Name: a triple primary cell culture model of the human blood-brain barrier for studying ischemic stroke in vitro
Uploaded: 2022-10-06T14:05:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (NIH) Grants MH128022, MH122235, MH072567, MH122235, HL126559, DA044579, DA039576, DA040537, DA050528 und DA047157 unterstützt.

HINWEIS: Weitere Informationen zu allen in diesem Protokoll verwendeten Zellen, Materialien, Geräten und Lösungen finden Sie in der Materialtabelle .
1. Dreifachzellkultur-BBB-Modelleinstellung
<ol><li>Aussaatperizyten<ol><li>Kultivieren Sie HBVP in T75-Kulturkolben mit aktivierter Oberfläche für die Zelladhäsion in einem 5%CO2-Inkubator bei 37 °C bis zum Konfluieren. Sobald der Zusammenfluss erreicht ist, saugen Sie das alte Perizytenmedium...

<ol>
	<li>Mozaffarian, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+disease+and+stroke+statistics-2016+update:+a+report+from+the+American+Heart+Association.">Heart disease and stroke statistics-2016 update: a report from the American Heart Association.</a> Circulation. 133 (94), 38 (2016).</li><li>Yousufuddin, M., Young, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+and+ischemic+stroke.">Aging and ischemic stroke.</a> Aging. 11 (9), 2542-2544 (2019).</li><li>Donkor, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroke+in+the+21st+century:+a+snapshot+of+the+burden,+epidemiology,+and+quality+of+life.">Stroke in the 21st century: a snapshot of the burden, epidemiology, and quality of life.</a> Stroke Research and Treatment. , 3238165 (2018).</li><li>Kadry, H., Noorani, B., Cucullo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+blood-brain+barrier+overview+on+structure,+function,+impairment,+and+biomarkers+of+integrity.">A blood-brain barrier overview on structure, function, impairment, and biomarkers of integrity.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 17 (1), 69 (2020).</li><li>Brown, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+and+neurovascular+function+in+the+healthy+and+diseased+brain.">Pericytes and neurovascular function in the healthy and diseased brain.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 282 (2019).</li><li>Cabezas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+modulation+of+blood+brain+barrier:+perspectives+on+Parkinson's+disease.">Astrocytic modulation of blood brain barrier: perspectives on Parkinson's disease.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 211 (2014).</li><li>Abdullahi, W., Tripathi, D., Ronaldson, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+dysfunction+in+ischemic+stroke:+targeting+tight+junctions+and+transporters+for+vascular+protection.">Blood-brain barrier dysfunction in ischemic stroke: targeting tight junctions and transporters for vascular protection.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 315 (3), 343-356 (2018).</li><li>Candelario-Jalil, E., Dijkhuizen, R. M., Magnus, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammation,+stroke,+blood-brain+barrier+dysfunction,+and+imaging+modalities.">Neuroinflammation, stroke, blood-brain barrier dysfunction, and imaging modalities.</a> Stroke. 53 (5), 1473-1486 (2022).</li><li>He, Y., Yao, Y., Tsirka, S. E., Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-culture+models+of+the+blood-brain+barrier.">Cell-culture models of the blood-brain barrier.</a> Stroke. 45 (8), 2514-2526 (2014).</li><li>Thomsen, L. B., Burkhart, A., Moos, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+triple+culture+model+of+the+blood-brain+barrier+using+porcine+brain+endothelial+cells,+astrocytes+and+pericytes.">A triple culture model of the blood-brain barrier using porcine brain endothelial cells, astrocytes and pericytes.</a> PLoS One. 10 (8), 0134765 (2015).</li><li>Song, Y., Cai, X., Du, D., Dutta, P., Lin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+blood-brain+barrier+models+for+in+vitro+biological+analysis:+one+cell+type+vs+three+cell+types.">Comparison of blood-brain barrier models for in vitro biological analysis: one cell type vs three cell types.</a> ACS Applied Bio Materials. 2 (3), 1050-1055 (2019).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+nanoparticles+induce+tight+junction+disruption+and+astrocyte+neurotoxicity+in+a+rat+blood-brain+barrier+primary+triple+coculture+model.">Silver nanoparticles induce tight junction disruption and astrocyte neurotoxicity in a rat blood-brain barrier primary triple coculture model.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 6105-6118 (2015).</li><li>Appelt-Menzel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+human+blood-brain+barrier+co-culture+model+mimicking+the+neurovascular+unit+using+induced+pluri-+and+multipotent+stem+cells.">Establishment of a human blood-brain barrier co-culture model mimicking the neurovascular unit using induced pluri- and multipotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 894-906 (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+construction+of+a+reversible+arylazo-based+NIR+probe+for+cycling+hypoxia+imaging+in+vivo.">Rational construction of a reversible arylazo-based NIR probe for cycling hypoxia imaging in vivo.</a> Nature Communications. 12 (1), 2772 (2021).</li><li>Palacio-Casta&#241;eda, V., Kooijman, L., Venzac, B., Verdurmen, W. P. R., Le Gac, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+switching+of+tumor+cells+under+hypoxic+conditions+in+a+tumor-on-a-chip+model.">Metabolic switching of tumor cells under hypoxic conditions in a tumor-on-a-chip model.</a> Micromachines. 11 (4), 382 (2020).</li><li>Ramsauer, M., Krause, D., Dermietzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+of+the+blood-brain+barrier+in+vitro+and+the+function+of+cerebral+pericytes.">Angiogenesis of the blood-brain barrier in vitro and the function of cerebral pericytes.</a> FASEB Journal. 16 (10), 1274-1276 (2002).</li><li>Lyck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALCAM+(CD166)+is+involved+in+extravasation+of+monocytes+rather+than+T+cells+across+the+blood-brain+barrier.">ALCAM (CD166) is involved in extravasation of monocytes rather than T cells across the blood-brain barrier.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 37 (8), 2894-2909 (2017).</li><li>Rizzi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+triple+culture+cell+system+modeling+the+human+blood-brain+barrier.">A triple culture cell system modeling the human blood-brain barrier.</a> Journal of Visualized Experiments. (177), (2021).</li><li>Kumar, S., Shaw, L., Lawrence, C., Lea, R., Alder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P50:+Developing+a+physiologically+relevant+blood+brain+barrier+model+for+the+study+of+drug+disposition+in+glioma.">P50: Developing a physiologically relevant blood brain barrier model for the study of drug disposition in glioma.</a> Neuro-Oncology. 16 (6), (2014).</li><li>Stone, N. L., England, T. J., O'Sullivan, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+transwell+blood+brain+barrier+model+using+primary+human+cells.">A novel transwell blood brain barrier model using primary human cells.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 230 (2019).</li><li>Al Ahmad, A., Taboada, C. B., Gassmann, M., Ogunshola, O. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+and+pericytes+differentially+modulate+blood-brain+barrier+characteristics+during+development+and+hypoxic+insult.">Astrocytes and pericytes differentially modulate blood-brain barrier characteristics during development and hypoxic insult.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 31 (2), 693-705 (2011).</li></ol>

