Name: a triple primary cell culture model of the human blood-brain barrier for studying ischemic stroke in vitro
Uploaded: 2022-10-06T14:05:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) MH128022, MH122235, MH072567, MH122235, HL126559, DA044579, DA039576, DA040537, DA050528 ו- DA047157.

הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל התאים, החומרים, הציוד והפתרונות המשמשים בפרוטוקול זה.
1. הגדרת מודל BBB של תרבית תאים משולשת
<ol><li>זריעת פריציטים<ol><li>טפחו HBVP בבקבוקי תרבית T75 עם משטח פעיל להידבקות תאים בתוך אינקובטור 5% CO2 בטמפרטורה של 37 ?...

<ol>
	<li>Mozaffarian, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+disease+and+stroke+statistics-2016+update:+a+report+from+the+American+Heart+Association.">Heart disease and stroke statistics-2016 update: a report from the American Heart Association.</a> Circulation. 133 (94), 38 (2016).</li><li>Yousufuddin, M., Young, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+and+ischemic+stroke.">Aging and ischemic stroke.</a> Aging. 11 (9), 2542-2544 (2019).</li><li>Donkor, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroke+in+the+21st+century:+a+snapshot+of+the+burden,+epidemiology,+and+quality+of+life.">Stroke in the 21st century: a snapshot of the burden, epidemiology, and quality of life.</a> Stroke Research and Treatment. , 3238165 (2018).</li><li>Kadry, H., Noorani, B., Cucullo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+blood-brain+barrier+overview+on+structure,+function,+impairment,+and+biomarkers+of+integrity.">A blood-brain barrier overview on structure, function, impairment, and biomarkers of integrity.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 17 (1), 69 (2020).</li><li>Brown, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+and+neurovascular+function+in+the+healthy+and+diseased+brain.">Pericytes and neurovascular function in the healthy and diseased brain.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 282 (2019).</li><li>Cabezas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+modulation+of+blood+brain+barrier:+perspectives+on+Parkinson's+disease.">Astrocytic modulation of blood brain barrier: perspectives on Parkinson's disease.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 211 (2014).</li><li>Abdullahi, W., Tripathi, D., Ronaldson, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+dysfunction+in+ischemic+stroke:+targeting+tight+junctions+and+transporters+for+vascular+protection.">Blood-brain barrier dysfunction in ischemic stroke: targeting tight junctions and transporters for vascular protection.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 315 (3), 343-356 (2018).</li><li>Candelario-Jalil, E., Dijkhuizen, R. M., Magnus, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammation,+stroke,+blood-brain+barrier+dysfunction,+and+imaging+modalities.">Neuroinflammation, stroke, blood-brain barrier dysfunction, and imaging modalities.</a> Stroke. 53 (5), 1473-1486 (2022).</li><li>He, Y., Yao, Y., Tsirka, S. E., Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-culture+models+of+the+blood-brain+barrier.">Cell-culture models of the blood-brain barrier.</a> Stroke. 45 (8), 2514-2526 (2014).</li><li>Thomsen, L. B., Burkhart, A., Moos, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+triple+culture+model+of+the+blood-brain+barrier+using+porcine+brain+endothelial+cells,+astrocytes+and+pericytes.">A triple culture model of the blood-brain barrier using porcine brain endothelial cells, astrocytes and pericytes.</a> PLoS One. 10 (8), 0134765 (2015).</li><li>Song, Y., Cai, X., Du, D., Dutta, P., Lin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+blood-brain+barrier+models+for+in+vitro+biological+analysis:+one+cell+type+vs+three+cell+types.">Comparison of blood-brain barrier models for in vitro biological analysis: one cell type vs three cell types.</a> ACS Applied Bio Materials. 2 (3), 1050-1055 (2019).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+nanoparticles+induce+tight+junction+disruption+and+astrocyte+neurotoxicity+in+a+rat+blood-brain+barrier+primary+triple+coculture+model.">Silver nanoparticles induce tight junction disruption and astrocyte neurotoxicity in a rat blood-brain barrier primary triple coculture model.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 6105-6118 (2015).</li><li>Appelt-Menzel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+human+blood-brain+barrier+co-culture+model+mimicking+the+neurovascular+unit+using+induced+pluri-+and+multipotent+stem+cells.">Establishment of a human blood-brain barrier co-culture model mimicking the neurovascular unit using induced pluri- and multipotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 894-906 (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+construction+of+a+reversible+arylazo-based+NIR+probe+for+cycling+hypoxia+imaging+in+vivo.">Rational construction of a reversible arylazo-based NIR probe for cycling hypoxia imaging in vivo.</a> Nature Communications. 12 (1), 2772 (2021).</li><li>Palacio-Casta&#241;eda, V., Kooijman, L., Venzac, B., Verdurmen, W. P. R., Le Gac, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+switching+of+tumor+cells+under+hypoxic+conditions+in+a+tumor-on-a-chip+model.">Metabolic switching of tumor cells under hypoxic conditions in a tumor-on-a-chip model.</a> Micromachines. 11 (4), 382 (2020).</li><li>Ramsauer, M., Krause, D., Dermietzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+of+the+blood-brain+barrier+in+vitro+and+the+function+of+cerebral+pericytes.">Angiogenesis of the blood-brain barrier in vitro and the function of cerebral pericytes.</a> FASEB Journal. 16 (10), 1274-1276 (2002).</li><li>Lyck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALCAM+(CD166)+is+involved+in+extravasation+of+monocytes+rather+than+T+cells+across+the+blood-brain+barrier.">ALCAM (CD166) is involved in extravasation of monocytes rather than T cells across the blood-brain barrier.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 37 (8), 2894-2909 (2017).</li><li>Rizzi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+triple+culture+cell+system+modeling+the+human+blood-brain+barrier.">A triple culture cell system modeling the human blood-brain barrier.</a> Journal of Visualized Experiments. (177), (2021).</li><li>Kumar, S., Shaw, L., Lawrence, C., Lea, R., Alder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P50:+Developing+a+physiologically+relevant+blood+brain+barrier+model+for+the+study+of+drug+disposition+in+glioma.">P50: Developing a physiologically relevant blood brain barrier model for the study of drug disposition in glioma.</a> Neuro-Oncology. 16 (6), (2014).</li><li>Stone, N. L., England, T. J., O'Sullivan, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+transwell+blood+brain+barrier+model+using+primary+human+cells.">A novel transwell blood brain barrier model using primary human cells.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 230 (2019).</li><li>Al Ahmad, A., Taboada, C. B., Gassmann, M., Ogunshola, O. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+and+pericytes+differentially+modulate+blood-brain+barrier+characteristics+during+development+and+hypoxic+insult.">Astrocytes and pericytes differentially modulate blood-brain barrier characteristics during development and hypoxic insult.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 31 (2), 693-705 (2011).</li></ol>

