Name: a triple primary cell culture model of the human blood-brain barrier for studying ischemic stroke in vitro
Uploaded: 2022-10-06T14:05:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH) tilskudd MH128022, MH122235, MH072567, MH122235, HL126559, DA044579, DA039576, DA040537, DA050528 og DA047157.

MERK: Se materialtabellen for detaljer relatert til alle celler, materialer, utstyr og løsninger som brukes i denne protokollen.
1. Trippel cellekultur BBB-modellinnstilling
<ol><li>Såing pericytter<ol><li>Dyrk HBVP i T75 kulturflasker med en aktivert overflate for celleadhesjon innenfor en 5% CO2 inkubator ved 37 ° C til den er sammenflytende. Når sammenløp er nådd, aspirer det gamle pericyttmediet og vask cellene med 5 ml varm Dulbeccos fo...

<ol>
	<li>Mozaffarian, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+disease+and+stroke+statistics-2016+update:+a+report+from+the+American+Heart+Association.">Heart disease and stroke statistics-2016 update: a report from the American Heart Association.</a> Circulation. 133 (94), 38 (2016).</li><li>Yousufuddin, M., Young, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+and+ischemic+stroke.">Aging and ischemic stroke.</a> Aging. 11 (9), 2542-2544 (2019).</li><li>Donkor, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroke+in+the+21st+century:+a+snapshot+of+the+burden,+epidemiology,+and+quality+of+life.">Stroke in the 21st century: a snapshot of the burden, epidemiology, and quality of life.</a> Stroke Research and Treatment. , 3238165 (2018).</li><li>Kadry, H., Noorani, B., Cucullo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+blood-brain+barrier+overview+on+structure,+function,+impairment,+and+biomarkers+of+integrity.">A blood-brain barrier overview on structure, function, impairment, and biomarkers of integrity.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 17 (1), 69 (2020).</li><li>Brown, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+and+neurovascular+function+in+the+healthy+and+diseased+brain.">Pericytes and neurovascular function in the healthy and diseased brain.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 282 (2019).</li><li>Cabezas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+modulation+of+blood+brain+barrier:+perspectives+on+Parkinson's+disease.">Astrocytic modulation of blood brain barrier: perspectives on Parkinson's disease.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 211 (2014).</li><li>Abdullahi, W., Tripathi, D., Ronaldson, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+dysfunction+in+ischemic+stroke:+targeting+tight+junctions+and+transporters+for+vascular+protection.">Blood-brain barrier dysfunction in ischemic stroke: targeting tight junctions and transporters for vascular protection.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 315 (3), 343-356 (2018).</li><li>Candelario-Jalil, E., Dijkhuizen, R. M., Magnus, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammation,+stroke,+blood-brain+barrier+dysfunction,+and+imaging+modalities.">Neuroinflammation, stroke, blood-brain barrier dysfunction, and imaging modalities.</a> Stroke. 53 (5), 1473-1486 (2022).</li><li>He, Y., Yao, Y., Tsirka, S. E., Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-culture+models+of+the+blood-brain+barrier.">Cell-culture models of the blood-brain barrier.</a> Stroke. 45 (8), 2514-2526 (2014).</li><li>Thomsen, L. B., Burkhart, A., Moos, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+triple+culture+model+of+the+blood-brain+barrier+using+porcine+brain+endothelial+cells,+astrocytes+and+pericytes.">A triple culture model of the blood-brain barrier using porcine brain endothelial cells, astrocytes and pericytes.</a> PLoS One. 10 (8), 0134765 (2015).