In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode zum Aufbau eines zuverlässigen dreifachen Endothelzell-Perizyten-Astrozyten-Kultur-BBB-Modells zur Untersuchung der BBB-Dysfunktion im Rahmen eines ischämischen Schlaganfalls in vitro. In Anbetracht der Tatsache, dass Perizyten in vivo die nächsten Nachbarn von Endothelzellen sind, sind HBVP in diesem Modell16 auf der Unterseite der Well-Inserts plattiert. Obwohl dieser Konfiguration die direkte Zell-zu-Zell-Kommunikation zwisch...

Schlaganfall ist weltweit eine der häufigsten Todes- und Langzeitinvaliditätsursachen1. Die Inzidenz von Schlaganfällen nimmt mit zunehmendem Alter schnell zu und verdoppelt sich alle 10 Jahre nach dem 55. Lebensjahr2. Der ischämische Schlaganfall tritt als Folge einer Störung des zerebralen Blutflusses aufgrund thrombotischer und embolischer Ereignisse auf, was mehr als 80% aller Schlaganfallfälle ausmacht3. Schon jetzt gibt es relativ wenige Behandlungsmöglichkeiten, um den Gewebetod nach einem ischämischen Schlaganfall zu minimieren. Die Behandlungen, die es gibt, sind zeitkritisch und führen folglich nicht immer zu guten klinischen Ergebnissen. Daher ist die Erforschung komplexer zellulärer Mechanismen des ischämischen Schlaganfalls, die die Erholung nach einem Schlaganfall beeinflussen, dringend erforderlich.
Die BHS ist eine dynamische Schnittstelle für den Austausch von Molekülen zwischen dem Blut und dem Hirnparenchym. Strukturell besteht die BBB aus mikrovaskulären Endothelzellen des Gehirns, die durch Verbindungskomplexe verbunden sind, die von einer Basalmembran, Perizyten und astrozytären Endfüßen umgeben sind4. Perizyten und Astrozyten spielen eine wesentliche Rolle bei der Aufrechterhaltung der BBB-Integrität durch die Sekretion verschiedener Faktoren, die für die Bildung starker Tight Junctions notwendig sind 5,6. Der Zusammenbruch der BBB ist eines der Kennzeichen des ischämischen Schlaganfalls. Akute Entzündungsreaktionen und oxidativer Stress im Zusammenhang mit zerebraler Ischämie führen zur Störung von Tight-Junction-Proteinkomplexen und zu einem gestörten Crosstalk zwischen Astrozyten, Perizyten und Endothelzellen, was zu einer erhöhten parazellulären gelösten Permeabilität über die BBB7 führt. Die BBB-Dysfunktion fördert die Bildung von Hirnödemen weiter und erhöht das Risiko einer hämorrhagischen Transformation8. Unter Berücksichtigung all dessen besteht ein großes Interesse daran, die molekularen und zellulären Veränderungen zu verstehen, die auf BBB-Ebene während und nach einem ischämischen Schlaganfall auftreten.
Obwohl viele In-vitro-BBB-Modelle in den letzten Jahrzehnten entwickelt und in einer Vielzahl von Studien verwendet wurden, kann keines von ihnen In-vivo-Bedingungen vollständig replizieren9. Während einige Modelle auf Endothelzellmonoschichten basieren, die auf gut einsetzenden permeablen Trägern allein oder in Kombination mit Perizyten oder Astrozyten kultiviert wurden, haben erst neuere Studien Triple-Zellkultur-Modelldesigns eingeführt. Fast alle existierenden Dreifachkultur-BBB-Modelle enthalten primäre Hirnendothelzellen zusammen mit Astrozyten und Perizyten, die aus Tierarten oder Zellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen isoliert wurden10,11,12,13.
In Anerkennung der Notwendigkeit, die menschliche BHS in vitro besser zu rekapitulieren, haben wir ein Dreifachzellkultur-In-vitro-BBB-Modell etabliert, das aus mikrovaskulären Endothelzellen des menschlichen Gehirns (HBMEC), primären menschlichen Astrozyten (HA) und primären vaskulären Perizyten des menschlichen Gehirns (HBVP) besteht. Dieses Dreifachkultur-BBB-Modell ist auf 6-Well-Platten-Polyestermembraneinsätzen mit einer Porengröße von 0,4 μm aufgebaut. Diese Well-Inserts bieten eine optimale Umgebung für die Zellanheftung und ermöglichen einen einfachen Zugang zu apikalen (Blut) und basolateralen (Gehirn) Kompartimenten für die Medienprobenahme oder die Anwendung von Verbindungen. Die Merkmale dieses vorgeschlagenen Dreifachzellkultur-BBB-Modells werden durch Messung von TEER und parazellulärem Fluss nach OGD bewertet, der den ischämischen Schlaganfall in vitro nachahmt, wobei ein Mangel an Sauerstoff (<1% O2) und Nährstoffen (unter Verwendung eines glukosefreien Mediums) durch die Verwendung einer befeuchteten, versiegelten Kammer erreicht wird. Zusätzlich werden induzierte ischämische Zustände in diesem Modell durch direkte Visualisierung hypoxischer Zellen genau verifiziert.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>24 mm Transwell with 0.4 &#181;m Pore Polyester Membrane Insert</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Glass Bottom Dishes</td>