בפרוטוקול זה אנו מתארים שיטה להקמת מודל BBB אמין של תרבית תאי אנדותל-פריציטים-אסטרוציטים לחקר תפקוד לקוי של BBB בהגדרה של שבץ איסכמי במבחנה. בהתחשב בכך pericytes הם השכנים הקרובים ביותר של תאי אנדותל in vivo, HBVP מצופים על החלק התחתון של מוסיף היטב מודלזה 16. למרות שתצורה זו חסרה ?...

שבץ מוחי הוא אחד הגורמים המובילים למוות ולנכות ארוכת טווח ברחבי העולם1. שכיחות השבץ עולה במהירות עם הגיל, ומכפילה את עצמה כל 10 שנים לאחר גיל 552. שבץ איסכמי מתרחש כתוצאה מהפרעה בזרימת הדם במוח עקב אירועים טרומבוטיים ותסחיפיים, המקיפים יותר מ -80% מכלל מקרי השבץ3. גם כיום, קיימות אפשרויות טיפול מעטות יחסית למזעור מוות של רקמות בעקבות שבץ איסכמי. הטיפולים שכן קיימים הם תלויי זמן וכתוצאה מכך לא תמיד מובילים לתוצאות קליניות טובות. לכן, מחקר על מנגנונים תאיים מורכבים של שבץ איסכמי המשפיעים על התאוששות לאחר שבץ הוא נחוץ בדחיפות.
ה-BBB הוא ממשק דינמי להחלפת מולקולות בין הדם לפרנכימה של המוח. מבחינה מבנית, ה-BBB מורכב מתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח המחוברים ביניהם על ידי קומפלקסים צומתיים המוקפים בקרום מרתף, פריציטים ואנדפיטים אסטרוציטיים4. פריסיטים ואסטרוציטים ממלאים תפקיד חיוני בשמירה על שלמות BBB באמצעות הפרשת גורמים שונים הדרושים להיווצרות צמתים חזקים והדוקים 5,6. התמוטטות ה- BBB היא אחד מסימני ההיכר של שבץ איסכמי. תגובה דלקתית חריפה ועקה חמצונית הקשורה לאיסכמיה מוחית גורמת לשיבוש של קומפלקסים של חלבונים בצמתים הדוקים ולהצלבה לא מווסתת בין אסטרוציטים, פריציטים ותאי אנדותל, מה שמוביל לחדירות מוגברת של מומסים פרא-תאיים ברחבי BBB7. תפקוד לקוי של BBB מקדם עוד יותר את היווצרות בצקת המוח ומגביר את הסיכון לטרנספורמציה דימומית8. בהתחשב בכל האמור לעיל, יש עניין רב בהבנת השינויים המולקולריים והתאיים המתרחשים ברמת BBB במהלך ואחרי שבץ איסכמי.
למרות שמודלים רבים של BBB במבחנה פותחו בעשורים האחרונים ומשמשים במגוון מחקרים, אף אחד מהם לא יכול לשכפל באופן מלא בתנאי in vivo 9. בעוד שחלק מהמודלים מבוססים על מונולרים של תאי אנדותל שגודלו בתרבית על תמיכות חדירות היטב לבדן או בשילוב עם פריסיטים או אסטרוציטים, רק מחקרים עדכניים יותר הציגו עיצובים של מודלים של תרביות תאים משולשות. כמעט כל המודלים הקיימים של BBB בתרבית משולשת משלבים תאי אנדותל ראשוניים במוח יחד עם אסטרוציטים ופריסיטים שבודדו ממיני בעלי חיים או תאים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים10,11,12,13.
מתוך הכרה בצורך לשחזר טוב יותר את ה-BBB במבחנה האנושית, הקמנו תרבית תאים משולשת במבחנה מודל BBB המורכב מתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח האנושי (HBMEC), אסטרוציטים אנושיים ראשוניים (HA) ופריסיטים וסקולריים ראשוניים במוח האנושי (HBVP). דגם BBB תלת-תרבותי זה ממוקם על צלחת 6 בארות, תוספות קרום פוליאסטר בגודל נקבוביות של 0.4 מיקרומטר. תוספות טובות אלה מספקות סביבה אופטימלית לחיבור תאים ומאפשרות גישה נוחה הן לתאים אפיקליים (דם) והן לתאים בזולטרליים (מוח) לדגימה בינונית או ליישום מורכב. התכונות של מודל BBB מוצע זה של תרבית תאים משולשת מוערכות על ידי מדידת TEER ושטף על-תאי לאחר OGD המחקה שבץ איסכמי במבחנה, עם מחסור בחמצן (<1% O2) וחומרים מזינים (על ידי שימוש במדיום נטול גלוקוז) המושג באמצעות תא לח ואטום. בנוסף, תנאים דמויי איסכמיה המושרים במודל זה מאומתים במדויק על ידי הדמיה ישירה של תאים היפוקסיים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 mm Transwell with 0.4 &#181;m Pore Polyester Membrane Insert</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Glass Bottom Dishes</td>
			<td>MatTek Life Sciences (FISHERSCI)</td>
			<td>P35GC-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Astrocyte Medium</td>
			<td>Science Cell</td>
			<td>1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attachment Factor</td>
			<td>Cell Systems (Fisher Scientific)</td>
			<td>4Z0-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 60 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrainPhys Imaging Optimized Medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Classic Medium With Serum and CultureBoost</td>
			<td>4Z0-500</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes (Conical Bottom with CentriStar Cap</td>
