Name: a triple primary cell culture model of the human blood-brain barrier for studying ischemic stroke in vitro
Uploaded: 2022-10-06T14:05:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni MH128022, MH122235, MH072567, MH122235, HL126559, DA044579, DA040537, DA039576, DA040537, DA050528 e DA047157.

NOTA: vedere la tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutte le celle, i materiali, le apparecchiature e le soluzioni utilizzate in questo protocollo.
1. Impostazione del modello BBB a tripla coltura cellulare
<ol><li>Semina dei periciti<ol><li>Coltivare HBVP in palloni di coltura T75 con una superficie attivata per l'adesione cellulare all'interno di un incubatore al 5% di CO2 a 37 °C fino alla conflusività. Una volta raggiunta la conf...

<ol>
	<li>Mozaffarian, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+disease+and+stroke+statistics-2016+update:+a+report+from+the+American+Heart+Association.">Heart disease and stroke statistics-2016 update: a report from the American Heart Association.</a> Circulation. 133 (94), 38 (2016).</li><li>Yousufuddin, M., Young, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+and+ischemic+stroke.">Aging and ischemic stroke.</a> Aging. 11 (9), 2542-2544 (2019).</li><li>Donkor, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroke+in+the+21st+century:+a+snapshot+of+the+burden,+epidemiology,+and+quality+of+life.">Stroke in the 21st century: a snapshot of the burden, epidemiology, and quality of life.</a> Stroke Research and Treatment. , 3238165 (2018).</li><li>Kadry, H., Noorani, B., Cucullo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+blood-brain+barrier+overview+on+structure,+function,+impairment,+and+biomarkers+of+integrity.">A blood-brain barrier overview on structure, function, impairment, and biomarkers of integrity.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 17 (1), 69 (2020).</li><li>Brown, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+and+neurovascular+function+in+the+healthy+and+diseased+brain.">Pericytes and neurovascular function in the healthy and diseased brain.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 282 (2019).</li><li>Cabezas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+modulation+of+blood+brain+barrier:+perspectives+on+Parkinson's+disease.">Astrocytic modulation of blood brain barrier: perspectives on Parkinson's disease.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 211 (2014).</li><li>Abdullahi, W., Tripathi, D., Ronaldson, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+dysfunction+in+ischemic+stroke:+targeting+tight+junctions+and+transporters+for+vascular+protection.">Blood-brain barrier dysfunction in ischemic stroke: targeting tight junctions and transporters for vascular protection.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 315 (3), 343-356 (2018).</li><li>Candelario-Jalil, E., Dijkhuizen, R. M., Magnus, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammation,+stroke,+blood-brain+barrier+dysfunction,+and+imaging+modalities.">Neuroinflammation, stroke, blood-brain barrier dysfunction, and imaging modalities.</a> Stroke. 53 (5), 1473-1486 (2022).</li><li>He, Y., Yao, Y., Tsirka, S. E., Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-culture+models+of+the+blood-brain+barrier.">Cell-culture models of the blood-brain barrier.</a> Stroke. 45 (8), 2514-2526 (2014).</li><li>Thomsen, L. B., Burkhart, A., Moos, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+triple+culture+model+of+the+blood-brain+barrier+using+porcine+brain+endothelial+cells,+astrocytes+and+pericytes.">A triple culture model of the blood-brain barrier using porcine brain endothelial cells, astrocytes and pericytes.</a> PLoS One. 10 (8), 0134765 (2015).</li><li>Song, Y., Cai, X., Du, D., Dutta, P., Lin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+blood-brain+barrier+models+for+in+vitro+biological+analysis:+one+cell+type+vs+three+cell+types.">Comparison of blood-brain barrier models for in vitro biological analysis: one cell type vs three cell types.</a> ACS Applied Bio Materials. 2 (3), 1050-1055 (2019).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+nanoparticles+induce+tight+junction+disruption+and+astrocyte+neurotoxicity+in+a+rat+blood-brain+barrier+primary+triple+coculture+model.">Silver nanoparticles induce tight junction disruption and astrocyte neurotoxicity in a rat blood-brain barrier primary triple coculture model.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 6105-6118 (2015).</li><li>Appelt-Menzel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+human+blood-brain+barrier+co-culture+model+mimicking+the+neurovascular+unit+using+induced+pluri-+and+multipotent+stem+cells.">Establishment of a human blood-brain barrier co-culture model mimicking the neurovascular unit using induced pluri- and multipotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 894-906 (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+construction+of+a+reversible+arylazo-based+NIR+probe+for+cycling+hypoxia+imaging+in+vivo.">Rational construction of a reversible arylazo-based NIR probe for cycling hypoxia imaging in vivo.</a> Nature Communications. 12 (1), 2772 (2021).</li><li>Palacio-Casta&#241;eda, V., Kooijman, L., Venzac, B., Verdurmen, W. P. R., Le Gac, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+switching+of+tumor+cells+under+hypoxic+conditions+in+a+tumor-on-a-chip+model.">Metabolic switching of tumor cells under hypoxic conditions in a tumor-on-a-chip model.</a> Micromachines. 11 (4), 382 (2020).</li><li>Ramsauer, M., Krause, D., Dermietzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+of+the+blood-brain+barrier+in+vitro+and+the+function+of+cerebral+pericytes.">Angiogenesis of the blood-brain barrier in vitro and the function of cerebral pericytes.</a> FASEB Journal. 16 (10), 1274-1276 (2002).</li><li>Lyck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALCAM+(CD166)+is+involved+in+extravasation+of+monocytes+rather+than+T+cells+across+the+blood-brain+barrier.">ALCAM (CD166) is involved in extravasation of monocytes rather than T cells across the blood-brain barrier.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 37 (8), 2894-2909 (2017).</li><li>Rizzi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+triple+culture+cell+system+modeling+the+human+blood-brain+barrier.">A triple culture cell system modeling the human blood-brain barrier.</a> Journal of Visualized Experiments. (177), (2021).</li><li>Kumar, S., Shaw, L., Lawrence, C., Lea, R., Alder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P50:+Developing+a+physiologically+relevant+blood+brain+barrier+model+for+the+study+of+drug+disposition+in+glioma.">P50: Developing a physiologically relevant blood brain barrier model for the study of drug disposition in glioma.</a> Neuro-Oncology. 16 (6), (2014).</li><li>Stone, N. L., England, T. J., O'Sullivan, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+transwell+blood+brain+barrier+model+using+primary+human+cells.">A novel transwell blood brain barrier model using primary human cells.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 230 (2019).</li><li>Al Ahmad, A., Taboada, C. B., Gassmann, M., Ogunshola, O. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+and+pericytes+differentially+modulate+blood-brain+barrier+characteristics+during+development+and+hypoxic+insult.">Astrocytes and pericytes differentially modulate blood-brain barrier characteristics during development and hypoxic insult.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 31 (2), 693-705 (2011).</li></ol>