			<td>MatTek Life Sciences (FISHERSCI)</td>
			<td>P35GC-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Astrocyte Medium</td>
			<td>Science Cell</td>
			<td>1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attachment Factor</td>
			<td>Cell Systems (Fisher Scientific)</td>
			<td>4Z0-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 60 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrainPhys Imaging Optimized Medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Classic Medium With Serum and CultureBoost</td>
			<td>4Z0-500</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes (Conical Bottom with CentriStar Cap</td>
			<td>VWR</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 75cm&#178; U-Shaped Canted Neck Not Treated Cell Culture Flask&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431464U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning CellBIND 96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countes Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ZGEXSCCOUNTESS2FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decon CiDehol 70 Isopropyl Alcohol Solution&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>04-355-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Petri Dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Medium (No glucose, No glutamine, No phenol red)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A14430-01</td>
			<td>Glucose-free medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (No Calcium, No Magnesium)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM Endothelial Cell Growth Basal Medium, Phenol Red Free, 500 mL</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM2 Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter with STX2 electrodes</td>
			<td>World Precison Instruments</td>
			<td>NC9792051</td>
			<td>Epithelial voltohmmeter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate&#8211;dextran (wt 20,000)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>FD20-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate&#8211;dextran (wt 70,000)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>FD70S-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorview FV3000 Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Tank (95% N2, 5% CO2)</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>X02NI95C2003071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (No calcium, No magnesium, no phenol red)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Astrocytes</td>
			<td>Science Cell</td>
			<td>1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Brain Vascular Pericytes</td>
			<td>Science Cell</td>
			<td>1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxia Incubator Chamber</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>27310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image-iT Green Hypoxia Reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>I14834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pericyte Medium</td>
			<td>Science Cell</td>
			<td>1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Human Brain Microvascular Endothelial Cells</td>
			<td>ACBRI 376</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking Platform Shaker, Double</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10860-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Flow Meter</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>27311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax iD3 Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>75886-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, 25 mm, 0.22 &#956;m, PVDF, Sterile</td>
			<td>NEST Scientific</td>
			<td>380121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP Mutli-well Plates (6 wells)</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>TP92406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP Tissue Culture Flasks T-75 Flasks</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>TP90075</td>
			<td>Flasks with activated surface for cell adhesion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Distilled Water</td>
			<td>Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td>10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uno Stage Top Incubator-</td>
			<td>Oko Lab</td>
			<td>UNO-T-H-CO2-TTL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a triple primary cell culture model of the human blood-brain barrier for studying ischemic stroke in vitro