</li><li>Song, Y., Cai, X., Du, D., Dutta, P., Lin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+blood-brain+barrier+models+for+in+vitro+biological+analysis:+one+cell+type+vs+three+cell+types.">Comparison of blood-brain barrier models for in vitro biological analysis: one cell type vs three cell types.</a> ACS Applied Bio Materials. 2 (3), 1050-1055 (2019).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+nanoparticles+induce+tight+junction+disruption+and+astrocyte+neurotoxicity+in+a+rat+blood-brain+barrier+primary+triple+coculture+model.">Silver nanoparticles induce tight junction disruption and astrocyte neurotoxicity in a rat blood-brain barrier primary triple coculture model.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 6105-6118 (2015).</li><li>Appelt-Menzel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+human+blood-brain+barrier+co-culture+model+mimicking+the+neurovascular+unit+using+induced+pluri-+and+multipotent+stem+cells.">Establishment of a human blood-brain barrier co-culture model mimicking the neurovascular unit using induced pluri- and multipotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 894-906 (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+construction+of+a+reversible+arylazo-based+NIR+probe+for+cycling+hypoxia+imaging+in+vivo.">Rational construction of a reversible arylazo-based NIR probe for cycling hypoxia imaging in vivo.</a> Nature Communications. 12 (1), 2772 (2021).</li><li>Palacio-Casta&#241;eda, V., Kooijman, L., Venzac, B., Verdurmen, W. P. R., Le Gac, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+switching+of+tumor+cells+under+hypoxic+conditions+in+a+tumor-on-a-chip+model.">Metabolic switching of tumor cells under hypoxic conditions in a tumor-on-a-chip model.</a> Micromachines. 11 (4), 382 (2020).</li><li>Ramsauer, M., Krause, D., Dermietzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+of+the+blood-brain+barrier+in+vitro+and+the+function+of+cerebral+pericytes.">Angiogenesis of the blood-brain barrier in vitro and the function of cerebral pericytes.</a> FASEB Journal. 16 (10), 1274-1276 (2002).</li><li>Lyck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALCAM+(CD166)+is+involved+in+extravasation+of+monocytes+rather+than+T+cells+across+the+blood-brain+barrier.">ALCAM (CD166) is involved in extravasation of monocytes rather than T cells across the blood-brain barrier.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 37 (8), 2894-2909 (2017).</li><li>Rizzi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+triple+culture+cell+system+modeling+the+human+blood-brain+barrier.">A triple culture cell system modeling the human blood-brain barrier.</a> Journal of Visualized Experiments. (177), (2021).</li><li>Kumar, S., Shaw, L., Lawrence, C., Lea, R., Alder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P50:+Developing+a+physiologically+relevant+blood+brain+barrier+model+for+the+study+of+drug+disposition+in+glioma.">P50: Developing a physiologically relevant blood brain barrier model for the study of drug disposition in glioma.</a> Neuro-Oncology. 16 (6), (2014).</li><li>Stone, N. L., England, T. J., O'Sullivan, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+transwell+blood+brain+barrier+model+using+primary+human+cells.">A novel transwell blood brain barrier model using primary human cells.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 230 (2019).</li><li>Al Ahmad, A., Taboada, C. B., Gassmann, M., Ogunshola, O. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+and+pericytes+differentially+modulate+blood-brain+barrier+characteristics+during+development+and+hypoxic+insult.">Astrocytes and pericytes differentially modulate blood-brain barrier characteristics during development and hypoxic insult.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 31 (2), 693-705 (2011).</li></ol>