In questo protocollo, descriviamo un metodo per impostare un modello affidabile di coltura di cellule tripli endoteliali-periciti-astrociti per lo studio della disfunzione della BEE nel contesto dell'ictus ischemico in vitro. Considerando che i periciti sono i vicini più prossimi delle cellule endoteliali in vivo, gli HBVP sono placcati sul lato inferiore degli inserti del pozzo in questo modello16. Sebbene questa configurazione manchi della comunicazione diretta cellula-cellula...

L'ictus è una delle principali cause di morte e disabilità a lungo termine in tutto il mondo1. L'incidenza dell'ictus aumenta rapidamente con l'età, raddoppiando ogni 10 anni dopo i 55 anni2. L'ictus ischemico si verifica a seguito di un'interruzione del flusso sanguigno cerebrale dovuta a eventi trombotici ed embolici, che comprende oltre l'80% di tutti i casi di ictus3. Anche ora, ci sono relativamente poche opzioni di trattamento disponibili per ridurre al minimo la morte dei tessuti dopo l'ictus ischemico. I trattamenti esistenti sono sensibili al tempo e di conseguenza non sempre portano a buoni risultati clinici. Pertanto, è urgentemente necessaria la ricerca sui complessi meccanismi cellulari dell'ictus ischemico che influenzano il recupero post-ictus.
La BBB è un'interfaccia dinamica per lo scambio di molecole tra il sangue e il parenchima cerebrale. Strutturalmente, la BBB è composta da cellule endoteliali microvascolari cerebrali interconnesse da complessi giunzionali circondati da una membrana basale, periciti e estremità astrocitiche4. Periti e astrociti svolgono un ruolo essenziale nel mantenimento dell'integrità della BEE attraverso la secrezione di vari fattori necessari per la formazione di giunzioni forti e strette 5,6. La rottura della BBB è uno dei tratti distintivi dell'ictus ischemico. La risposta infiammatoria acuta e lo stress ossidativo associati all'ischemia cerebrale provocano la rottura dei complessi proteici a giunzione stretta e la diafonia disregolata tra astrociti, periciti e cellule endoteliali, che porta ad un aumento della permeabilità del soluto paracellulare attraverso la BBB7. La disfunzione della BEE promuove ulteriormente la formazione di edema cerebrale e aumenta il rischio di trasformazione emorragica8. Considerando tutto quanto sopra, c'è un grande interesse nella comprensione dei cambiamenti molecolari e cellulari che si verificano a livello di BBB durante e dopo l'ictus ischemico.
Sebbene molti modelli di BBB in vitro siano stati sviluppati negli ultimi decenni e utilizzati in una varietà di studi, nessuno di essi può replicare completamente le condizioni in vivo 9. Mentre alcuni modelli sono basati su monostrati di cellule endoteliali coltivati su supporti permeabili ben inseriti da soli o in combinazione con periciti o astrociti, solo studi più recenti hanno introdotto progetti di modelli di coltura cellulare tripla. Quasi tutti i modelli esistenti di tripla coltura BBB incorporano cellule endoteliali cerebrali primarie insieme ad astrociti e periciti isolati da specie animali o cellule derivate da cellule staminali pluripotenti umane10,11,12,13.
Riconoscendo la necessità di ricapitolare meglio la BBB umana in vitro, abbiamo stabilito un modello di BBB in vitro con tripla coltura cellulare composto da cellule endoteliali microvascolari del cervello umano (HBMEC), astrociti umani primari (HA) e periciti vascolari primari del cervello umano (HBVP). Questo modello BBB a tripla coltura è impostato su inserti in membrana di poliestere a 6 pozzetti con dimensioni dei pori di 0,4 μm. Questi inserti forniscono un ambiente ottimale per l'attacco cellulare e consentono un facile accesso ai compartimenti apicali (sangue) e basolaterale (cervello) per il campionamento medio o l'applicazione di composti. Le caratteristiche di questo modello di BBB di coltura a tripla cellula proposto sono valutate misurando TEER e flusso paracellulare post OGD che imita l'ictus ischemico in vitro, con una carenza di ossigeno (<1% O2) e nutrienti (utilizzando terreno privo di glucosio) ottenuta utilizzando una camera umidificata e sigillata. Inoltre, le condizioni ischemiche-simili indotte in questo modello sono accuratamente verificate mediante visualizzazione diretta delle cellule ipossiche.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 mm Transwell with 0.4 &#181;m Pore Polyester Membrane Insert</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Glass Bottom Dishes</td>