Der ischämische Schlaganfall ist weltweit eine der Hauptursachen für Tod und Behinderung mit begrenzten therapeutischen Möglichkeiten. Die Neuropathologie des ischämischen Schlaganfalls ist durch eine Unterbrechung der Blutversorgung des Gehirns gekennzeichnet, die zu Zelltod und kognitiver Dysfunktion führt. Während und nach einem ischämischen Schlaganfall erleichtert die Dysfunktion der Blut-Hirn-Schranke (BBB) das Fortschreiten von Verletzungen und trägt zu einer schlechten Genesung des Patienten bei. Aktuelle BBB-Modelle umfassen vor allem endotheliale Monokulturen und Doppelkokulturen mit Astrozyten oder Perizyten.
Solchen Modellen fehlt die Fähigkeit, eine dynamische Gehirnmikroumgebung vollständig zu imitieren, was für die Kommunikation von Zelle zu Zelle unerlässlich ist. Darüber hinaus enthalten häufig verwendete BBB-Modelle oft immortalisierte menschliche Endothelzellen oder tierische Zellkulturen (Nagetier, Schweine oder Rinder), die translationale Einschränkungen darstellen. Dieser Artikel beschreibt ein neuartiges, auf Präparaten basierendes BBB-Modell, das nur primäre menschliche Zellen (mikrovaskuläre Endothelzellen des Gehirns, Astrozyten und vaskuläre Perizyten des Gehirns) enthält, was die Untersuchung von ischämischen Hirnverletzungen in vitro ermöglicht. 
Die Auswirkungen von Sauerstoff-Glukose-Deprivation (OGD) auf die Barriereintegrität wurden durch passive Permeabilität, transendotheliale elektrische Widerstandsmessungen (TEER) und direkte Visualisierung hypoxischer Zellen bewertet. Das vorgestellte Protokoll bietet einen deutlichen Vorteil, indem es die interzelluläre Umgebung der BHS in vivo nachahmt und als realistischeres In-vitro-BBB-Modell für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien im Rahmen einer ischämischen Hirnverletzung dient.

