Name: a triple primary cell culture model of the human blood-brain barrier for studying ischemic stroke in vitro
Uploaded: 2022-10-06T14:05:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения (NIH) MH128022, MH122235, MH072567, MH122235, HL126559, DA044579, DA039576, DA040537, DA050528 и DA047157.

ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для получения подробной информации , относящейся ко всем ячейкам, материалам, оборудованию и решениям, используемым в этом протоколе.
1. Настройка модели тройной клеточной культуры BBB
<ol><li>Посев перицитов<ol><li>Культиви?...

<ol>
	<li>Mozaffarian, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+disease+and+stroke+statistics-2016+update:+a+report+from+the+American+Heart+Association.">Heart disease and stroke statistics-2016 update: a report from the American Heart Association.</a> Circulation. 133 (94), 38 (2016).</li><li>Yousufuddin, M., Young, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+and+ischemic+stroke.">Aging and ischemic stroke.</a> Aging. 11 (9), 2542-2544 (2019).</li><li>Donkor, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroke+in+the+21st+century:+a+snapshot+of+the+burden,+epidemiology,+and+quality+of+life.">Stroke in the 21st century: a snapshot of the burden, epidemiology, and quality of life.</a> Stroke Research and Treatment. , 3238165 (2018).</li><li>Kadry, H., Noorani, B., Cucullo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+blood-brain+barrier+overview+on+structure,+function,+impairment,+and+biomarkers+of+integrity.">A blood-brain barrier overview on structure, function, impairment, and biomarkers of integrity.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 17 (1), 69 (2020).</li><li>Brown, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+and+neurovascular+function+in+the+healthy+and+diseased+brain.">Pericytes and neurovascular function in the healthy and diseased brain.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 282 (2019).</li><li>Cabezas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+modulation+of+blood+brain+barrier:+perspectives+on+Parkinson's+disease.">Astrocytic modulation of blood brain barrier: perspectives on Parkinson's disease.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 211 (2014).</li><li>Abdullahi, W., Tripathi, D., Ronaldson, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+dysfunction+in+ischemic+stroke:+targeting+tight+junctions+and+transporters+for+vascular+protection.">Blood-brain barrier dysfunction in ischemic stroke: targeting tight junctions and transporters for vascular protection.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 315 (3), 343-356 (2018).</li><li>Candelario-Jalil, E., Dijkhuizen, R. M., Magnus, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammation,+stroke,+blood-brain+barrier+dysfunction,+and+imaging+modalities.">Neuroinflammation, stroke, blood-brain barrier dysfunction, and imaging modalities.</a> Stroke. 53 (5), 1473-1486 (2022).</li><li>He, Y., Yao, Y., Tsirka, S. E., Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-culture+models+of+the+blood-brain+barrier.">Cell-culture models of the blood-brain barrier.</a> Stroke. 45 (8), 2514-2526 (2014).</li><li>Thomsen, L. B., Burkhart, A., Moos, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+triple+culture+model+of+the+blood-brain+barrier+using+porcine+brain+endothelial+cells,+astrocytes+and+pericytes.">A triple culture model of the blood-brain barrier using porcine brain endothelial cells, astrocytes and pericytes.</a> PLoS One. 10 (8), 0134765 (2015).</li><li>Song, Y., Cai, X., Du, D., Dutta, P., Lin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+blood-brain+barrier+models+for+in+vitro+biological+analysis:+one+cell+type+vs+three+cell+types.">Comparison of blood-brain barrier models for in vitro biological analysis: one cell type vs three cell types.</a> ACS Applied Bio Materials. 2 (3), 1050-1055 (2019).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+nanoparticles+induce+tight+junction+disruption+and+astrocyte+neurotoxicity+in+a+rat+blood-brain+barrier+primary+triple+coculture+model.">Silver nanoparticles induce tight junction disruption and astrocyte neurotoxicity in a rat blood-brain barrier primary triple coculture model.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 6105-6118 (2015).</li><li>Appelt-Menzel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+human+blood-brain+barrier+co-culture+model+mimicking+the+neurovascular+unit+using+induced+pluri-+and+multipotent+stem+cells.">Establishment of a human blood-brain barrier co-culture model mimicking the neurovascular unit using induced pluri- and multipotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 894-906 (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+construction+of+a+reversible+arylazo-based+NIR+probe+for+cycling+hypoxia+imaging+in+vivo.">Rational construction of a reversible arylazo-based NIR probe for cycling hypoxia imaging in vivo.</a> Nature Communications. 12 (1), 2772 (2021).</li><li>Palacio-Casta&#241;eda, V., Kooijman, L., Venzac, B., Verdurmen, W. P. R., Le Gac, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+switching+of+tumor+cells+under+hypoxic+conditions+in+a+tumor-on-a-chip+model.">Metabolic switching of tumor cells under hypoxic conditions in a tumor-on-a-chip model.</a> Micromachines. 11 (4), 382 (2020).</li><li>Ramsauer, M., Krause, D., Dermietzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+of+the+blood-brain+barrier+in+vitro+and+the+function+of+cerebral+pericytes.">Angiogenesis of the blood-brain barrier in vitro and the function of cerebral pericytes.</a> FASEB Journal. 16 (10), 1274-1276 (2002).</li><li>Lyck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALCAM+(CD166)+is+involved+in+extravasation+of+monocytes+rather+than+T+cells+across+the+blood-brain+barrier.">ALCAM (CD166) is involved in extravasation of monocytes rather than T cells across the blood-brain barrier.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 37 (8), 2894-2909 (2017).</li><li>Rizzi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+triple+culture+cell+system+modeling+the+human+blood-brain+barrier.">A triple culture cell system modeling the human blood-brain barrier.</a> Journal of Visualized Experiments. (177), (2021).</li><li>Kumar, S., Shaw, L., Lawrence, C., Lea, R., Alder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P50:+Developing+a+physiologically+relevant+blood+brain+barrier+model+for+the+study+of+drug+disposition+in+glioma.">P50: Developing a physiologically relevant blood brain barrier model for the study of drug disposition in glioma.</a> Neuro-Oncology. 16 (6), (2014).</li><li>Stone, N. L., England, T. J., O'Sullivan, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+transwell+blood+brain+barrier+model+using+primary+human+cells.">A novel transwell blood brain barrier model using primary human cells.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 230 (2019).</li><li>Al Ahmad, A., Taboada, C. B., Gassmann, M., Ogunshola, O. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+and+pericytes+differentially+modulate+blood-brain+barrier+characteristics+during+development+and+hypoxic+insult.">Astrocytes and pericytes differentially modulate blood-brain barrier characteristics during development and hypoxic insult.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 31 (2), 693-705 (2011).</li></ol>