			<td>VWR</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 75cm&#178; U-Shaped Canted Neck Not Treated Cell Culture Flask&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431464U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning CellBIND 96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countes Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ZGEXSCCOUNTESS2FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decon CiDehol 70 Isopropyl Alcohol Solution&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>04-355-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Petri Dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Medium (No glucose, No glutamine, No phenol red)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A14430-01</td>
			<td>Glucose-free medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (No Calcium, No Magnesium)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM Endothelial Cell Growth Basal Medium, Phenol Red Free, 500 mL</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM2 Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter with STX2 electrodes</td>
			<td>World Precison Instruments</td>
			<td>NC9792051</td>
			<td>Epithelial voltohmmeter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate&#8211;dextran (wt 20,000)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>FD20-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate&#8211;dextran (wt 70,000)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>FD70S-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorview FV3000 Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Tank (95% N2, 5% CO2)</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>X02NI95C2003071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (No calcium, No magnesium, no phenol red)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Astrocytes</td>
			<td>Science Cell</td>
			<td>1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Brain Vascular Pericytes</td>
			<td>Science Cell</td>
			<td>1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxia Incubator Chamber</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>27310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image-iT Green Hypoxia Reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>I14834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pericyte Medium</td>
			<td>Science Cell</td>
			<td>1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Human Brain Microvascular Endothelial Cells</td>
			<td>ACBRI 376</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking Platform Shaker, Double</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10860-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Flow Meter</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>27311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax iD3 Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>75886-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, 25 mm, 0.22 &#956;m, PVDF, Sterile</td>
			<td>NEST Scientific</td>
			<td>380121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP Mutli-well Plates (6 wells)</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>TP92406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP Tissue Culture Flasks T-75 Flasks</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>TP90075</td>
			<td>Flasks with activated surface for cell adhesion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Distilled Water</td>
			<td>Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td>10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uno Stage Top Incubator-</td>
			<td>Oko Lab</td>
			<td>UNO-T-H-CO2-TTL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a triple primary cell culture model of the human blood-brain barrier for studying ischemic stroke in vitro