Um die Auswirkungen von Astrozyten und Perizyten auf die Barrierefunktion von HBMEC zu untersuchen, konstruierten wir das Dreifachzellkultur-BBB-Modell an Zellkulturinserts (Abbildung 1A) zusammen mit HBMEC-Monokulturen und zwei Doppelkokulturmodellen als Kontrollen (Abbildung 1B). Doppelte Kokulturkontrollen umfassten eine kontaktlose Kokultur von HBMEC mit HA und Kontaktkokultur von HBMEC mit HBVP. Nach 6 Tagen in Kokultur wurden alle Versuchsaufbauten für 4 ...

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A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro

Hier beschreiben wir die Methode zur Etablierung eines Dreifachzellkulturmodells der Blut-Hirn-Schranke basierend auf primären mikrovaskulären Endothelzellen des menschlichen Gehirns, Astrozyten und Perizyten. Dieses multizelluläre Modell eignet sich für Studien zur neurovaskulären Einheitendysfunktion während eines ischämischen Schlaganfalls in vitro oder für das Screening von Arzneimittelkandidaten.

Ein dreifaches primäres Zellkulturmodell der menschlichen Blut-Hirn-Schranke zur Untersuchung des ischämischen Schlaganfalls in vitro

Ischemic stroke is a major cause of death and disability worldwide with limited therapeutic options. The neuropathology of ischemic stroke is ...

