Name: a triple primary cell culture model of the human blood-brain barrier for studying ischemic stroke in vitro
Uploaded: 2022-10-06T14:05:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) subsidies MH128022, MH122235, MH072567, MH122235, HL126559, DA044579, DA039576, DA040537, DA050528 en DA047157.

OPMERKING: Zie de tabel met materialen voor meer informatie over alle cellen, materialen, apparatuur en oplossingen die in dit protocol worden gebruikt.
1. Drievoudige celcultuur BBB-modelinstelling
<ol><li>Zaaien van pericyten<ol><li>Kweek HBVP in T75 kweekkolven met een geactiveerd oppervlak voor celhechting in een 5% CO2-incubator bij 37 °C tot confluent. Zodra de samenvloeiing is bereikt, ademt u het oude pericytenmedium aan en wast u de cell...

<ol>
	<li>Mozaffarian, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+disease+and+stroke+statistics-2016+update:+a+report+from+the+American+Heart+Association.">Heart disease and stroke statistics-2016 update: a report from the American Heart Association.</a> Circulation. 133 (94), 38 (2016).</li><li>Yousufuddin, M., Young, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+and+ischemic+stroke.">Aging and ischemic stroke.</a> Aging. 11 (9), 2542-2544 (2019).</li><li>Donkor, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroke+in+the+21st+century:+a+snapshot+of+the+burden,+epidemiology,+and+quality+of+life.">Stroke in the 21st century: a snapshot of the burden, epidemiology, and quality of life.</a> Stroke Research and Treatment. , 3238165 (2018).</li><li>Kadry, H., Noorani, B., Cucullo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+blood-brain+barrier+overview+on+structure,+function,+impairment,+and+biomarkers+of+integrity.">A blood-brain barrier overview on structure, function, impairment, and biomarkers of integrity.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 17 (1), 69 (2020).</li><li>Brown, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+and+neurovascular+function+in+the+healthy+and+diseased+brain.">Pericytes and neurovascular function in the healthy and diseased brain.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 282 (2019).</li><li>Cabezas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+modulation+of+blood+brain+barrier:+perspectives+on+Parkinson's+disease.">Astrocytic modulation of blood brain barrier: perspectives on Parkinson's disease.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 211 (2014).</li><li>Abdullahi, W., Tripathi, D., Ronaldson, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+dysfunction+in+ischemic+stroke:+targeting+tight+junctions+and+transporters+for+vascular+protection.">Blood-brain barrier dysfunction in ischemic stroke: targeting tight junctions and transporters for vascular protection.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 315 (3), 343-356 (2018).</li><li>Candelario-Jalil, E., Dijkhuizen, R. M., Magnus, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammation,+stroke,+blood-brain+barrier+dysfunction,+and+imaging+modalities.">Neuroinflammation, stroke, blood-brain barrier dysfunction, and imaging modalities.</a> Stroke. 53 (5), 1473-1486 (2022).</li><li>He, Y., Yao, Y., Tsirka, S. E., Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-culture+models+of+the+blood-brain+barrier.">Cell-culture models of the blood-brain barrier.</a> Stroke. 45 (8), 2514-2526 (2014).</li><li>Thomsen, L. B., Burkhart, A., Moos, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+triple+culture+model+of+the+blood-brain+barrier+using+porcine+brain+endothelial+cells,+astrocytes+and+pericytes.">A triple culture model of the blood-brain barrier using porcine brain endothelial cells, astrocytes and pericytes.</a> PLoS One. 10 (8), 0134765 (2015).</li><li>Song, Y., Cai, X., Du, D., Dutta, P., Lin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+blood-brain+barrier+models+for+in+vitro+biological+analysis:+one+cell+type+vs+three+cell+types.">Comparison of blood-brain barrier models for in vitro biological analysis: one cell type vs three cell types.</a> ACS Applied Bio Materials. 2 (3), 1050-1055 (2019).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+nanoparticles+induce+tight+junction+disruption+and+astrocyte+neurotoxicity+in+a+rat+blood-brain+barrier+primary+triple+coculture+model.">Silver nanoparticles induce tight junction disruption and astrocyte neurotoxicity in a rat blood-brain barrier primary triple coculture model.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 6105-6118 (2015).</li><li>Appelt-Menzel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+human+blood-brain+barrier+co-culture+model+mimicking+the+neurovascular+unit+using+induced+pluri-+and+multipotent+stem+cells.">Establishment of a human blood-brain barrier co-culture model mimicking the neurovascular unit using induced pluri- and multipotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 894-906 (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+construction+of+a+reversible+arylazo-based+NIR+probe+for+cycling+hypoxia+imaging+in+vivo.">Rational construction of a reversible arylazo-based NIR probe for cycling hypoxia imaging in vivo.</a> Nature Communications. 12 (1), 2772 (2021).</li><li>Palacio-Casta&#241;eda, V., Kooijman, L., Venzac, B., Verdurmen, W. P. R., Le Gac, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+switching+of+tumor+cells+under+hypoxic+conditions+in+a+tumor-on-a-chip+model.">Metabolic switching of tumor cells under hypoxic conditions in a tumor-on-a-chip model.</a> Micromachines. 11 (4), 382 (2020).</li><li>Ramsauer, M., Krause, D., Dermietzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+of+the+blood-brain+barrier+in+vitro+and+the+function+of+cerebral+pericytes.">Angiogenesis of the blood-brain barrier in vitro and the function of cerebral pericytes.</a> FASEB Journal. 16 (10), 1274-1276 (2002).</li><li>Lyck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALCAM+(CD166)+is+involved+in+extravasation+of+monocytes+rather+than+T+cells+across+the+blood-brain+barrier.">ALCAM (CD166) is involved in extravasation of monocytes rather than T cells across the blood-brain barrier.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 37 (8), 2894-2909 (2017).</li><li>Rizzi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+triple+culture+cell+system+modeling+the+human+blood-brain+barrier.">A triple culture cell system modeling the human blood-brain barrier.</a> Journal of Visualized Experiments. (177), (2021).</li><li>Kumar, S., Shaw, L., Lawrence, C., Lea, R., Alder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P50:+Developing+a+physiologically+relevant+blood+brain+barrier+model+for+the+study+of+drug+disposition+in+glioma.">P50: Developing a physiologically relevant blood brain barrier model for the study of drug disposition in glioma.</a> Neuro-Oncology. 16 (6), (2014).</li><li>Stone, N. L., England, T. J., O'Sullivan, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+transwell+blood+brain+barrier+model+using+primary+human+cells.">A novel transwell blood brain barrier model using primary human cells.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 230 (2019).</li><li>Al Ahmad, A., Taboada, C. B., Gassmann, M., Ogunshola, O. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+and+pericytes+differentially+modulate+blood-brain+barrier+characteristics+during+development+and+hypoxic+insult.">Astrocytes and pericytes differentially modulate blood-brain barrier characteristics during development and hypoxic insult.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 31 (2), 693-705 (2011).</li></ol>