			<td>MatTek Life Sciences (FISHERSCI)</td>
			<td>P35GC-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Astrocyte Medium</td>
			<td>Science Cell</td>
			<td>1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attachment Factor</td>
			<td>Cell Systems (Fisher Scientific)</td>
			<td>4Z0-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 60 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrainPhys Imaging Optimized Medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Classic Medium With Serum and CultureBoost</td>
			<td>4Z0-500</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes (Conical Bottom with CentriStar Cap</td>
			<td>VWR</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 75cm&#178; U-Shaped Canted Neck Not Treated Cell Culture Flask&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431464U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning CellBIND 96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countes Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ZGEXSCCOUNTESS2FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decon CiDehol 70 Isopropyl Alcohol Solution&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>04-355-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Petri Dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Medium (No glucose, No glutamine, No phenol red)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A14430-01</td>
			<td>Glucose-free medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (No Calcium, No Magnesium)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM Endothelial Cell Growth Basal Medium, Phenol Red Free, 500 mL</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM2 Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter with STX2 electrodes</td>
			<td>World Precison Instruments</td>
			<td>NC9792051</td>
			<td>Epithelial voltohmmeter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate&#8211;dextran (wt 20,000)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>FD20-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate&#8211;dextran (wt 70,000)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>FD70S-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorview FV3000 Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Tank (95% N2, 5% CO2)</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>X02NI95C2003071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (No calcium, No magnesium, no phenol red)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Astrocytes</td>
			<td>Science Cell</td>
			<td>1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Brain Vascular Pericytes</td>
			<td>Science Cell</td>
			<td>1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxia Incubator Chamber</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>27310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image-iT Green Hypoxia Reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>I14834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pericyte Medium</td>
			<td>Science Cell</td>
			<td>1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Human Brain Microvascular Endothelial Cells</td>
			<td>ACBRI 376</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking Platform Shaker, Double</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10860-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Flow Meter</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>27311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax iD3 Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>75886-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, 25 mm, 0.22 &#956;m, PVDF, Sterile</td>
			<td>NEST Scientific</td>
			<td>380121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP Mutli-well Plates (6 wells)</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>TP92406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP Tissue Culture Flasks T-75 Flasks</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>TP90075</td>
			<td>Flasks with activated surface for cell adhesion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Distilled Water</td>
			<td>Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td>10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uno Stage Top Incubator-</td>
			<td>Oko Lab</td>
			<td>UNO-T-H-CO2-TTL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a triple primary cell culture model of the human blood-brain barrier for studying ischemic stroke in vitro

