culture cell system modeling the human blood-brain barrier.</a> Journal of Visualized Experiments. (177), (2021).</li><li>Kumar, S., Shaw, L., Lawrence, C., Lea, R., Alder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P50:+Developing+a+physiologically+relevant+blood+brain+barrier+model+for+the+study+of+drug+disposition+in+glioma.">P50: Developing a physiologically relevant blood brain barrier model for the study of drug disposition in glioma.</a> Neuro-Oncology. 16 (6), (2014).</li><li>Stone, N. L., England, T. J., O'Sullivan, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+transwell+blood+brain+barrier+model+using+primary+human+cells.">A novel transwell blood brain barrier model using primary human cells.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 230 (2019).</li><li>Al Ahmad, A., Taboada, C. B., Gassmann, M., Ogunshola, O. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+and+pericytes+differentially+modulate+blood-brain+barrier+characteristics+during+development+and+hypoxic+insult.">Astrocytes and pericytes differentially modulate blood-brain barrier characteristics during development and hypoxic insult.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 31 (2), 693-705 (2011).</li></ol>

I denne protokol beskriver vi en metode til at oprette en pålidelig tredobbelt endotelcelle-pericyt-astrocytkultur BBB-model til undersøgelse af BBB-dysfunktion i indstillingen af iskæmisk slagtilfælde in vitro. I betragtning af at pericytter er de nærmeste naboer til endotelceller in vivo, er HBVP belagt på undersiden af brøndindsatserne i denne model16. Selvom denne konfiguration mangler den direkte celle-til-celle-kommunikation mellem astrocytter og endotelceller, giver...