In dit protocol beschrijven we een methode om een betrouwbaar drievoudig endotheelcel-pericyten-astrocytenkweek BBB-model op te zetten voor het bestuderen van BBB-disfunctie in de setting van ischemische beroerte in vitro. Gezien het feit dat pericyten in vivo de dichtstbijzijnde buren van endotheelcellen zijn, zijn HBVP in dit model16 aan de onderkant van de putinzetstukken geplaatst. Hoewel deze configuratie de directe cel-naar-cel communicatie tussen astrocyten en endotheelcel...

Beroerte is wereldwijd een van de belangrijkste doodsoorzaken en langdurige invaliditeit1. De incidentie van beroerte neemt snel toe met de leeftijd en verdubbelt elke 10 jaar na de leeftijd van 552. Ischemische beroerte treedt op als gevolg van verstoring van de cerebrale bloedstroom als gevolg van trombotische en embolische gebeurtenissen, die meer dan 80% van alle gevallen van beroerte omvat3. Zelfs nu zijn er relatief weinig behandelingsopties beschikbaar om weefseldood na ischemische beroerte te minimaliseren. De behandelingen die er wel zijn, zijn tijdgevoelig en leiden bijgevolg niet altijd tot goede klinische resultaten. Daarom is onderzoek naar complexe cellulaire mechanismen van ischemische beroerte die het herstel na een beroerte beïnvloeden dringend nodig.
De BBB is een dynamische interface voor de uitwisseling van moleculen tussen het bloed en het hersenparenchym. Structureel bestaat de BBB uit microvasculaire endotheelcellen van de hersenen die onderling verbonden zijn door junctionele complexen omgeven door een keldermembraan, pericyten en astrocytische endfeet4. Pericyten en astrocyten spelen een essentiële rol bij het behoud van de integriteit van BBB door de afscheiding van verschillende factoren die nodig zijn voor de vorming van sterke, tight junctions 5,6. De afbraak van de BBB is een van de kenmerken van ischemische beroerte. Acute ontstekingsreactie en oxidatieve stress geassocieerd met cerebrale ischemie resulteert in de verstoring van tight junction eiwitcomplexen en ontregelde overspraak tussen astrocyten, pericyten en endotheelcellen, wat leidt tot verhoogde paracellulaire opgeloste permeabiliteit over de BBB7. BBB-disfunctie bevordert verder de vorming van hersenoedeem en verhoogt het risico op hemorragische transformatie8. Gezien al het bovenstaande is er grote interesse in het begrijpen van de moleculaire en cellulaire veranderingen die optreden op BBB-niveau tijdens en na ischemische beroerte.
Hoewel veel in vitro BBB-modellen de afgelopen decennia zijn ontwikkeld en in verschillende onderzoeken zijn gebruikt, kan geen van hen in vivo omstandigheden volledig repliceren9. Hoewel sommige modellen gebaseerd zijn op endotheelcelmonolagen gekweekt op goed ingebrachte permeabele steunen alleen of in combinatie met pericyten of astrocyten, hebben alleen recentere studies drievoudige celkweekmodelontwerpen geïntroduceerd. Bijna alle bestaande BBB-modellen met drievoudige cultuur bevatten primaire hersen endotheelcellen samen met astrocyten en pericyten geïsoleerd uit diersoorten of cellen afgeleid van menselijke pluripotente stamcellen 10,11,12,13.
Erkennend de noodzaak om de menselijke BBB in vitro beter samen te vatten, hebben we een drievoudig celkweek in vitro BBB-model opgezet dat bestaat uit microvasculaire endotheelcellen (HBMEC), primaire menselijke astrocyten (HA) en primaire vasculaire pericyten van de menselijke hersenen (HBVP). Dit BBB-model met drie kweken is opgesteld op 6-wells plaat, polyester membraaninzetstukken met een poriegrootte van 0,4 μm. Deze putinzetstukken bieden een optimale omgeving voor celaanhechting en bieden gemakkelijke toegang tot zowel apicale (bloed) als basolaterale (hersenen) compartimenten voor mediumbemonstering of samengestelde toepassing. De kenmerken van dit voorgestelde BBB-model met drievoudige celcultuur worden beoordeeld door teer en paracellulaire flux na OGD te meten die ischemische beroerte in vitro nabootst, met een tekort aan zuurstof (<1% O2) en voedingsstoffen (met behulp van glucosevrij medium) bereikt door een bevochtigde, afgesloten kamer te gebruiken. Bovendien worden geïnduceerde ischemische-achtige aandoeningen in dit model nauwkeurig geverifieerd door directe visualisatie van hypoxische cellen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 mm Transwell with 0.4 &#181;m Pore Polyester Membrane Insert</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Glass Bottom Dishes</td>
			<td>MatTek Life Sciences (FISHERSCI)</td>