L'ictus ischemico è una delle principali cause di morte e disabilità in tutto il mondo con opzioni terapeutiche limitate. La neuropatologia dell'ictus ischemico è caratterizzata da un'interruzione dell'afflusso di sangue al cervello che porta alla morte cellulare e alla disfunzione cognitiva. Durante e dopo l'ictus ischemico, la disfunzione della barriera emato-encefalica (BBB) facilita la progressione della lesione e contribuisce a uno scarso recupero del paziente. Gli attuali modelli di BBB includono principalmente monocolture endoteliali e doppie co-colture con astrociti o periciti.
Tali modelli non hanno la capacità di imitare completamente un microambiente cerebrale dinamico, che è essenziale per la comunicazione cellula-cellula. Inoltre, i modelli BBB comunemente usati contengono spesso cellule endoteliali umane immortalizzate o colture cellulari di derivazione animale (roditori, suini o bovini) che pongono limitazioni traslazionali. Questo articolo descrive un nuovo modello di BBB basato su inserti contenenti solo cellule umane primarie (cellule endoteliali microvascolari cerebrali, astrociti e periciti vascolari cerebrali) che consente lo studio del danno cerebrale ischemico in vitro. 
Gli effetti della deprivazione di ossigeno-glucosio (OGD) sull'integrità della barriera sono stati valutati mediante misurazioni di permeabilità passiva, resistenza elettrica transendoteliale (TEER) e visualizzazione diretta delle cellule ipossiche. Il protocollo presentato offre un netto vantaggio nell'imitare l'ambiente intercellulare della BBB in vivo, fungendo da modello di BBB in vitro più realistico per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche nel contesto della lesione cerebrale ischemica.

Per esaminare gli effetti di astrociti e periciti sulla funzione barriera di HBMEC, abbiamo costruito il modello BBB di coltura cellulare tripla su inserti di coltura cellulare (Figura 1A) insieme alla monocoltura HBMEC e due modelli di doppia co-coltura come controlli (Figura 1B). I doppi controlli di co-coltura includevano una co-coltura senza contatto di HBMEC con HA e una co-coltura di contatto di HBMEC con HBVP. Dopo 6 giorni di co-coltura, tutti i setup sp...