Slagtilfælde er en af de førende årsager til død og langvarig invaliditet på verdensplan1. Forekomsten af slagtilfælde stiger hurtigt med alderen og fordobles hvert 10. år efter 55 år2. Iskæmisk slagtilfælde opstår som følge af cerebral blodgennemstrømningsforstyrrelse på grund af trombotiske og emboliske hændelser, som omfatter mere end 80% af alle slagtilfældetilfælde 3. Selv nu er der relativt få behandlingsmuligheder til rådighed for at minimere vævsdød efter iskæmisk slagtilfælde. De behandlinger, der findes, er tidsfølsomme og fører derfor ikke altid til gode kliniske resultater. Derfor er der et presserende behov for forskning i komplekse cellulære mekanismer af iskæmisk slagtilfælde, der påvirker genopretning efter slagtilfælde.
BBB er en dynamisk grænseflade til udveksling af molekyler mellem blodet og hjernens parenchym. Strukturelt består BBB af hjernemikrovaskulære endotelceller forbundet med krydsende komplekser omgivet af en kældermembran, pericytter og astrocytiske endfeet4. Pericytter og astrocytter spiller en væsentlig rolle i opretholdelsen af BBB-integritet gennem udskillelse af forskellige faktorer, der er nødvendige for dannelsen af stærke, tætte kryds 5,6. Nedbrydningen af BBB er et af kendetegnene ved iskæmisk slagtilfælde. Akut inflammatorisk respons og oxidativ stress forbundet med cerebral iskæmi resulterer i forstyrrelse af tætte krydsproteinkomplekser og dysreguleret krydstale mellem astrocytter, pericytter og endotelceller, hvilket fører til øget paracellulær opløst stofpermeabilitet på tværs af BBB7. BBB dysfunktion fremmer yderligere dannelsen af hjerneødem og øger risikoen for hæmoragisk transformation8. I betragtning af alt det ovenstående er der stor interesse for at forstå de molekylære og cellulære ændringer, der forekommer på BBB-niveau under og efter iskæmisk slagtilfælde.
Selvom mange in vitro BBB-modeller er blevet udviklet i løbet af de seneste årtier og brugt i en række undersøgelser, kan ingen af dem fuldt ud replikere in vivo-forhold 9. Mens nogle modeller er baseret på endotelcellemonolag dyrket på gennemsatte permeable understøtninger alene eller i kombination med pericytter eller astrocytter, har kun nyere undersøgelser introduceret tredobbelt cellekulturmodeldesign. Næsten alle eksisterende BBB-modeller med tredobbelt kultur inkorporerer primære hjerneendotelceller sammen med astrocytter og pericytter isoleret fra dyrearter eller celler afledt af humane pluripotente stamceller10,11,12,13.
I erkendelse af behovet for bedre at rekapitulere den menneskelige BBB in vitro etablerede vi en tredobbelt cellekultur in vitro BBB-model sammensat af humane hjernemikrovaskulære endotelceller (HBMEC), primære humane astrocytter (HA) og primære humane hjernevaskulære pericytter (HBVP). Denne tredobbelte kultur BBB-model er sat op på 6-brønds plade, polyestermembranindsatser med 0,4 μm porestørrelse. Disse brøndindsatser giver et optimalt miljø for cellefastgørelse og muliggør nem adgang til både apikale (blod) og basolaterale (hjerne) rum til medium prøveudtagning eller sammensat anvendelse. Funktionerne i denne foreslåede tredobbelte cellekultur BBB-model vurderes ved at måle TEER og paracellulær flux efter OGD, der efterligner iskæmisk slagtilfælde in vitro, med mangel på ilt (<1%O2) og næringsstoffer (ved anvendelse af glukosefrit medium) opnået ved anvendelse af et befugtet, forseglet kammer. Derudover verificeres inducerede iskæmiske tilstande i denne model nøjagtigt ved direkte visualisering af hypoxiske celler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 mm Transwell with 0.4 &#181;m Pore Polyester Membrane Insert</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Glass Bottom Dishes</td>
			<td>MatTek Life Sciences (FISHERSCI)</td>
			<td>P35GC-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Astrocyte Medium</td>
			<td>Science Cell</td>
			<td>1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attachment Factor</td>
			<td>Cell Systems (Fisher Scientific)</td>
			<td>4Z0-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 60 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrainPhys Imaging Optimized Medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Classic Medium With Serum and CultureBoost</td>
			<td>4Z0-500</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes (Conical Bottom with CentriStar Cap</td>
			<td>VWR</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 75cm&#178; U-Shaped Canted Neck Not Treated Cell Culture Flask&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431464U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning CellBIND 96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countes Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ZGEXSCCOUNTESS2FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decon CiDehol 70 Isopropyl Alcohol Solution&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>04-355-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Petri Dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Medium (No glucose, No glutamine, No phenol red)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A14430-01</td>
			<td>Glucose-free medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (No Calcium, No Magnesium)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM Endothelial Cell Growth Basal Medium, Phenol Red Free, 500 mL</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM2 Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter with STX2 electrodes</td>
			<td>World Precison Instruments</td>
			<td>NC9792051</td>
			<td>Epithelial voltohmmeter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate&#8211;dextran (wt 20,000)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>FD20-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate&#8211;dextran (wt 70,000)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>FD70S-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorview FV3000 Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Tank (95% N2, 5% CO2)</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>X02NI95C2003071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (No calcium, No magnesium, no phenol red)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Astrocytes</td>
			<td>Science Cell</td>
			<td>1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Brain Vascular Pericytes</td>
			<td>Science Cell</td>
			<td>1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxia Incubator Chamber</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>27310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image-iT Green Hypoxia Reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>I14834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pericyte Medium</td>
			<td>Science Cell</td>
			<td>1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Human Brain Microvascular Endothelial Cells</td>
			<td>ACBRI 376</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking Platform Shaker, Double</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10860-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Flow Meter</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>27311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax iD3 Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>75886-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, 25 mm, 0.22 &#956;m, PVDF, Sterile</td>
			<td>NEST Scientific</td>
			<td>380121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP Mutli-well Plates (6 wells)</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>TP92406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP Tissue Culture Flasks T-75 Flasks</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>TP90075</td>
			<td>Flasks with activated surface for cell adhesion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Distilled Water</td>
			<td>Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td>10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uno Stage Top Incubator-</td>
			<td>Oko Lab</td>
			<td>UNO-T-H-CO2-TTL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a triple primary cell culture model of the human blood-brain barrier for studying ischemic stroke in vitro

Iskæmisk slagtilfælde er en væsentlig årsag til død og handicap over hele verden med begrænsede terapeutiske muligheder. Neuropatologien af iskæmisk slagtilfælde er kendetegnet ved en afbrydelse i blodforsyningen til hjernen, der fører til celledød og kognitiv dysfunktion. Under og efter iskæmisk slagtilfælde letter blod-hjerne-barriere (BBB) dysfunktion skadeprogression og bidrager til dårlig patientgendannelse. Nuværende BBB-modeller omfatter primært endotelmonokulturer og dobbeltkulturer med enten astrocytter eller pericytter.
Sådanne modeller mangler evnen til fuldt ud at efterligne et dynamisk hjernemikromiljø, hvilket er afgørende for celle-til-celle-kommunikation. Derudover indeholder almindeligt anvendte BBB-modeller ofte udødeliggjorte humane endotelceller eller dyreafledte (gnaver-, svine- eller kvæg) cellekulturer, der udgør translationelle begrænsninger. Dette papir beskriver en ny velindsætbaseret BBB-model, der kun indeholder primære humane celler (hjernemikrovaskulære endotelceller, astrocytter og hjernevaskulære pericytter), der muliggør undersøgelse af iskæmisk hjerneskade in vitro. 
Virkningerne af ilt-glukosemangel (OGD) på barriereintegritet blev vurderet ved passiv permeabilitet, transendotelial elektrisk modstand (TEER) målinger og direkte visualisering af hypoxiske celler. Den præsenterede protokol giver en klar fordel, der efterligner BBB's intercellulære miljø in vivo, og tjener som en mere realistisk in vitro BBB-model til udvikling af nye terapeutiske strategier inden for indstilling af iskæmisk hjerneskade.