Unser Protokoll erkennt die Notwendigkeit an, die menschliche Blut-Hirn-Schranke in vitro besser zu rekapitulieren, um komplexe zelluläre Mechanismen zu untersuchen, die die Erholung nach einem Schlaganfall beeinflussen. Unser Triple-Modell weist eine robuste Integrität auf, die teilweise mit einer großen Kompartimentierung von Bohrlocheinsätzen zusammenhängt, wodurch wir die Änderungshäufigkeit verringern und Störungen der Populationen vermeiden können. Unser Modell ist ein großartiges Werkzeug, um die molekularen und zellulären Veränderungen zu untersuchen, die an der Blut-Hirn-Schranke während und nach einem ischämischen Schlaganfall auftreten.Unser Protokoll ermöglicht die Entdeckung neuartiger Ziele und Therapeutika zur Verbesserung der Genesung nach einem Schlaganfall. Aktuelle Behandlungen für ischämische Schlaganfälle sind zeitkritisch und folglich nicht immer wirksam. Beginnen Sie mit der Kultivierung von HBVP in T75-Kulturkolben mit einer aktivierten Oberfläche für die Zelladhäsion in einem 5%-Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius, bis sie konfluieren.Sobald der Zusammenfluss erreicht ist, saugen Sie das alte Perizytenmedium ab und waschen Sie die Zellen mit fünf Milliliter warmem PBS von Dulbecco. Saugen Sie das PBS des Dulbecco ab und lösen Sie die Zellen aus dem Kolben mit einer Kombination aus vier Milliliter warmer Trypsin-EDTA-Lösung und einem Milliliter PBS von Dulbecco. Der Kolben wird fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem Kohlendioxid-Inkubator inkubiert.Betrachten Sie unter einem Mikroskop, um zu bestätigen, ob die Zellen vom Kolben gelöst sind. Fünf Milliliter warmes Perizytenmedium mit 2% FBS in den Kolben geben und die abgelösten Zellen in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführen. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension drei Minuten lang bei 200 g, so dass die Zellen ein Pellet im Boden des Röhrchens bilden können.Saugen Sie das Medium aus dem Röhrchen ab, um sicherzustellen, dass das Zellpellet intakt bleibt. Suspendieren Sie das Zellpellet erneut im Perizytenmedium. Berechnen Sie die Menge des Mediums in Abhängigkeit vom Zusammenfluss der Zellen und der Anzahl der benötigten Bohrlocheinsätze.Nehmen Sie 10 Mikroliter der resuspendierten Zellen, legen Sie sie in einen Zellzählobjektträger und zählen Sie die Anzahl der Zellen. Bestimmen Sie die Zelldichte und säen Sie 300.000 Zellen pro Einsatz in einem Milliliter Perizytenmedium auf die abluminale Seite der Vertiefungen. Kultivieren Sie primäre menschliche Astrozyten mit dem Astrozytenmedium, das 2% FBS enthält, wie im Textmanuskript beschrieben.Bestimmen Sie die Zelldichte und säen Sie 300.000 Zellen pro Vertiefung auf den Boden der Gewebekultur-Sechs-Well-Platten. Decken Sie die Platte ab, um Verdunstung zu verhindern, und inkubieren Sie über Nacht. In ähnlicher Weise kultivieren Sie HBMEC in Gewebekulturschalen unter Verwendung eines vollständigen klassischen Mediums mit 10% FBS, wie im Textmanuskript beschrieben.Nehmen Sie die Gewebekultur-Sechstopfplatten mit Astrozyten und die Vertiefungen mit Perizyten aus dem Inkubator. Das Astrozytenmedium wird aus den Gewebekultur-Sechs-Well-Platten abgesaugt und zu jeder Vertiefung ein Milliliter Perizytenmedium und ein Milliliter Astrozytenmedium hinzugefügt. Das Perizytenmedium aus den Vertiefungen absaugen und in die Gewebekulturplatten mit sechs Vertiefungen geben, die die ausgesäten Astrozyten enthalten.Säen Sie HBMEC mit einer Dichte von 300.000 Zellen pro Vertiefung in zwei Milliliter des kompletten klassischen Mediums auf die apikale Seite derselben Bohrlocheinsätze. Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS von Dulbecco. Für Dreifachzellkulturen, die Sauerstoff-Glukose-Entzug ausgesetzt sind, fügen Sie sowohl den apikalen als auch den basolateralen Kompartimenten ein glukosefreies Medium hinzu.Ersetzen Sie das Kulturmedium durch frisches Medium und normoxische Kontrollzellkulturen. Platzieren Sie Kontroll-Dreifachkulturen im 5%-Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius. Stellen Sie eine Petrischale mit 20 Milliliter sterilem Wasser in die Hypoxie-Inkubatorkammer, um eine ausreichende Befeuchtung der Kulturen zu gewährleisten.