I denne protokollen beskriver vi en metode for å sette opp en pålitelig trippel endotelcelle-pericytt-astrocyttkultur BBB-modell for å studere BBB-dysfunksjon i innstillingen av iskemisk hjerneslag in vitro. Med tanke på at pericytter er de nærmeste naboene til endotelceller in vivo, er HBVP belagt på undersiden av brønninnsatsene i denne modellen16. Selv om denne konfigurasjonen mangler direkte celle-til-celle-kommunikasjon mellom astrocytter og endotelceller, tillater de...

Hjerneslag er en av de viktigste årsakene til død og langsiktig uførhet over hele verden1. Forekomsten av hjerneslag øker raskt med alderen, og dobles hvert 10. år etter fylte 55år. Iskemisk hjerneslag oppstår som følge av cerebral blodstrømforstyrrelse på grunn av trombotiske og emboliske hendelser, som omfatter mer enn 80% av alle slagtilfeller3. Selv nå er det relativt få behandlingsalternativer tilgjengelig for å minimere vevsdød etter iskemisk slag. Behandlingene som finnes er tidssensitive og fører følgelig ikke alltid til gode kliniske resultater. Derfor er det behov for forskning på komplekse cellulære mekanismer for iskemisk slag som påvirker poststroke-utvinning.
BBB er et dynamisk grensesnitt for utveksling av molekyler mellom blodet og hjernen parenchyma. Strukturelt består BBB av hjernemikrovaskulære endotelceller sammenkoblet av krysskomplekser omgitt av en kjellermembran, pericytter og astrocytiske endfeet4. Pericytter og astrocytter spiller en viktig rolle i opprettholdelsen av BBB-integritet gjennom sekresjon av ulike faktorer som er nødvendige for dannelsen av sterke, tette kryss 5,6. Fordelingen av BBB er et av kjennetegnene ved iskemisk slag. Akutt inflammatorisk respons og oksidativt stress assosiert med cerebral iskemi resulterer i forstyrrelse av tette kryssproteinkomplekser og dysregulert krysstale mellom astrocytter, pericytter og endotelceller, noe som fører til økt paracellulær løsemiddelpermeabilitet over BBB7. BBB-dysfunksjon fremmer videre dannelsen av hjerneødem og øker risikoen for hemorragisk transformasjon8. Tatt i betraktning alt ovenfor, er det stor interesse for å forstå de molekylære og cellulære endringene som oppstår på BBB-nivå under og etter iskemisk slag.
Selv om mange in vitro BBB-modeller har blitt utviklet de siste tiårene og brukt i en rekke studier, kan ingen av dem fullt ut replikere in vivo-forhold 9. Mens noen modeller er basert på endotelcellemonolag dyrket på godt innsatte permeable støtter alene eller i kombinasjon med pericytter eller astrocytter, har bare nyere studier introdusert trippelcellekulturmodelldesign. Nesten alle eksisterende trippelkultur BBB-modeller inkorporerer primære hjerneendotelceller sammen med astrocytter og pericytter isolert fra dyrearter eller celler avledet fra humane pluripotente stamceller10,11,12,13.
Ved å erkjenne behovet for å bedre rekapitulere den humane BBB in vitro, etablerte vi en trippelcellekultur in vitro BBB-modell sammensatt av humane hjernemikrovaskulære endotelceller (HBMEC), primære humane astrocytter (HA) og primære vaskulære pericytter i humanhjernen (HBVP). Denne trippelkulturen BBB-modellen er satt opp på 6-brønns plate, polyestermembraninnsatser med 0,4 μm porestørrelse. Disse brønninnsatsene gir et optimalt miljø for cellefeste og gir enkel tilgang til både apikale (blod) og basolaterale (hjerne) rom for middels prøvetaking eller sammensatt applikasjon. Funksjonene i denne foreslåtte trippelcellekultur BBB-modellen vurderes ved å måle TEER og paracellulær fluks etter OGD som etterligner iskemisk slag in vitro, med mangel på oksygen (<1% O2) og næringsstoffer (ved bruk av glukosefritt medium) oppnådd ved bruk av et fuktet, forseglet kammer. I tillegg er induserte iskemisklignende forhold i denne modellen nøyaktig verifisert ved direkte visualisering av hypoksiske celler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 mm Transwell with 0.4 &#181;m Pore Polyester Membrane Insert</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Glass Bottom Dishes</td>
			<td>MatTek Life Sciences (FISHERSCI)</td>
			<td>P35GC-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Astrocyte Medium</td>
			<td>Science Cell</td>
			<td>1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attachment Factor</td>
			<td>Cell Systems (Fisher Scientific)</td>
			<td>4Z0-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 60 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrainPhys Imaging Optimized Medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Classic Medium With Serum and CultureBoost</td>
			<td>4Z0-500</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes (Conical Bottom with CentriStar Cap</td>
			<td>VWR</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 75cm&#178; U-Shaped Canted Neck Not Treated Cell Culture Flask&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431464U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning CellBIND 96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countes Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ZGEXSCCOUNTESS2FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decon CiDehol 70 Isopropyl Alcohol Solution&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>04-355-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Petri Dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Medium (No glucose, No glutamine, No phenol red)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A14430-01</td>
			<td>Glucose-free medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (No Calcium, No Magnesium)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM Endothelial Cell Growth Basal Medium, Phenol Red Free, 500 mL</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM2 Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter with STX2 electrodes</td>
			<td>World Precison Instruments</td>
			<td>NC9792051</td>
			<td>Epithelial voltohmmeter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate&#8211;dextran (wt 20,000)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>FD20-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate&#8211;dextran (wt 70,000)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>FD70S-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorview FV3000 Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Tank (95% N2, 5% CO2)</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>X02NI95C2003071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (No calcium, No magnesium, no phenol red)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Astrocytes</td>
			<td>Science Cell</td>
			<td>1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Brain Vascular Pericytes</td>
			<td>Science Cell</td>
			<td>1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxia Incubator Chamber</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>27310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image-iT Green Hypoxia Reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>I14834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pericyte Medium</td>
			<td>Science Cell</td>
			<td>1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Human Brain Microvascular Endothelial Cells</td>
			<td>ACBRI 376</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking Platform Shaker, Double</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10860-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Flow Meter</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>27311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax iD3 Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>75886-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, 25 mm, 0.22 &#956;m, PVDF, Sterile</td>
			<td>NEST Scientific</td>
			<td>380121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP Mutli-well Plates (6 wells)</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>TP92406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP Tissue Culture Flasks T-75 Flasks</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>TP90075</td>
			<td>Flasks with activated surface for cell adhesion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Distilled Water</td>
			<td>Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td>10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uno Stage Top Incubator-</td>
			<td>Oko Lab</td>
			<td>UNO-T-H-CO2-TTL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a triple primary cell culture model of the human blood-brain barrier for studying ischemic stroke in vitro