שבץ איסכמי הוא גורם מרכזי למוות ולנכות ברחבי העולם עם אפשרויות טיפוליות מוגבלות. הנוירופתולוגיה של שבץ איסכמי מאופיינת על ידי הפרעה באספקת הדם למוח המובילה למוות תאי ותפקוד קוגניטיבי. במהלך ואחרי שבץ איסכמי, תפקוד לקוי של מחסום דם-מוח (BBB) מקל על התקדמות הפציעה ותורם להחלמה לקויה של המטופל. המודלים הנוכחיים של BBB כוללים בעיקר מונוקולטורות אנדותל ותרביות כפולות עם אסטרוציטים או פריציטים.
מודלים כאלה חסרים את היכולת לחקות באופן מלא מיקרו-סביבה מוחית דינמית, החיונית לתקשורת בין תאים. בנוסף, מודלים נפוצים של BBB מכילים לעתים קרובות תאי אנדותל אנושיים מונצחים או תרביות תאים שמקורן בבעלי חיים (מכרסם, חזיר או בקר) המציבות מגבלות תרגום. מאמר זה מתאר מודל BBB חדשני המבוסס על הכנסה טובה המכיל רק תאים אנושיים ראשוניים (תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח, אסטרוציטים ופריסיטים של כלי דם במוח) המאפשרים לחקור פגיעה מוחית איסכמית במבחנה. 
ההשפעות של מחסור בחמצן-גלוקוז (OGD) על שלמות המחסום הוערכו על ידי חדירות פסיבית, מדידות התנגדות חשמלית טרנסאנדותליאלית (TEER) והדמיה ישירה של תאים היפוקסיים. הפרוטוקול המוצג מציע יתרון מובהק בחיקוי הסביבה הבין-תאית של ה-BBB in vivo, ומשמש כמודל BBB מציאותי יותר במבחנה לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות במסגרת פגיעה מוחית איסכמית.

כדי לבחון את ההשפעות של אסטרוציטים ופריסיטים על תפקוד המחסום של HBMEC, בנינו את מודל ה-BBB של תרבית תאים משולשת על תוספות תרביות תאים (איור 1A) יחד עם מונוקולטורה של HBMEC ושני מודלים של תרביות משותפות כפולות כבקרות (איור 1B). בקרות כפולות של תרבית משותפת כללו תרבית מ?...

Watch this Scientific Journal Video about A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro at JoVE.com

A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro

במאמר זה נתאר את השיטה לביסוס מודל של תרבית תאים משולשת של מחסום הדם-מוח המבוסס על תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ראשוניים במוח האנושי, אסטרוציטים ופריציטים. מודל רב-תאי זה מתאים למחקרים על תפקוד לקוי של יחידות נוירו-וסקולריות במהלך שבץ איסכמי במבחנה או לסינון מועמדים לתרופות.

מודל תלת-תאי ראשוני של מחסום הדם-מוח האנושי לחקר שבץ איסכמי במבחנה

Ischemic stroke is a major cause of death and disability worldwide with limited therapeutic options. The neuropathology of ischemic stroke is ...