В этом протоколе описан метод создания надежной тройной эндотелиальной клеточно-перицит-астроцитарной культуры модели ГЭБ для изучения дисфункции ГЭБ в условиях ишемического инсульта in vitro. Учитывая, что перициты являются ближайшими соседями эндотелиальных клеток in vivo, HBVP п...

Инсульт является одной из ведущих причин смерти и длительной инвалидности во всем мире1. Частота инсульта быстро увеличивается с возрастом, удваиваясь каждые 10 лет после 55лет 2 года. Ишемический инсульт возникает в результате нарушения мозгового кровотока вследствие тромботических и эмболических событий, которое охватывает более 80% всех случаев инсульта3. Даже в настоящее время существует относительно мало вариантов лечения, доступных для минимизации гибели тканей после ишемического инсульта. Существующие методы лечения чувствительны ко времени и, следовательно, не всегда приводят к хорошим клиническим результатам. Поэтому срочно необходимы исследования сложных клеточных механизмов ишемического инсульта, влияющих на постинсультное восстановление.
ГЭБ является динамическим интерфейсом для обмена молекулами между кровью и паренхимой мозга. Структурно ГЭБ состоит из микрососудистых эндотелиальных клеток мозга, соединенных между собой соединительными комплексами, окруженными базальной мембраной, перицитами и астроцитарным концом4. Перициты и астроциты играют существенную роль в поддержании целостности ГЭБ за счет секреции различных факторов, необходимых для образования сильных, плотных соединений 5,6. Распад ГЭБ является одной из отличительных черт ишемического инсульта. Острая воспалительная реакция и окислительный стресс, связанные с ишемией головного мозга, приводят к нарушению белковых комплексов плотного соединения и дисрегулируемых перекрестных помех между астроцитами, перицитами и эндотелиальными клетками, что приводит к увеличению параклеточной проницаемости растворенного вещества через ГЭБ7. Дисфункция ГЭБ дополнительно способствует образованию отека мозга и увеличивает риск геморрагической трансформации8. Учитывая все вышесказанное, существует большой интерес к пониманию молекулярных и клеточных изменений, которые происходят на уровне ГЭБ во время и после ишемического инсульта.
Хотя многие модели BBB in vitro были разработаны в течение последних десятилетий и использовались в различных исследованиях, ни одна из них не может полностью воспроизвести условия in vivo 9. В то время как некоторые модели основаны на монослоях эндотелиальных клеток, культивируемых на хорошо вставленных проницаемых опорах отдельно или в сочетании с перицитами или астроцитами, только более поздние исследования представили модели тройной клеточной культуры. Почти все существующие модели тройной культуры ГЭБ включают первичные эндотелиальные клетки мозга вместе с астроцитами и перицитами, выделенными из видов животных, или клетками, полученными из плюрипотентных стволовых клеток человека 10,11,12,13.
Признавая необходимость лучшего повторения человеческого ГЭБ in vitro, мы создали модель тройной клеточной культуры in vitro BBB, состоящую из микрососудистых эндотелиальных клеток головного мозга человека (HBMEC), первичных астроцитов человека (HA) и первичных сосудистых перицитов головного мозга человека (HBVP). Эта модель BBB с тройной культурой устанавливается на 6-луночную пластину, полиэфирные мембранные вставки с размером пор 0,4 мкм. Эти колодезные вставки обеспечивают оптимальную среду для прикрепления клеток и обеспечивают легкий доступ как к апикальным (кровь), так и к базолатеральным (мозг) отсекам для отбора проб среды или применения соединений. Особенности этой предложенной модели тройной клеточной культуры BBB оцениваются путем измерения TEER и параклеточного потока после OGD, имитирующего ишемический инсульт in vitro, с дефицитом кислорода (<1%O2) и питательных веществ (с использованием безглюсодержащей среды), достигаемой с использованием увлажненной, герметичной камеры. Кроме того, индуцированные ишемоподобные состояния в этой модели точно проверяются путем прямой визуализации гипоксических клеток.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 mm Transwell with 0.4 &#181;m Pore Polyester Membrane Insert</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Glass Bottom Dishes</td>
			<td>MatTek Life Sciences (FISHERSCI)</td>
			<td>P35GC-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Astrocyte Medium</td>
			<td>Science Cell</td>
			<td>1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attachment Factor</td>
			<td>Cell Systems (Fisher Scientific)</td>
			<td>4Z0-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 60 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrainPhys Imaging Optimized Medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Classic Medium With Serum and CultureBoost</td>
			<td>4Z0-500</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes (Conical Bottom with CentriStar Cap</td>