Iskemisk hjerneslag er en viktig årsak til død og uførhet over hele verden med begrensede terapeutiske muligheter. Nevropatologien til iskemisk slag er preget av et avbrudd i blodtilførselen til hjernen som fører til celledød og kognitiv dysfunksjon. Under og etter iskemisk hjerneslag letter blod-hjernebarriere (BBB) dysfunksjon skadeprogresjon og bidrar til dårlig pasientgjenoppretting. Nåværende BBB-modeller inkluderer primært endotelmonokulturer og doble samkulturer med enten astrocytter eller pericytter.
Slike modeller mangler evnen til å etterligne et dynamisk hjernemikromiljø, noe som er avgjørende for celle-til-celle-kommunikasjon. I tillegg inneholder ofte brukte BBB-modeller ofte udødelige humane endotelceller eller dyreavledede (gnagere, svin eller storfe) cellekulturer som utgjør translasjonelle begrensninger. Dette papiret beskriver en ny brønninnsatsbasert BBB-modell som bare inneholder primære humane celler (hjernemikrovaskulære endotelceller, astrocytter og hjernevaskulære pericytter) som muliggjør undersøkelse av iskemisk hjerneskade in vitro. 
Effektene av oksygen-glukosemangel (OGD) på barriereintegritet ble vurdert ved passiv permeabilitet, transendotelial elektrisk motstand (TEER) målinger og direkte visualisering av hypoksiske celler. Den presenterte protokollen gir en klar fordel ved å etterligne det intercellulære miljøet til BBB in vivo, og fungerer som en mer realistisk in vitro BBB-modell for å utvikle nye terapeutiske strategier i innstillingen av iskemisk hjerneskade.

For å undersøke effekten av astrocytter og pericytter på barrierefunksjonen til HBMEC, konstruerte vi trippelcellekultur BBB-modellen på cellekulturinnsatser (figur 1A) sammen med HBMEC-monokultur og to doble kokulturmodeller som kontroller (figur 1B). Doble kokulturkontroller inkluderte en ikke-kontakt-samkultur av HBMEC med HA og kontakt-samkultur av HBMEC med HBVP. Etter 6 dager i kokultur ble alle eksperimentelle oppsett utsatt for OGD i 4 timer. Barrier...