הפרוטוקול שלנו מכיר בצורך לשחזר טוב יותר את מחסום הדם-מוח האנושי במבחנה לצורך חקר מנגנונים תאיים מורכבים המשפיעים על ההתאוששות לאחר שבץ. המודל המשולש שלנו מפגין שלמות איתנה הקשורה בחלקה למידור גדול של תוספות באר, מה שמאפשר לנו להקטין את תדירות השינויים ולמנוע הפרעה לאוכלוסיות. המודל שלנו הוא כלי נהדר לחקר השינויים המולקולריים והתאיים המתרחשים במחסום הדם-מוח במהלך שבץ איסכמי ולאחריו.הפרוטוקול שלנו מאפשר גילוי של מטרות וטיפולים חדשניים לשיפור ההתאוששות לאחר שבץ מוחי. הטיפולים הקיימים כיום בשבץ איסכמי הם רגישים לזמן וכתוצאה מכך אינם תמיד יעילים. התחילו בטיפוח HBVP בצלוחיות תרבית T75 עם משטח פעיל להדבקת תאים בתוך חממה של 5% פחמן דו חמצני בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד למפגש.ברגע שמגיעים למפגש, שאפו את מדיום הפריציטים הישן ושטפו את התאים עם חמישה מיליליטר של PBS חם של דולבקו. שאפו את ה-PBS של דולבקו ונתקו את התאים מהבקבוקון באמצעות שילוב של ארבעה מיליליטר של תמיסת טריפסין EDTA חמה ומיליליטר אחד של PBS של דולבקו. לדגור את הבקבוקון במשך חמש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור פחמן דו חמצני.מבט תחת מיקרוסקופ כדי לוודא אם התאים מנותקים מהבקבוקון. הוסיפו חמישה מיליליטר של מדיום פריציטים חם המכיל 2% FBS לבקבוקון והעבירו את התאים המנותקים לצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר. צנטריפוגה של מתלה התא במשך שלוש דקות ב 200 גרם המאפשר לתאים ליצור גלולה בתחתית הצינור.שאפו את המדיום מהצינור כדי להבטיח שכדור התא יישאר שלם. להשעות מחדש את גלולת התא במדיום פריציטים. חשב את כמות המדיום בהתאם למפגש התאים ומספר תוספות הבאר הדרושות.קח 10 מיקרוליטרים של תאים תלויים מחדש, הכנס אותם לתוך שקופית ספירת תאים, וספור את מספר התאים. לקבוע את צפיפות התא ואת זרע 300, 000 תאים לכל להוסיף מיליליטר אחד של מדיום pericyte על הצד abluminal של מוסיף היטב. טפחו אסטרוציטים אנושיים ראשוניים באמצעות מדיום האסטרוציטים המכיל 2%FBS כמתואר בכתב היד של הטקסט.לקבוע את צפיפות התאים ואת הזרע 300, 000 תאים לכל באר על החלק התחתון של תרבית רקמה שש צלחות היטב. מכסים את הצלחת כדי למנוע אידוי ודוגרים למשך הלילה. באופן דומה, טפחו HBMEC במנות תרביות רקמה באמצעות מדיום קלאסי שלם המכיל 10% FBS כמתואר בכתב היד של הטקסט.הוציאו את תרבית הרקמה שש צלחות באר המכילות אסטרוציטים ואת תוספות הבאר המכילות פריסיטים מהאינקובטור. שאפו את מדיום האסטרוציטים מתרבית הרקמה שש צלחות באר והוסיפו מיליליטר אחד של מדיום פריציטים ומיליליטר אחד של מדיום אסטרוציטים לכל באר. שאפו את מדיום הפריציטים מתוספות הבאר והכניסו אותם לתרביית הרקמה צלחות שש בארות המכילות את האסטרוציטים שנזרעו.זרע HBMEC בצפיפות של 300, 000 תאים לכל באר בשני מיליליטר של מדיום קלאסי שלם על הצד האפי של אותה באר מוסיף. שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS של דולבקו. עבור תרביות תאים משולשות הנתונות למחסור בחמצן-גלוקוז, יש להוסיף מדיום נטול גלוקוז הן לתאים האפיקליים והן לתאים הבזולטרליים.החלף את מדיום התרבית בתרביות תאי בקרה בינוניות ונורמוקסיות טריות. הצבת תרביות בקרה משולשות בחממה של 5% פחמן דו חמצני בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. הניחו צלחת פטרי המכילה 20 מיליליטר מים סטריליים בתא האינקובטור של היפוקסיה כדי לספק לחות מספקת של התרביות.