Öffnen Sie die Kammer, indem Sie die Ringklemme lösen, und ordnen Sie die Zellkulturen auf den Regalen an. Versiegeln Sie die Kammer, indem Sie die Ringklemme sichern. Öffnen Sie die Ein- und Auslassöffnungen der Kammer und befestigen Sie den Schlauch oben am Durchflussmesser der Kammer.Befestigen Sie den Schlauch von der Unterseite des Durchflussmessers über einen Luftfilter am Gastank. Öffnen Sie das Tankdurchflussregelventil, indem Sie es gegen den Uhrzeigersinn drehen, um einen minimalen Gasfluss zu ermöglichen. Öffnen Sie das Druckregelventil langsam durch Drehen im Uhrzeigersinn.Spülen Sie die Kammer fünf Minuten lang mit dem Gasgemisch bei einer Durchflussrate von 20 Litern pro Minute. Trennen Sie die Kammer von der Gasquelle und schließen Sie beide weißen Kunststoffklemmen fest. Schalten Sie das Tankdurchflussregelventil aus, indem Sie im Uhrzeigersinn drehen.Schließen Sie das Druckregelventil, indem Sie es gegen den Uhrzeigersinn drehen. Stellen Sie die Hypoxiekammer für vier Stunden in einen herkömmlichen Inkubator, der auf 37 Grad Celsius eingestellt ist. Setzen Sie das sterilisierte TEER-Instrument in die Biosicherheitswerkbank ein und stecken Sie die Elektroden in das Epithelvolt-Ohm-Meter.Sterilisieren Sie die Elektroden in 30 Milliliter 70% Isopropylalkohollösung für mindestens 30 Minuten. Schalten Sie das TEER-Gerät ein und stellen Sie die Funktion auf Ohm ein. Entfernen Sie die Elektroden aus der 70%igen Isopropylalkohollösung und legen Sie sie mindestens 30 Minuten lang in 20 Milliliter PBS von Dulbecco, bis die digitale Anzeige auf dem TEER-Gerät null Ohm anzeigt.Führen Sie den langen Zapfen der Elektrode durch eine der drei Öffnungen im Brunneneinlegehangar des Blank Well Insert Control ein, bis er den Boden des Brunnens berührt. Stellen Sie sicher, dass der kurze Zapfen über der apikalen Kultur auf dem Boden des Brunneneinsatzes ruht. Warten Sie, bis die digitalen Anzeigewerte am TEER-Gerät abgeschaltet sind, bevor Sie den Wert aufzeichnen.Setzen Sie die Elektroden wieder in das PBS von Dulbecco ein, um sie zwischen den Messungen zu waschen. Sammeln Sie weiterhin alle TEER-Messungen für zwei weitere Blank-Well-Insert-Kontrollen. Sammeln Sie die TEER-Messungen der Probenplatten, wie zuvor gezeigt.Nach allen Messungen wird die Elektrode für 30 Minuten wieder in die 70%ige Isopropylalkohollösung gegeben. Trennen Sie dann die Elektroden vom TEER-Instrument und lassen Sie sie an der Luft trocknen. Berechnen Sie die TEER-Werte.Asspirieren Sie das Medium aus dem basolateralen Kompartiment und ersetzen Sie es durch zwei Milliliter phenolrotes freies Endothelzellwachstumsmedium im Dreizellkultur-Blut-Hirn-Schrankenmodell. Waschen Sie die Zellen im apikalen Kompartiment zweimal mit HBSS. Fügen Sie einen Milliliter der FITC-Dextranlösung in das apikale Fach hinzu und bedecken Sie die Platte mit Aluminiumfolie, dann legen Sie die Platte für eine Stunde in den auf 37 Grad Celsius eingestellten Inkubator mit 5% Kohlendioxid.Nehmen Sie 100 Mikroliter Medium aus den basolateralen Fächern und geben Sie es in eine schwarze 96-Well-Platte. Messen Sie die Fluoreszenz mit einem Mikrotiterplatten-Lesegerät, wobei die Anregungs- und Emissionswellenlängen auf 480 bzw. 530 Nanometer eingestellt sind. Säen Sie 200 Mikroliter HBMEC, primäre Astrozyten und HBVP in der Mitte von Poly-D-Lysin-beschichteten 35-Millimeter-Glasbodenschalen mit einer Dichte von 150.000 Zellen pro Schale.Vor der Aussaat von HBMEC den Boden des Geschirrs mit dem Anhaftungsfaktor beschichten. Lassen Sie die Zellen an der Glasoberfläche haften, indem Sie sie über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem Kohlendioxid-Inkubator stehen lassen. Sobald der Zusammenfluss erreicht ist, verwerfen Sie das Kulturmedium und fügen Sie zwei Milliliter vorgewärmtes glukosefreies Medium für Sauerstoff-Glukose-Entzug oder normales Medium für Kontrollen hinzu.Nach der Behandlung des Sauerstoff-Glukose-Entzugs ersetzen Sie das Medium in allen Schalen durch das bildgebende optimierte Medium und führen dann eine Fluoreszenz-Lebendzellbildgebung mit