Watch this Scientific Journal Video about A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro at JoVE.com

A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro

Her beskriver vi metoden for å etablere en trippelcellekulturmodell av blod-hjernebarrieren basert på primære humane hjernemikrovaskulære endotelceller, astrocytter og pericytter. Denne flercellede modellen er egnet for studier av dysfunksjon i nevrovaskulære enheter under iskemisk hjerneslag in vitro eller for screening av legemiddelkandidater.

En trippel primær cellekulturmodell av den menneskelige blod-hjernebarrieren for å studere iskemisk hjerneslag in vitro

Ischemic stroke is a major cause of death and disability worldwide with limited therapeutic options. The neuropathology of ischemic stroke is ...

Vår protokoll anerkjenner behovet for å bedre rekapitulere den humane blod-hjernebarrieren in vitro for studier av komplekse cellulære mekanismer som påvirker gjenoppretting etter slag. Vår trippelmodell viser robust integritet som delvis er relatert til stor oppdeling av brønninnsatser, slik at vi kan redusere endringsfrekvensen og unngå forstyrrelser av populasjoner. Vår modell er et flott verktøy for å studere molekylære og cellulære endringer som oppstår ved blod-hjernebarrieren under og etter iskemisk slag.Vår protokoll gjør det mulig å oppdage nye mål og terapier for å forbedre utvinningen etter slag. Nåværende behandlinger for iskemisk hjerneslag er tidsfølsomme og er følgelig ikke alltid effektive. Begynn med å dyrke HBVP i T75-kulturkolber med en aktivert overflate for celleadhesjon innenfor en 5% karbondioksidinkubator ved 37 grader Celsius til den er sammenflytende.Når samløpet er nådd, aspirer det gamle pericyttmediet og vask cellene med fem milliliter varm Dulbeccos PBS. Aspirer Dulbeccos PBS og løsne cellene fra kolben ved hjelp av en kombinasjon av fire milliliter varm trypsin EDTA-løsning og en milliliter Dulbeccos PBS. Inkuber kolben i fem minutter ved 37 grader Celsius i en karbondioksidinkubator.Se under et mikroskop for å bekrefte om cellene er løsrevet fra kolben. Tilsett fem milliliter varmt pericyttmedium som inneholder 2% FBS til kolben og overfør de frittliggende cellene til et 50 milliliter sentrifugerør. Sentrifuge cellesuspensjonen i tre minutter ved 200 g slik at cellene kan danne en pellet i bunnen av røret.Aspirer mediet fra røret slik at cellepelleten forblir intakt. Re-suspendere cellepelleten i pericyttmedium. Beregn mengden medium avhengig av sammenløpet av cellene og antall brønninnsatser som trengs.Ta 10 mikroliter av de re-suspenderte cellene, plasser dem i et celletellingslysbilde, og tell antall celler. Bestem celletetthet og frø 300.000 celler per innsats i en milliliter pericyttmedium på abluminalsiden av brønninnsatsene. Dyrk primære menneskelige astrocytter ved hjelp av astrocyttmediet som inneholder 2% FBS som beskrevet i tekstmanuskriptet.Bestem celletettheten og frøet 300.000 celler per brønn på bunnen av vevskulturen seksbrønnsplater. Dekk platen for å forhindre fordampning og inkuber over natten. På samme måte dyrker HBMEC i vevskulturretter ved å bruke komplett klassisk medium som inneholder 10% FBS som beskrevet i tekstmanuskriptet.Ta ut vevskulturen seksbrønnsplater som inneholder astrocytter og brønninnsatsene som inneholder pericytter fra inkubatoren. Aspirer astrocyttmediet fra vevskulturen seksbrønnsplater og tilsett en milliliter pericyttmedium og en milliliter astrocyttmedium til hver brønn. Aspirer pericyttmediet fra brønninnsatsene og plasser dem i vevskulturen seksbrønnsplater som inneholder de seedede astrocytter.Frø HBMEC med en tetthet på 300.000 celler per brønn i to milliliter komplett klassisk medium på den apikale siden av de samme brønninnsatsene. Vask cellene tre ganger med Dulbeccos PBS. For trippelcellekulturer utsatt for oksygen-glukosemangel, tilsett glukosefritt medium til både apikale og basolaterale rom.Erstatt kulturmediet med friske medium og normoksiske kontrollcellekulturer. Plasser kontroll trippelkulturer i 5% karbondioksidinkubatoren ved 37 grader Celsius. Plasser en petriskål som inneholder 20 ml sterilt vann i hypoksi-inkubatorkammeret for å gi tilstrekkelig fuktighet av kulturene.