			<td>P35GC-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Astrocyte Medium</td>
			<td>Science Cell</td>
			<td>1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attachment Factor</td>
			<td>Cell Systems (Fisher Scientific)</td>
			<td>4Z0-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 60 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrainPhys Imaging Optimized Medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Classic Medium With Serum and CultureBoost</td>
			<td>4Z0-500</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes (Conical Bottom with CentriStar Cap</td>
			<td>VWR</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 75cm&#178; U-Shaped Canted Neck Not Treated Cell Culture Flask&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431464U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning CellBIND 96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countes Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ZGEXSCCOUNTESS2FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decon CiDehol 70 Isopropyl Alcohol Solution&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>04-355-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Petri Dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Medium (No glucose, No glutamine, No phenol red)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A14430-01</td>
			<td>Glucose-free medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (No Calcium, No Magnesium)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM Endothelial Cell Growth Basal Medium, Phenol Red Free, 500 mL</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM2 Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter with STX2 electrodes</td>
			<td>World Precison Instruments</td>
			<td>NC9792051</td>
			<td>Epithelial voltohmmeter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate&#8211;dextran (wt 20,000)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>FD20-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate&#8211;dextran (wt 70,000)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>FD70S-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorview FV3000 Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Tank (95% N2, 5% CO2)</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>X02NI95C2003071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (No calcium, No magnesium, no phenol red)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Astrocytes</td>
			<td>Science Cell</td>
			<td>1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Brain Vascular Pericytes</td>
			<td>Science Cell</td>
			<td>1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxia Incubator Chamber</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>27310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image-iT Green Hypoxia Reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>I14834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pericyte Medium</td>
			<td>Science Cell</td>
			<td>1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Human Brain Microvascular Endothelial Cells</td>
			<td>ACBRI 376</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking Platform Shaker, Double</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10860-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Flow Meter</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>27311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax iD3 Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>75886-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, 25 mm, 0.22 &#956;m, PVDF, Sterile</td>
			<td>NEST Scientific</td>
			<td>380121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP Mutli-well Plates (6 wells)</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>TP92406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP Tissue Culture Flasks T-75 Flasks</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>TP90075</td>
			<td>Flasks with activated surface for cell adhesion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Distilled Water</td>
			<td>Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td>10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uno Stage Top Incubator-</td>
			<td>Oko Lab</td>
			<td>UNO-T-H-CO2-TTL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a triple primary cell culture model of the human blood-brain barrier for studying ischemic stroke in vitro