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A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro

Qui, descriviamo il metodo per stabilire un modello di coltura cellulare tripla della barriera emato-encefalica basato su cellule endoteliali microvascolari primarie del cervello umano, astrociti e periciti. Questo modello multicellulare è adatto per studi di disfunzione delle unità neurovascolari durante l'ictus ischemico in vitro o per lo screening di farmaci candidati.

Un triplo modello di coltura cellulare primaria della barriera emato-encefalica umana per lo studio dell'ictus ischemico in vitro

Ischemic stroke is a major cause of death and disability worldwide with limited therapeutic options. The neuropathology of ischemic stroke is ...

Il nostro protocollo riconosce la necessità di ricapitolare meglio la barriera emato-encefalica umana in vitro per lo studio dei complessi meccanismi cellulari che influenzano il recupero post-ictus. Il nostro modello triplo mostra una robusta integrità che è in parte correlata all'ampia compartimentazione degli inserti dei pozzi, permettendoci di ridurre la frequenza di cambio ed evitare interruzioni delle popolazioni. Il nostro modello è un ottimo strumento per studiare i cambiamenti molecolari e cellulari che si verificano alla barriera emato-encefalica durante e dopo l'ictus ischemico.Il nostro protocollo consente la scoperta di nuovi bersagli e terapie per migliorare il recupero post-ictus. Gli attuali trattamenti per l'ictus ischemico sono sensibili al tempo e di conseguenza non sono sempre efficaci. Inizia coltivando HBVP in flaconi di coltura T75 con una superficie attivata per l'adesione cellulare all'interno di un incubatore di anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius fino a quando non è confluente.Una volta raggiunta la confluenza, aspirare il vecchio mezzo pericitario e lavare le cellule con cinque millilitri di PBS caldo di Dulbecco. Aspirare il PBS di Dulbecco e staccare le cellule dal pallone usando una combinazione di quattro millilitri di soluzione calda di tripsina EDTA e un millilitro di PBS di Dulbecco. Incubare il pallone per cinque minuti a 37 gradi Celsius in un incubatore ad anidride carbonica.Visualizza al microscopio per confermare se le cellule sono staccate dal pallone. Aggiungere cinque millilitri di mezzo pericitario caldo contenente il 2% di FBS al pallone e trasferire le cellule staccate in una provetta da centrifuga da 50 millilitri. Centrifugare la sospensione cellulare per tre minuti a 200 g permettendo alle cellule di formare un pellet sul fondo del tubo.Aspirare il mezzo dal tubo assicurandosi che il pellet cellulare rimanga intatto. Risospendere il pellet cellulare nel mezzo pericitario. Calcolare la quantità di mezzo in base alla confluenza delle celle e al numero di inserti necessari.Prendi 10 microlitri delle celle risospese, mettile in un vetrino per il conteggio delle cellule e conta il numero di celle. Determinare la densità cellulare e seminare 300.000 cellule per inserto in un millilitro di mezzo pericitario sul lato abluminale degli inserti del pozzetto. Coltivare astrociti umani primari utilizzando il mezzo astrocitario contenente il 2% FBS come descritto nel manoscritto testuale.Determinare la densità cellulare e seminare 300.000 cellule per pozzetto sul fondo delle piastre a sei pozzetti della coltura tissutale. Coprire la piastra per evitare l'evaporazione e incubare durante la notte. Allo stesso modo, coltivare HBMEC in piatti di coltura tissutale utilizzando un mezzo classico completo contenente il 10% di FBS come descritto nel manoscritto testuale.Estrarre le piastre a sei pozzetti contenenti astrociti per coltura tissutale e gli inserti del pozzetto contenenti periciti dall'incubatore. Aspirare il mezzo astrocitario dalle piastre a sei pozzetti della coltura tissutale e aggiungere un millilitro di terreno pericitario e un millilitro di mezzo astrocitario a ciascun pozzetto. Aspirare il mezzo pericitario dagli