Åpne kammeret ved å slippe ringklemmen, og ordne deretter cellekulturene på hyllene. Forsegl kammeret ved å feste ringklemmen. Åpne innløps- og utløpsportene i kammeret og fest slangen fra toppen av kammerets strømningsmåler.Fest slangen fra bunnen av strømningsmåleren til bensintanken via et luftfilter. Åpne tankens strømningskontrollventil ved å vri den mot klokken for å tillate minimal gasstrøm. Åpne trykkregulatorventilen sakte ved å vri med klokken.Skyll kammeret med gassblandingen i fem minutter med en strømningshastighet på 20 liter per minutt. Koble kammeret fra gasskilden og lukk begge hvite plastklemmene godt. Slå av tankens strømningskontrollventil ved å vri med klokken.Lukk trykkregulatorventilen ved å vri mot klokken. Plasser hypoksikammeret i en konvensjonell inkubator satt til 37 grader Celsius i fire timer. Plasser det steriliserte TEER-instrumentet i biosikkerhetsskapet og koble elektrodene til epitelvolt ohm-måleren.Steriliser elektrodene i 30 milliliter 70% isopropylalkoholløsning i minst 30 minutter. Slå på TEER-instrumentet og sett funksjonen til ohm. Fjern elektrodene fra 70% isopropylalkoholløsningen og legg dem i 20 milliliter Dulbeccos PBS i minst 30 minutter til den digitale avlesningen på TEER-enheten leser null ohm.Sett den lange enden av elektroden gjennom en av de tre åpningene i brønninnsatshangaren til den tomme brønninnsatskontrollen senk den til den berører bunnen av brønnen. Forsikre deg om at den korte spissen hviler over den apikale kulturen på bunnen av brønninnsatsen. Vent til de digitale avlesningsverdiene på TEER-instrumentet flater ut før du registrerer verdien.Plasser elektrodene tilbake i Dulbeccos PBS for å vaske dem mellom målingene. Fortsett å samle alle TEER-målingene for ytterligere to blanke brønninnsatskontroller. Samle TEER-målingene av prøveplatene som vist tidligere.Når alle målingene er utført, går elektroden tilbake til 70 % isopropylalkoholoppløsningen i 30 minutter. Koble deretter elektrodene fra TEER-instrumentet og la dem lufttørke. Beregn TEER-verdiene.Aspirer mediet fra det basolaterale rommet og erstatt det med to milliliter fenolrødt fritt endotelcellevekstmedium i trippelcellekulturen blod-hjernebarrieremodell. Vask cellene i det apikale rommet to ganger med HBSS. Tilsett en milliliter av FITC dextran-løsningen i det apikale rommet og dekk platen med aluminiumsfolie, og plasser deretter platen i inkubatoren satt til 37 grader Celsius med 5% karbondioksid i en time.Ta 100 mikroliter medium fra de basolaterale rommene og overfør det til en svart 96-brønnplate. Mål fluorescensen ved hjelp av en mikroplateleser med eksitasjon og utslippsbølgelengder satt til henholdsvis 480 og 530 nanometer. Frø 200 mikroliter HBMEC, primære astrocytter og HBVP i midten av poly-D-lysinbelagte 35 millimeter glassbunnretter med en tetthet på 150.000 celler per tallerken.Før såing HBMEC, belegg bunnen av oppvasken med vedleggsfaktoren. La cellene feste seg til glassoverflaten ved å la dem stå over natten ved 37 grader Celsius i en karbondioksidinkubator. Når sammenløp er nådd, kast kulturmediet og tilsett to milliliter forvarmet glukosefritt medium for oksygen-glukosemangel eller normalt medium for kontroller.Etter oksygen-glukose deprivasjonsbehandling, erstatt mediet med bildeoptimalisert medium i alle retter, og utfør deretter fluorescens live-celleavbildning med GFP-filteret og topptrinns konfokalmikroskopinkubator som beskrevet i