Ischemische beroerte is wereldwijd een belangrijke oorzaak van overlijden en invaliditeit met beperkte therapeutische opties. De neuropathologie van ischemische beroerte wordt gekenmerkt door een onderbreking van de bloedtoevoer naar de hersenen, wat leidt tot celdood en cognitieve disfunctie. Tijdens en na ischemische beroerte vergemakkelijkt bloed-hersenbarrière (BBB) disfunctie de progressie van letsel en draagt bij aan slecht herstel van de patiënt. Huidige BBB-modellen omvatten voornamelijk endotheelmonoculturen en dubbele coculturen met astrocyten of pericyten.
Dergelijke modellen missen het vermogen om een dynamische micro-omgeving van de hersenen volledig te imiteren, wat essentieel is voor cel-tot-cel communicatie. Bovendien bevatten veelgebruikte BBB-modellen vaak vereeuwigde menselijke endotheelcellen of van dieren afgeleide (knaagdier-, varkens- of runderen) celculturen die translationele beperkingen vormen. Dit artikel beschrijft een nieuw goed ingebracht BBB-model dat alleen primaire menselijke cellen bevat (hersenmicrovasculaire endotheelcellen, astrocyten en vasculaire pericyten in de hersenen) die het onderzoek van ischemisch hersenletsel in vitro mogelijk maakt. 
De effecten van zuurstof-glucosedeprivatie (OGD) op de integriteit van de barrière werden beoordeeld door passieve permeabiliteit, transendotheliale elektrische weerstand (TEER) metingen en directe visualisatie van hypoxische cellen. Het gepresenteerde protocol biedt een duidelijk voordeel bij het nabootsen van de intercellulaire omgeving van de BBB in vivo, en dient als een realistischer in vitro BBB-model voor het ontwikkelen van nieuwe therapeutische strategieën in de setting van ischemisch hersenletsel.

Om de effecten van astrocyten en pericyten op de barrièrefunctie van HBMEC te onderzoeken, construeerden we het triple cell culture BBB-model op celkweekinzetstukken (figuur 1A) samen met HBMEC-monocultuur en twee dubbele co-kweekmodellen als controles (figuur 1B). Dubbele co-kweekcontroles omvatten een contactloze cocultuur van HBMEC met HA en contactcocultuur van HBMEC met HBVP. Na 6 dagen in co-kweek werden alle experimentele opstellingen gedurende 4 uur ond...