For at undersøge virkningerne af astrocytter og pericytter på barrierefunktionen af HBMEC konstruerede vi BBB-modellen med tredobbelt cellekultur på cellekulturindsatser (figur 1A) sammen med HBMEC-monokultur og to dobbelte co-kulturmodeller som kontroller (figur 1B). Dobbelt co-kultur kontrol omfattede en ikke-kontakt co-kultur af HBMEC med HA og kontakt co-kultur af HBMEC med HBVP. Efter 6 dage i samkultur blev alle eksperimentelle opsætninger udsat for OG...

Watch this Scientific Journal Video about A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro at JoVE.com

A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro

Her beskriver vi metoden til etablering af en tredobbelt cellekulturmodel af blod-hjerne-barrieren baseret på primære menneskelige hjernemikrovaskulære endotelceller, astrocytter og pericytter. Denne multicellulære model er velegnet til undersøgelser af neurovaskulær enhedsdysfunktion under iskæmisk slagtilfælde in vitro eller til screening af lægemiddelkandidater.

En tredobbelt primær cellekulturmodel af den menneskelige blod-hjerne-barriere til undersøgelse af iskæmisk slagtilfælde in vitro

Ischemic stroke is a major cause of death and disability worldwide with limited therapeutic options. The neuropathology of ischemic stroke is ...