tekstmanuskriptet. Barriereintegriteten til endotelmonolaget i de angitte blod-hjernebarrieremodellkonfigurasjonene ble vurdert ved å bestemme TEER før og etter oksygen-glukosemangel, samt etter 24 timers reoksygenering. I fire timer forårsaket oksygenglukosedeprivasjonen en signifikant reduksjon i TEER-verdier bare i HBMEC-monokultur og samkulturmodellen med HBMEC og HBVP.Disse reduserte nivåene nådde utgangsnivåene etter 24 timers reoksygenering. TEER-verdiene i trippel-kokulturmodellen var signifikant høyere enn i dobbeltkulturkontrollene eller monokulturkontrollen umiddelbart etter oksygen-glukosemangel. Den paracellulære permeabiliteten av endotelmonolag til 20 kilodalton molekylmasse, FITC dextran, var drastisk økt i HBMEC-monokulturen og i mindre grad i samkulturmodellen med HBMEC og HBVP sammenlignet med normoksiske kontroller.Videre var 20 kilodalton FITC dextran permeabilitetsnivåer de laveste i trippel hjerne-blodbarrieremodellen blant alle modeller under normoksiske og oksygen-glukose deprivasjonsforhold. Ingen endringer ble observert i 70 kilodalton, FITC dextran fluks over endotelmonolag i noen av modellene. Alle primære menneskelige typer utsatt for oksygen-glukose deprivasjon viste sterk grønn fluorescens, noe som viste at de avbildede levende cellene var hypoksiske.Etter sådding av menneskelige hjerne vaskulære pericytter på abluminalsiden av brønninnsatser, er det svært viktig å dekke dem med flipplaten for å forhindre fordampning. I vår modell bruker vi en relativt liten, 0,4 mikrometer porediameter av polyesterbrønninnsatser, noe som gjør den egnet for screening av legemiddelkandidater til enhver sykdom som krever kryssing av blod-hjernebarrieren for behandling. Denne teknikken gir en utmerket mulighet til å visualisere modifisering av proteiner og transportører om nødvendig.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Rensing, og Krystallisering av Human Serotonin Transporter Bound til<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Bruke Stillas liposomer for å rekonstituere Lipid-proksimale Protein-protein interaksjoner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrospray-ionisering Hydrogen-deuterium Veksling massespektrometri for å studere Protein struktur og dynamikk

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Enkel manipulering av arkitekturer i Protein-basert Hydrogels for celle kultur programmer

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Kolorimetrisk metode for å måle jerninnhold i planter

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrering-fri In Vitro kvantifisering av Protein Homo-oligomerization med kommersielle instrumentering og gratis, åpen kildekode lysstyrke analyseprogramvare

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Studere RNA interaktører av Protein Kinase RNA-aktivert under pattedyr cellen syklus

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput

En strategi for å identifisere forbindelser som påvirker Cell vekst og overlevelse i kultivert pattedyrceller ved lav-til-moderat gjennomstrømming

Cytotoxicity is a critical parameter that needs to be quantified when studying drugs that may have therapeutic benefits. Because of this, many drug ...

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability DARTS assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

En semi-kvantitativ narkotika affinitet responsiv Target stabilitet (dart)-analysen for å studere Rapamycin/mTOR interaksjon

Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) is a robust method for detection of novel small molecule protein targets. It can be used to verify known ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Anvendelse av Biolayer laboratoriefasiliteter (BLI) for å studere protein-protein interaksjoner i transkripsjon

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...