פתח את התא על ידי שחרור מהדק הטבעת, ולאחר מכן סדר את תרביות התאים על המדפים. אטמו את החדר על ידי אבטחת מהדק הטבעת. פתח את פתחי הכניסה והיציאה של התא וחבר את הצינורות מראש מד הזרימה של התא.חברו את הצינורות מתחתית מד הזרימה למיכל הדלק באמצעות מסנן אוויר. פתח את שסתום בקרת זרימת המיכל על ידי סיבובו נגד כיוון השעון כדי לאפשר זרימת גז מינימלית. פתח באיטיות את שסתום ווסת הלחץ על ידי סיבוב בכיוון השעון.שוטפים את התא עם תערובת הגז במשך חמש דקות בקצב זרימה של 20 ליטר לדקה. נתקו את התא ממקור הגז וסגרו היטב את שני מהדקי הפלסטיק הלבן. כבה את שסתום בקרת זרימת המיכל על ידי סיבוב בכיוון השעון.סגור את שסתום וסת הלחץ על ידי סיבוב נגד כיוון השעון. מניחים את תא ההיפוקסיה באינקובטור קונבנציונלי שנקבע על 37 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות. הכנס את מכשיר ה- TEER המעוקר לארון הביו-בטיחותי וחבר את האלקטרודות למד האפיתל וולט אוהם.לעקר את האלקטרודות ב 30 מיליליטר של 70% איזופרופיל אלכוהול תמיסת מינימום של 30 דקות. הפעל את מכשיר ה- TEER והגדר את הפונקציה לאוהם. הסר את האלקטרודות מתמיסת האלכוהול 70% איזופרופיל והנח אותן ב-20 מיליליטר של PBS של Dulbecco למשך 30 דקות לפחות עד שהקריאה הדיגיטלית במכשיר TEER תקרא אפס אוהם.מכניסים את הפתח הארוך של האלקטרודה דרך אחד משלושת הפתחים בהאנגר הבאר של הבאר הריקה מורידים אותה עד שהיא נוגעת בתחתית הבאר. ודא כי הפתח הקצר מונח מעל התרבות apical בתחתית הבאר. המתן עד לביטול ערכי הקריאה הדיגיטלית במכשיר TEER לפני הקלטת הערך.החזירו את האלקטרודות ל-PBS של דולבקו כדי לשטוף אותן בין המדידות. המשך לאסוף את כל מדידות ה- TEER עבור שני פקדי הוספה ריקים נוספים. אסוף את מדידות ה- TEER של לוחות הדגימה כפי שהודגם קודם לכן.לאחר ביצוע כל המדידות האלקטרודה חזרה לתמיסת אלכוהול 70% איזופרופיל למשך 30 דקות. לאחר מכן נתק את האלקטרודות ממכשיר TEER ואפשר להן להתייבש באוויר. חישוב ערכי TEER.שאפו את המדיום מהתא הבזולטרלי והחליפו אותו בשני מיליליטרים של מדיום צמיחת תאי אנדותל אדום חופשי פנול במודל מחסום הדם-מוח של תרבית תאים משולשת. שטפו את התאים בתא האפיקלי פעמיים עם HBSS. הוסף מיליליטר אחד של תמיסת הדקסטרן FITC בתא האפיקלי וכסה את הצלחת ברדיד אלומיניום, ולאחר מכן הנח את הצלחת באינקובטור שנקבע על 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך שעה אחת.קח 100 microliters של בינוני מן התאים basolateral ולהעביר אותו לתוך צלחת שחורה 96 היטב. מדוד את הפלואורסצנציה באמצעות קורא מיקרו-לוחות כאשר העירור ואורכי גל הפליטה מוגדרים ל-480 ו-530 ננומטר, בהתאמה. זרע 200 מיקרוליטרים של HBMEC, אסטרוציטים ראשוניים, ו- HBVP במרכז פולי-D-ליזין מצופה 35 מ"מ זכוכית תחתית כלים בצפיפות של 150, 000 תאים לכל צלחת.לפני זריעת HBMEC, מצפים את תחתית הכלים עם גורם ההצמדה. אפשרו לתאים להתחבר למשטח הזכוכית על ידי השארתם למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור פחמן דו חמצני. לאחר ההגעה למפגש, יש להשליך את מדיום התרבית ולהוסיף שני מיליליטר של מדיום נטול גלוקוז שחומם מראש למחסור בחמצן-גלוקוז או מדיום רגיל לבקרה.