Vores protokol anerkender behovet for bedre at rekapitulere den menneskelige blod-hjerne-barriere in vitro til undersøgelse af komplekse cellulære mekanismer, der påvirker genopretning efter slagtilfælde. Vores tredobbelte model udviser robust integritet, som delvis er relateret til store opdelinger af brøndindsatser, hvilket giver os mulighed for at reducere ændringsfrekvensen og undgå forstyrrelser af populationer. Vores model er et godt værktøj til at studere de molekylære og cellulære ændringer, der opstår ved blod-hjerne-barrieren under og efter iskæmisk slagtilfælde.Vores protokol gør det muligt at opdage nye mål og terapi for at forbedre genopretningen efter slagtilfælde. Nuværende behandlinger for iskæmisk slagtilfælde er tidsfølsomme og er derfor ikke altid effektive. Begynd med at dyrke HBVP i T75-kulturkolber med en aktiveret overflade til celleadhæsion i en 5% kuldioxidinkubator ved 37 grader Celsius, indtil den er sammenflydende.Når sammenløbet er nået, skal du opsuge det gamle pericytmedium og vaske cellerne med fem milliliter varm Dulbeccos PBS. Aspirer Dulbeccos PBS og løsner cellerne fra kolben ved hjælp af en kombination af fire milliliter varm trypsin EDTA-opløsning og en milliliter Dulbeccos PBS. Kolben inkuberes i fem minutter ved 37 grader Celsius i en kuldioxidinkubator.Se under et mikroskop for at bekræfte, om cellerne er løsrevet fra kolben. Tilsæt fem milliliter varmt pericytmedium indeholdende 2% FBS til kolben og overfør de løsrevne celler til et 50 ml centrifugerør. Centrifuger cellesuspensionen i tre minutter ved 200 g, så cellerne kan danne en pellet i bunden af røret.Aspirer mediet fra røret, hvilket sikrer, at cellepelleten forbliver intakt. Suspender cellepelleten igen i pericytmedium. Beregn mængden af medium afhængigt af sammenløbet af cellerne og antallet af nødvendige brøndindsatser.Tag 10 mikroliter af de gensuspenderede celler, læg dem i et celletællingsdias, og tæl antallet af celler. Bestem celletætheden og frø 300.000 celler pr. indsats i en milliliter pericytmedium på den abluminale side af brøndindsatserne. Dyrk primære menneskelige astrocytter ved hjælp af astrocytmediet, der indeholder 2% FBS som beskrevet i tekstmanuskriptet.Bestem celletætheden og frø 300.000 celler pr. Brønd på bunden af vævskulturen seks-brøndplader. Dæk pladen for at forhindre fordampning og inkubere natten over. På samme måde dyrkes HBMEC i servietter ved hjælp af komplet klassisk medium indeholdende 10% FBS som beskrevet i tekstmanuskriptet.Tag vævskulturen seks-brøndplader indeholdende astrocytter og brøndindsatserne indeholdende pericytter fra inkubatoren. Aspirer astrocytmediet fra vævskulturen seks-brøndplader og tilsæt en milliliter pericytmedium og en milliliter astrocytmedium til hver brønd. Aspirer pericytmediet fra brøndindsatserne og læg dem i vævskulturen seks-brøndplader indeholdende de seedede astrocytter.Frø HBMEC ved en tæthed på 300.000 celler pr. Brønd i to milliliter komplet klassisk medium på den apikale side af de samme brøndindsatser. Vask cellerne tre gange med Dulbeccos PBS. For tredobbelte cellekulturer, der udsættes for ilt-glukosemangel, tilsættes glukosefrit medium til både de apikale og basolaterale rum.Udskift kulturmediet med friske medium og normoxiske kontrolcellekulturer. Placer kontrol tredobbelte kulturer i 5% kuldioxidinkubatoren ved 37 grader Celsius. Anbring en petriskål indeholdende 20 ml sterilt vand i hypoxiinkubatorkammeret for at give tilstrækkelig befugtning af kulturerne.Åbn kammeret ved at frigøre ringklemmen, og arranger derefter cellekulturerne på hylderne. Forsegl kammeret ved at fastgøre ringklemmen. Åbn kammerets indløbs- og udløbsporte, og fastgør slangen fra toppen af kammerets flowmåler.Fastgør slangen fra bunden af flowmåleren til gastanken via et luftfilter. Åbn tankflowreguleringsventilen ved at dreje den mod uret for at tillade minimal gasstrøm. Åbn langsomt trykregulatorventilen ved at dreje med uret.Skyl kammeret med gasblandingen i fem minutter med en strømningshastighed på 20 liter pr. Minut. Frakobl kammeret fra gaskilden, og luk begge hvide plastklemmer fast. Sluk for tankens flowkontrolventil ved at dreje med uret.Luk trykregulatorventilen ved at dreje mod uret. Placer hypoxikammeret i en konventionel inkubator indstillet til 37 grader Celsius i fire timer. Anbring det steriliserede TEER-instrument i biosikkerhedsskabet, og sæt elektroderne i epitelvolt ohm-måleren.Steriliser elektroderne i 30 ml 70% isopropylalkoholopløsning i mindst 30 minutter. Tænd for TEER-instrumentet, og indstil funktionen til ohm. Fjern elektroderne fra 70% isopropylalkoholopløsningen, og læg dem i 20 ml Dulbeccos PBS i mindst 30 minutter, indtil den digitale udlæsning på TEER-enheden læser nul ohm.Indsæt elektrodens lange spids gennem en af de tre åbninger i brøndindsatshangaren på den tomme brøndindsatskontrol, der sænker den, indtil den berører bunden af brønden. Sørg for, at den korte spids hviler over den apikale kultur på bunden af brøndindsatsen. Vent, indtil de digitale udlæsningsværdier på TEER-instrumentet er slået fra, før værdien registreres.Placer elektroderne tilbage i Dulbeccos PBS for at vaske dem mellem målingerne. Fortsæt med at indsamle alle TEER-målinger til yderligere to blanke brøndindsatskontroller. Der indsamles TEER-målingerne af prøvepladerne som vist tidligere.Når alle målinger er foretaget, vender elektroden tilbage i 70% isopropylalkoholopløsningen