Watch this Scientific Journal Video about A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro at JoVE.com

A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro

Hier beschrijven we de methode voor het vaststellen van een drievoudig celkweekmodel van de bloed-hersenbarrière op basis van primaire microvasculaire endotheelcellen, astrocyten en pericyten van de menselijke hersenen. Dit meercellige model is geschikt voor studies van neurovasculaire eenheidsdisfunctie tijdens ischemische beroerte in vitro of voor de screening van kandidaat-geneesmiddelen.

Een drievoudig primair celkweekmodel van de menselijke bloed-hersenbarrière voor het bestuderen van ischemische beroerte in vitro

Ischemic stroke is a major cause of death and disability worldwide with limited therapeutic options. The neuropathology of ischemic stroke is ...

Ons protocol erkent de noodzaak om de menselijke bloed-hersenbarrière in vitro beter samen te vatten voor de studie van complexe cellulaire mechanismen die het herstel na een beroerte beïnvloeden. Ons drievoudige model vertoont een robuuste integriteit die deels verband houdt met grote compartimentering van putinzetstukken, waardoor we de veranderingsfrequentie kunnen verlagen en verstoring van populaties kunnen voorkomen. Ons model is een geweldig hulpmiddel voor het bestuderen van de moleculaire en cellulaire veranderingen die optreden bij de bloed-hersenbarrière tijdens en na ischemische beroerte.Ons protocol maakt het mogelijk om nieuwe doelen en therapieën te ontdekken om het herstel na een beroerte te verbeteren. De huidige behandelingen voor ischemische beroerte zijn tijdgevoelig en bijgevolg niet altijd effectief. Begin met het kweken van HBVP in T75-kweekkolven met een geactiveerd oppervlak voor celhechting in een 5% kooldioxide-incubator bij 37 graden Celsius totdat het samenvloeit.Zodra de samenvloeiing is bereikt, ademt u het oude pericytenmedium op en wast u de cellen met vijf milliliter warme Dulbecco's PBS. Aspirateer de Dulbecco's PBS en maak de cellen los van de kolf met behulp van een combinatie van vier milliliter warme trypsine EDTA-oplossing en één milliliter Dulbecco's PBS. Incubeer de kolf gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius in een kooldioxide-incubator.Bekijk onder een microscoop of de cellen los zijn van de kolf. Voeg vijf milliliter warm pericytenmedium met 2% FBS toe aan de kolf en breng de losgemaakte cellen over naar een centrifugebuis van 50 milliliter. Centrifugeer de celsuspensie gedurende drie minuten bij 200 g, zodat de cellen een pellet kunnen vormen in de bodem van de buis.Zuig het medium uit de buis zodat de celpellet intact blijft. Suspensie de celkorrel opnieuw in pericytenmedium. Bereken de hoeveelheid medium afhankelijk van de samenvloeiing van de cellen en het aantal benodigde putinzetstukken.Neem 10 microliter van de opnieuw gesuspendeerde cellen, plaats ze in een celteldia en tel het aantal cellen. Bepaal de celdichtheid en zaai 300.000 cellen per insert in één milliliter pericytenmedium op de abluminale kant van de putinzetstukken. Cultiveer primaire menselijke astrocyten met behulp van het astrocytenmedium dat 2% FBS bevat zoals beschreven in het tekstmanuscript.Bepaal de celdichtheid en zaai 300.000 cellen per put op de bodem van de weefselkweek zes-well platen. Dek de plaat af om verdamping te voorkomen en incubeer 's nachts. Kweek HBMEC op dezelfde manier in weefselkweekschotels met behulp van een volledig klassiek medium dat 10% FBS bevat, zoals beschreven in het tekstmanuscript.Verwijder de weefselkweek zesputtenplaten met astrocyten en de putinzetstukken met pericyten uit de couveuse. Aspirate het astrocytenmedium uit de weefselkweek zes-well platen en voeg een milliliter pericytenmedium en een milliliter astrocytenmedium toe aan elke put. Aspirate het pericytenmedium uit de putinzetstukken en plaats ze in de weefselkweek zesputtenplaten met de gezaaide astrocyten.Zaai HBMEC met een dichtheid van 300.000 cellen per put in twee milliliter volledig klassiek medium aan de apicale kant van dezelfde putinzetstukken. Was de cellen driemaal met Dulbecco's PBS. Voor drievoudige celculturen die worden blootgesteld aan zuurstofglucosedeprivatie, voegt u glucosevrij medium