inserti del pozzetto e inserirli nelle piastre a sei pozzetti della coltura tissutale contenenti gli astrociti seminati.Seminare HBMEC ad una densità di 300.000 cellule per pozzetto in due millilitri di mezzo classico completo sul lato apicale degli stessi inserti del pozzetto. Lavare le cellule tre volte con il PBS di Dulbecco. Per le colture a tripla cellula sottoposte a privazione di ossigeno-glucosio, aggiungere terreno privo di glucosio sia al compartimento apicale che basolaterale.Sostituire il terreno di coltura con colture cellulari di controllo fresche e normossiche. Posizionare le colture triple di controllo nell'incubatore ad anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius. Posizionare una capsula di Petri contenente 20 millilitri di acqua sterile nella camera dell'incubatore dell'ipossia per fornire un'adeguata umidificazione delle colture.Aprire la camera rilasciando il morsetto ad anello, quindi disporre le colture cellulari sugli scaffali. Sigillare la camera fissando il morsetto ad anello. Aprire le porte di ingresso e uscita della camera e collegare il tubo dalla parte superiore del flussometro della camera.Collegare il tubo dal fondo del flussometro al serbatoio del gas tramite un filtro dell'aria. Aprire la valvola di controllo del flusso del serbatoio ruotandola in senso antiorario per consentire il flusso minimo di gas. Aprire lentamente la valvola del regolatore di pressione ruotando in senso orario.Lavare la camera con la miscela di gas per cinque minuti ad una portata di 20 litri al minuto. Scollegare la camera dalla fonte di gas e chiudere saldamente entrambi i morsetti di plastica bianca. Spegnere la valvola di controllo del flusso del serbatoio ruotando in senso orario.Chiudere la valvola del regolatore di pressione ruotando in senso antiorario. Posizionare la camera di ipossia in un'incubatrice convenzionale impostata a 37 gradi Celsius per quattro ore. Posizionare lo strumento TEER sterilizzato nell'armadio di biosicurezza e collegare gli elettrodi al volt ohmmetro epiteliale.Sterilizzare gli elettrodi in 30 millilitri di soluzione di alcol isopropilico al 70% per un minimo di 30 minuti. Accendere lo strumento TEER e impostare la funzione su ohm. Rimuovere gli elettrodi dalla soluzione di alcol isopropilico al 70% e posizionarli in 20 millilitri di PBS di Dulbecco per un minimo di 30 minuti fino a quando la lettura digitale sul dispositivo TEER legge zero ohm.Inserire la punta lunga dell'elettrodo attraverso una delle tre aperture nell'hangar dell'inserto del pozzo bianco controllo dell'inserto abbassandolo fino a toccare il fondo del pozzetto. Assicurarsi che la punta corta sia appoggiata sopra la coltura apicale sul fondo dell'inserto del pozzo. Attendere che i valori di lettura digitale sullo strumento TEER si stabilizzino prima di registrare il valore.Riposizionare gli elettrodi nel PBS di Dulbecco per lavarli tra una misurazione e l'altra. Continuare a raccogliere tutte le misurazioni TEER per altri due controlli di inserimento del pozzo vuoto. Raccogliere le misurazioni TEER delle piastre campione come illustrato in precedenza.Una volta effettuate tutte le misurazioni, l'elettrodo torna nella soluzione di alcol isopropilico al 70% per 30 minuti. Quindi scollegare gli elettrodi dallo strumento TEER e lasciarli asciugare all'aria. Calcolare i valori TEER.Aspirare il mezzo dal compartimento basolaterale e sostituirlo con due millilitri di terreno di crescita delle cellule endoteliali libere rosso fenolo nel modello di barriera emato-encefalica tripla coltura cellulare. Lavare le cellule nel compartimento apicale due volte con HBSS. Aggiungere un millilitro della soluzione di destrano FITC nel compartimento apicale e coprire la piastra con un foglio di alluminio, quindi posizionare la piastra nell'incubatore impostato a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% per un'ora.Prendi 100 microlitri di mezzo dai compartimenti basolaterali e trasferiscilo in una piastra nera da 96 