i 30 minutter. Frakobl derefter elektroderne fra TEER-instrumentet, og lad dem lufttørre. Beregn TEER-værdierne.Aspirer mediet fra det basolaterale rum og erstat det med to milliliter phenolrødt frit endotelcellevækstmedium i den tredobbelte cellekultur blod-hjerne-barrieremodel. Vask cellerne i det apikale rum to gange med HBSS. Tilsæt en milliliter af FITC dextran-opløsningen i det apikale rum og dæk pladen med aluminiumsfolie, og anbring derefter pladen i inkubatoren indstillet til 37 grader Celsius med 5% kuldioxid i en time.Tag 100 mikroliter medium fra de basolaterale rum og overfør det til en sort 96-brøndplade. Mål fluorescensen ved hjælp af en mikropladelæser med excitations- og emissionsbølgelængderne indstillet til henholdsvis 480 og 530 nanometer. Frø 200 mikroliter HBMEC, primære astrocytter og HBVP i midten af poly-D-lysinbelagte 35 millimeter glasbundskåle med en tæthed på 150.000 celler pr. Skål.Før såning af HBMEC skal du belægge bunden af opvasken med fastgørelsesfaktoren. Lad cellerne fastgøres til glasoverfladen ved at lade dem stå natten over ved 37 grader Celsius i en kuldioxidinkubator. Når sammenløbet er nået, kasseres kulturmediet og tilsættes to milliliter forvarmet glukosefrit medium til ilt-glukosemangel eller normalt medium til kontrol.Efter behandling af ilt-glukosemangel skal du erstatte mediet med det billeddannende optimerede medium i alle retter og derefter udføre fluorescens levende cellebilleddannelse med GFP-filteret og det øverste trin konfokalmikroskopinkubator som beskrevet i tekstmanuskriptet. Barriereintegriteten af endotelmonolaget i de angivne blod-hjerne-barrieremodelkonfigurationer blev vurderet ved at bestemme TEER før og efter ilt-glukosemangel såvel som efter 24 timers re-oxygenering. I fire timer forårsagede ilt-glukosefratagelsen kun et signifikant fald i TEER-værdier i HBMEC-monokultur og co-kulturmodellen med HBMEC og HBVP.Disse nedsatte niveauer nåede basisniveauerne efter 24 timers iltning igen. TEER-værdierne i den tredobbelte co-kulturmodel var signifikant højere end dem i den dobbelte co-kulturkontrol eller monokulturkontrol umiddelbart efter ilt-glukosemangel. Den paracellulære permeabilitet af endotelmonolag til 20 kilodalton molekylmasse, FITC dextran, blev drastisk øget i HBMEC-monokulturen og i mindre grad i samkulturmodellen med HBMEC og HBVP sammenlignet med normoxiske kontroller.Desuden var 20 kilodalton FITC dextranpermeabilitetsniveauer de laveste i den tredobbelte hjerne-blodbarrieremodel blandt alle modeller under normoxiske og ilt-glukosemangelforhold. Der blev ikke observeret ændringer i 70 kilodalton, FITC dextran flux på tværs af endotel monolag i nogen af modellerne. Alle primære menneskelige typer udsat for ilt-glukosemangel udviste stærk grøn fluorescens, hvilket beviste, at de afbildede levende celler var hypoxiske.Efter såning af menneskelige hjernevaskulære pericytter på den abluminale side af brøndindsatser er det meget vigtigt at dække dem med flippladen for at forhindre fordampning. I vores model bruger vi en relativt lille porediameter på 0,4 mikrometer polyesterbrønde, hvilket gør den velegnet til screening af lægemiddelkandidater til enhver sygdom, der kræver krydsning af blod-hjerne-barrieren til behandling. Denne teknik giver en glimrende mulighed for at visualisere modifikation af proteiner og transportører, hvis det er nødvendigt.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Termostabilisering, Expression, Rensning, og Krystallisation af Human Serotonin Transporter Bundet til<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Brug Stillads Liposomer at Rekonstituer Lipid-proksimal protein-protein interaktioner<em&gt; In vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrosprayioniserings Brint-deuterium Exchange-massespektrometri til at studere proteiners struktur og Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Let Manipulation af arkitekturer i Protein-baseret Hydrogels til celle kultur applikationer

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

En kolorimetriske metode til måling af jernindhold i planter

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrering-fri In Vitro kvantificering af Protein Homo-oligomerisering ved hjælp af kommercielle instrumentering og gratis, Open Source lysstyrke analyse Software

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

At studere RNA Interactors af Protein Kinase RNA-aktiveret under pattedyr cellecyklus

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput

En strategi til identificering af forbindelser, der påvirker cellevækst og overlevelse i dyrkede pattedyrceller ved lav til moderat gennemløb

Cytotoxicity is a critical parameter that needs to be quantified when studying drugs that may have therapeutic benefits. Because of this, many drug ...

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability DARTS assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

En semi-kvantitativ stof affinitet lydhør Target stabilitet (dart) assay til at studere Rapamycin/mTOR interaktion

Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) is a robust method for detection of novel small molecule protein targets. It can be used to verify known ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Anvendelse af Biolayer interferometri (BLI) til undersøgelse af protein-protein interaktioner i transkriptionen

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...