dem GFP-Filter und dem konfokalen Mikroskop-Inkubator der Oberstufe durch, wie im Textmanuskript beschrieben. Die Barriereintegrität der endothelialen Monoschicht in den angegebenen Blut-Hirn-Schranken-Modellkonfigurationen wurde durch Bestimmung des TEER vor und nach Sauerstoff-Glukose-Entzug sowie nach 24 Stunden Reoxygenierung beurteilt. Vier Stunden lang verursachte der Sauerstoff-Glukose-Mangel nur in der HBMEC-Monokultur und im Kokulturmodell mit HBMEC und HBVP eine signifikante Abnahme der TEER-Werte.Diese verringerten Werte erreichten nach 24 Stunden Reoxygenierung die Ausgangswerte. Die TEER-Werte im Triple-Co-Kultur-Modell waren signifikant höher als die in den Doppel-Kokultur-Kontrollen oder der Monokultur-Kontrolle unmittelbar nach Sauerstoff-Glukose-Entzug. Die parazelluläre Permeabilität von endothelialen Monoschichten auf 20 Kilodalton Molekülmasse, FITC-Dextran, war in der HBMEC-Monokultur und in geringerem Maße im Kokulturmodell mit HBMEC und HBVP im Vergleich zu normoxischen Kontrollen drastisch erhöht.Darüber hinaus waren 20 Kilodalton FITC-Dextranpermeabilitätswerte die niedrigsten im Triple-Brain-Blood-Schrankenmodell unter allen Modellen unter normoxischen und Sauerstoff-Glukose-Deprivationsbedingungen. In keinem der Modelle wurden Veränderungen im 70-Kilodalton-FITC-Dextranfluss über endotheliale Monoschichten beobachtet. Alle primären menschlichen Typen, die Sauerstoff-Glukose-Entzug ausgesetzt waren, zeigten eine starke grüne Fluoreszenz, was beweist, dass die abgebildeten lebenden Zellen hypoxisch waren.Nach der Aussaat der vaskulären Perizyten des menschlichen Gehirns auf der abluminalen Seite von Bohrlocheinsätzen ist es sehr wichtig, sie mit der Flip-Platte abzudecken, um eine Verdunstung zu verhindern. In unserem Modell verwenden wir einen relativ kleinen Porendurchmesser von 0,4 Mikrometern aus Polyester-Vertiefungen, wodurch es für das Screening von Arzneimittelkandidaten auf jede Krankheit geeignet ist, die zur Behandlung die Blut-Hirn-Schranke überwinden muss. Diese Technik bietet eine hervorragende Möglichkeit, bei Bedarf die Modifikation von Proteinen und Transportern zu visualisieren.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Reinigung und Kristallisation des menschlichen Serotonin-Transporter-Bound<em&gt; S</em&gt; -Citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Forschung

Biochemie

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Struktur Protein Studium und Dynamik

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Einfache Handhabung von Architekturen in Protein-basierte Hydrogele für Zelle Kultur Anwendungen

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Ein kolorimetrischen Verfahren zur Messung der Eisengehalt in Pflanzen

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrierung-kostenlose In-vitro- Quantifizierung von Protein Homo-Oligomerisierung mit kommerziellen Instrumentierung und kostenlose Open Source-Helligkeit-Analyse-Software

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Studium der RNA Interaktoren des RNA während der Säugetier-Zelle Zyklus aktiviert Proteinkinase

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput

Eine Strategie zur Identifizierung von Verbindungen, die das Zellwachstum und das Überleben in kultivierten Säugetierzellen bei niedrigem bis moderatem Durchsatz beeinflussen

Cytotoxicity is a critical parameter that needs to be quantified when studying drugs that may have therapeutic benefits. Because of this, many drug ...

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability DARTS assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

Ein semi-quantitativer Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) Assay zur Untersuchung der Rapamycin/mTOR-Interaktion

Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) is a robust method for detection of novel small molecule protein targets. It can be used to verify known ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Anwendung der Biolayer-Interferometrie (BLI) zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen bei der Transkription

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...