toe aan zowel de apicale als de basolaterale compartimenten.Vervang het kweekmedium door verse medium- en normoxische controlecelculturen. Plaats controle drieculturen in de 5% kooldioxide incubator bij 37 graden Celsius. Plaats een petrischaal met 20 milliliter steriel water in de hypoxie-incubatorkamer om voldoende bevochtiging van de culturen te bieden.Open de kamer door de ringklem los te laten en rangschik vervolgens de celculturen op de planken. Sluit de kamer af door de ringklem vast te zetten. Open de inlaat- en uitlaatpoorten van de kamer en bevestig de buis vanaf de bovenkant van de stroommeter van de kamer.Bevestig de slang vanaf de onderkant van de flowmeter via een luchtfilter aan de gastank. Open de tankdebietregelklep door deze tegen de klok in te draaien om een minimale gasstroom mogelijk te maken. Open langzaam het drukregelventiel door met de klok mee te draaien.Spoel de kamer gedurende vijf minuten met het gasmengsel met een stroomsnelheid van 20 liter per minuut. Koppel de kamer los van de gasbron en sluit beide witte plastic klemmen stevig. Schakel de tankdebietregelklep uit door met de klok mee te draaien.Sluit het drukregelventiel door tegen de klok in te draaien. Plaats de hypoxiekamer in een conventionele incubator op 37 graden Celsius gedurende vier uur. Plaats het gesteriliseerde TEER-instrument in de bioveiligheidskast en sluit de elektroden aan op de epitheliale volt ohmmeter.Steriliseer de elektroden in 30 milliliter 70% isopropylalcoholoplossing gedurende minimaal 30 minuten. Schakel het TEER-instrument in en stel de functie in op ohm. Verwijder de elektroden uit de 70% isopropylalcoholoplossing en plaats ze in 20 milliliter Dulbecco's PBS gedurende minimaal 30 minuten totdat de digitale uitlezing op het TEER-apparaat nul ohm leest.Steek de lange pen van de elektrode door een van de drie openingen in de putinzethangar van de lege putinzetbediening en laat deze zakken totdat deze de bodem van de put raakt. Zorg ervoor dat de korte pen boven de apicale cultuur op de bodem van de putinzet rust. Wacht tot de digitale uitleeswaarden op het TEER-instrument afvlakken voordat u de waarde registreert.Plaats de elektroden terug in dulbecco's PBS om ze tussen de metingen door te wassen. Ga door met het verzamelen van alle TEER-metingen voor nog twee lege putinzetregelaars. Verzamel de TEER-metingen van de monsterplaten zoals eerder gedemonstreerd.Zodra alle metingen zijn uitgevoerd, wordt de elektrode gedurende 30 minuten teruggezet naar de 70% isopropylalcoholoplossing. Koppel vervolgens de elektroden los van het TEER-instrument en laat ze aan de lucht drogen. Bereken de TEER-waarden.Aspirateer het medium uit het basolaterale compartiment en vervang het door twee milliliter fenolroodvrij endotheelcelgroeimedium in het bloed-hersenbarrièremodel met drievoudige celcultuur. Was de cellen in het apicale compartiment tweemaal met HBSS. Voeg een milliliter van de FITC-dextran-oplossing toe in het apicale compartiment en bedek de plaat met aluminiumfolie en plaats de plaat vervolgens in de incubatorset op 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide gedurende een uur.Neem 100 microliter medium uit de basolaterale compartimenten en breng het over in een zwarte 96-well plaat. Meet de fluorescentie met behulp van een microplaatlezer met de excitatie en de emissiegolflengten ingesteld op respectievelijk 480 en 530 nanometer. Zaad 200 microliter HBMEC, primaire astrocyten en HBVP in het midden van poly-D-lysine gecoate 35 millimeter glazen bodemschalen met een dichtheid van 150.000 cellen per gerecht.Voordat u HBMEC zaait, bedekt u de bodem van de gerechten met de aanhechtingsfactor. Laat de cellen zich hechten aan het glasoppervlak door ze een nacht op 37 graden Celsius in een kooldioxide-incubator te laten. Zodra de samenvloeiing is bereikt, gooit u het kweekmedium weg en voegt u twee milliliter voorverwarmd glucosevrij medium toe voor zuurstof-glucosedeprivatie of normaal medium voor controles.Vervang na de behandeling met zuurstofglucosedeprivatie het medium door het voor beeldvorming geoptimaliseerde medium in alle gerechten en voer vervolgens fluorescentie live-cell imaging uit met het GFP-filter en de confocale microscoopincubator van