לאחר טיפול במחסור בחמצן-גלוקוז, החליפו את המדיום במדיום המותאם להדמיה בכל הכלים, ולאחר מכן בצעו הדמיה פלואורסצנטית של תאים חיים עם מסנן GFP ואינקובטור מיקרוסקופ קונפוקלי בשלב העליון כמתואר בכתב היד של הטקסט. שלמות המחסום של מונולייר האנדותל בתצורות מודל מחסום הדם-מוח שצוינו הוערכה על ידי קביעת TEER לפני ואחרי מחסור בחמצן-גלוקוז, כמו גם לאחר 24 שעות של חמצון מחדש. במשך ארבע שעות החסך בחמצן-גלוקוז גרם לירידה משמעותית בערכי TEER רק במונוקולטורה של HBMEC ובמודל התרבית המשותפת עם HBMEC ו-HBVP.רמות נמוכות אלה הגיעו לרמות הבסיסיות לאחר 24 שעות של חמצון מחדש. ערכי ה-TEER במודל התרבית המשולשת היו גבוהים משמעותית מאלו שבבקרות הקו-תרבית הכפולות או בבקרת מונוקולטורה מיד לאחר מחסור בחמצן-גלוקוז. החדירות העל-תאית של מונו-שכבות אנדותל למסה מולקולרית של 20 קילו-דלטון, FITC dextran, הוגדלה באופן דרסטי במונוקולטורה של HBMEC ובמידה פחותה במודל התרבית המשותפת עם HBMEC ו-HBVP בהשוואה לבקרות נורמוקסיות.יתר על כן, רמות חדירות דקסטרן FITC של 20 קילודלטון היו הנמוכות ביותר במודל מחסום המוח-דם המשולש מבין כל הדגמים בתנאים נורמוקסיים ומחסור בחמצן-גלוקוז. לא נצפו שינויים ב-70 קילו-דלטון, שטף דקסטרן של FITC על פני מונו-שכבות אנדותל באף אחד מהמודלים. כל הסוגים האנושיים העיקריים שנחשפו למחסור בחמצן-גלוקוז הפגינו פלואורסצנטיות ירוקה חזקה, מה שמוכיח שהתאים החיים המצולמים היו היפוקסיים.לאחר זריעת פריסיטים וסקולריים במוח האנושי בצד האבלומינלי של תוספות באר, חשוב מאוד לכסות אותם עם צלחת הפוכה כדי למנוע אידוי. במודל שלנו אנו משתמשים בקוטר נקבוביות קטן יחסית, 0.4 מיקרומטר, של בארות פוליאסטר, מה שהופך אותו למתאים לסינון של מועמדים לתרופות לכל מחלה הדורשת חציית מחסום הדם-מוח לטיפול. טכניקה זו מספקת הזדמנות מצוינת לדמיין שינוי של חלבונים ומובילים במידת הצורך.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, ביטוי, טיהור, התגבשות של Transporter סרוטונין האדם Bound כדי<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים<em&gt; במבחנה</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

טיפול קל של ארכיטקטורות ב Hydrogels חלבון מבוססת ליישומים תרבות תא

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

שיטה ערכי צבע מוחלטים למדידת תכולת ברזל צמחים

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

ללא כיול במבחנה כימות של חלבון ההומו-oligomerization באמצעות מכשור מסחרי ותוכנות אנליזה של בהירות חינם, קוד פתוח

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

לומד RNA Interactors של חלבון ה-RNA-מופעל במהלך מחזור התא בתרבית

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput

אסטרטגיה לזיהוי תרכובות המשפיעות על צמיחת תאים והישרדות בתאי מיונקים מתורבתים בתפוקה נמוכה לבינונית

Cytotoxicity is a critical parameter that needs to be quantified when studying drugs that may have therapeutic benefits. Because of this, many drug ...

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability DARTS assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

יחסי למחצה כמותית של התרופה מגיב יציבות היעד (חצים) שיטת לימוד האינטראקציה Rapamycin/mTOR

Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) is a robust method for detection of novel small molecule protein targets. It can be used to verify known ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

יישום של ביואולייר אינטרפרומטריה (בלי) ללימוד אינטראקציות חלבונים-חלבונים בתמלול

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...