pozzetti. Misurare la fluorescenza utilizzando un lettore di micropiastre con le lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione impostate rispettivamente su 480 e 530 nanometri. Seme 200 microlitri di HBMEC, astrociti primari e HBVP al centro di piatti di vetro rivestiti di poli-D-lisina da 35 millimetri ad una densità di 150.000 cellule per piatto.Prima di seminare HBMEC, rivestire il fondo dei piatti con il fattore di attacco. Lasciare che le celle si attacchino alla superficie del vetro lasciandole durante la notte a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica. Una volta raggiunta la confluenza, scartare il terreno di coltura e aggiungere due millilitri di terreno privo di glucosio preriscaldato per la privazione di ossigeno-glucosio o mezzo normale per i controlli.Dopo il trattamento di privazione di ossigeno-glucosio, sostituire il mezzo con il mezzo ottimizzato per l'imaging in tutti i piatti, quindi eseguire l'imaging a fluorescenza con cellule vive con il filtro GFP e l'incubatore per microscopio confocale dello stadio superiore come descritto nel manoscritto testuale. L'integrità della barriera del monostrato endoteliale nelle configurazioni indicate del modello di barriera emato-encefalica è stata valutata determinando TEER prima e dopo la privazione di ossigeno-glucosio, nonché dopo 24 ore di riossigenazione. Per quattro ore la privazione di ossigeno-glucosio ha causato una significativa diminuzione dei valori di TEER solo nella monocoltura HBMEC e nel modello di co-coltura con HBMEC e HBVP.Questi livelli ridotti hanno raggiunto i livelli basali dopo 24 ore di riossigenazione. I valori TEER nel modello di tripla co-coltura erano significativamente più alti di quelli nei controlli di co-coltura doppia o nel controllo della monocoltura immediatamente dopo la privazione di ossigeno-glucosio. La permeabilità paracellulare dei monostrati endoteliali a 20 kilodalton di massa molecolare, FITC destrano, è risultata drasticamente aumentata nella monocoltura HBMEC e, in misura minore, nel modello di co-coltura con HBMEC e HBVP rispetto ai controlli normossici.Inoltre, i livelli di permeabilità del destrano FITC di 20 kilodalton erano i più bassi nel modello di tripla barriera cerebrale-sangue tra tutti i modelli in condizioni di privazione normossica e ossigeno-glucosio. Non sono stati osservati cambiamenti nel flusso di destrano di 70 kilodalton, FITC attraverso i monostrati endoteliali in nessuno dei modelli. Tutti i tipi umani primari esposti alla privazione di ossigeno-glucosio hanno mostrato una forte fluorescenza verde, dimostrando che le cellule vive riprodotte erano ipossiche.Dopo aver seminato i periciti vascolari del cervello umano sul lato abluminale degli inserti del pozzo, è molto importante coprirli con la piastra flip per prevenire l'evaporazione. Nel nostro modello utilizziamo un diametro relativamente piccolo, 0,4 micrometri, di inserti in pozzetti in poliestere che lo rendono adatto per lo screening di farmaci candidati a qualsiasi malattia che richieda l'attraversamento della barriera emato-encefalica per il trattamento. Questa tecnica offre un'eccellente opportunità per visualizzare la modifica delle proteine e dei trasportatori, se necessario.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

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Thermostabilization, Espressione, purificazione e cristallizzazione della umana trasportatore della serotonina associato a<em&gt; S</em&gt; -citalopram

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Ricerca

Biochimica

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Utilizzando impalcatura liposomi per ricostituire interazioni proteina-proteina lipidi-prossimale<em&gt; In Vitro</em

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Scambio risolta in tempo ionizzazione elettrospray idrogeno-deuterio Spettrometria di Massa per lo studio delle proteine ​​Struttura e dinamica

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