het bovenste podium zoals beschreven in het tekstmanuscript. De barrière-integriteit van de endotheelmonolaag in de aangegeven bloed-hersenbarrièremodelconfiguraties werd beoordeeld door TEER te bepalen voor en na zuurstof-glucosedeprivatie, evenals na 24 uur re-oxygenatie. Gedurende vier uur veroorzaakte het zuurstof-glucosedeprivatie een significante daling van de TEER-waarden alleen in HBMEC-monocultuur en het cocultuurmodel met HBMEC en HBVP.Deze verlaagde niveaus bereikten de uitgangswaarden na 24 uur re-oxygenatie. De TEER-waarden in het drievoudige cocultuurmodel waren significant hoger dan die in de dubbele cocultuurcontroles of monocultuurcontrole onmiddellijk na zuurstof-glucosedeprivatie. De paracellulaire permeabiliteit van endotheelmonolagen tot 20 kilodalton moleculaire massa, FITC-dextran, was drastisch verhoogd in de HBMEC-monocultuur en in mindere mate in het cocultuurmodel met HBMEC en HBVP in vergelijking met normoxische controles.Bovendien waren de FITC-dextran-permeabiliteitsniveaus van 20 kilodalton de laagste in het drievoudige hersenbloedbarrièremodel van alle modellen onder normoxische en zuurstofglucosedeprivatieomstandigheden. Er werden geen veranderingen waargenomen in 70 kilodalton, FITC dextran flux over endotheel monolagen in een van de modellen. Alle primaire menselijke typen die werden blootgesteld aan zuurstof-glucosedeprivatie vertoonden sterke groene fluorescentie, wat bewijst dat de afgebeelde levende cellen hypoxisch waren.Na het zaaien van vasculaire pericyten in de menselijke hersenen aan de abluminale kant van putinzetstukken, is het erg belangrijk om ze te bedekken met de flipplate om verdamping te voorkomen. In ons model gebruiken we een relatief kleine poriediameter van 0,4 micrometer van polyester putinzetstukken, waardoor het geschikt is voor de screening van kandidaat-geneesmiddelen voor elke ziekte waarvoor de bloed-hersenbarrière moet worden overschreden voor behandeling. Deze techniek biedt een uitstekende gelegenheid om indien nodig modificatie van eiwitten en transporters te visualiseren.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, expressie, zuivering en kristallisatie van het Human serotonine transporter Gebonden aan<em&gt; S</em&gt; citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Gebruik Steiger Liposomen lipide-proximale eiwit-eiwit interacties reconstitueren<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tijdsgeresolveerde elektrosprayionisatie waterstof-deuterium Exchange Massaspectrometrie voor het bestuderen van Protein Structure en Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Gemakkelijke manipulatie van platforms in op basis van eiwitten Hydrogels voor cel cultuur toepassingen

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Een colorimetrische methode voor het meten van ijzergehalte in planten

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibratie-gratis In Vitro kwantificering van eiwit Homo-oligomerisatie met behulp van commerciële instrumentatie en Software van de analyse van de helderheid van gratis, Open Source

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Bestuderen van RNA Interactors van proteïne Kinase RNA-geactiveerd tijdens de zoogdieren celcyclus

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput

Een strategie om verbindingen te identificeren die van invloed zijn op de celgroei en overleving in gekweekte zoogdiercellen bij een lage tot matige doorvoer

Cytotoxicity is a critical parameter that needs to be quantified when studying drugs that may have therapeutic benefits. Because of this, many drug ...

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability DARTS assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

Een semi-kwantitatieve drug affiniteit responsieve doel stabiliteit (DARTS) assay voor het bestuderen van Rapamycine/mTOR interactie

Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) is a robust method for detection of novel small molecule protein targets. It can be used to verify known ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Toepassing van Biolayer interferometrie (BLI) voor het bestuderen van eiwit-eiwit interacties in transcriptie

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...