			<td>VWR</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 75cm&#178; U-Shaped Canted Neck Not Treated Cell Culture Flask&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431464U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning CellBIND 96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countes Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ZGEXSCCOUNTESS2FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decon CiDehol 70 Isopropyl Alcohol Solution&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>04-355-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Petri Dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Medium (No glucose, No glutamine, No phenol red)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A14430-01</td>
			<td>Glucose-free medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (No Calcium, No Magnesium)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM Endothelial Cell Growth Basal Medium, Phenol Red Free, 500 mL</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM2 Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter with STX2 electrodes</td>
			<td>World Precison Instruments</td>
			<td>NC9792051</td>
			<td>Epithelial voltohmmeter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate&#8211;dextran (wt 20,000)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>FD20-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate&#8211;dextran (wt 70,000)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>FD70S-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorview FV3000 Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Tank (95% N2, 5% CO2)</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>X02NI95C2003071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (No calcium, No magnesium, no phenol red)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Astrocytes</td>
			<td>Science Cell</td>
			<td>1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Brain Vascular Pericytes</td>
			<td>Science Cell</td>
			<td>1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxia Incubator Chamber</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>27310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image-iT Green Hypoxia Reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>I14834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pericyte Medium</td>
			<td>Science Cell</td>
			<td>1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Human Brain Microvascular Endothelial Cells</td>
			<td>ACBRI 376</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking Platform Shaker, Double</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10860-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Flow Meter</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>27311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax iD3 Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>75886-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, 25 mm, 0.22 &#956;m, PVDF, Sterile</td>
			<td>NEST Scientific</td>
			<td>380121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP Mutli-well Plates (6 wells)</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>TP92406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP Tissue Culture Flasks T-75 Flasks</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>TP90075</td>
			<td>Flasks with activated surface for cell adhesion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Distilled Water</td>
			<td>Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td>10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uno Stage Top Incubator-</td>
			<td>Oko Lab</td>
			<td>UNO-T-H-CO2-TTL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a triple primary cell culture model of the human blood-brain barrier for studying ischemic stroke in vitro

Ишемический инсульт является основной причиной смерти и инвалидности во всем мире с ограниченными терапевтическими возможностями. Невропатология ишемического инсульта характеризуется прерыванием кровоснабжения головного мозга, приводящим к гибели клеток и когнитивной дисфункции. Во время и после ишемического инсульта дисфункция гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) способствует прогрессированию травмы и способствует плохому восстановлению пациента. Современные модели ГЭБ в основном включают эндотелиальные монокультуры и двойные кокультуры с астроцитами или перицитами.
Таким моделям не хватает способности полностью имитировать динамическую микросреду мозга, которая необходима для межклеточной коммуникации. Кроме того, обычно используемые модели ГЭБ часто содержат увековеченные эндотелиальные клетки человека или клеточные культуры животного происхождения (грызуны, свиньи или крупного рогатого скота), которые создают трансляционные ограничения. В этой статье описывается новая модель ГЭБ, содержащая только первичные клетки человека (микрососудистые эндотелиальные клетки мозга, астроциты и перициты сосудов головного мозга), позволяющая исследовать ишемическую черепно-мозговую травму in vitro. 
Влияние кислородно-глюкозной депривации (OGD) на целостность барьера оценивали с помощью измерений пассивной проницаемости, трансэндотелиального электрического сопротивления (TEER) и прямой визуализации гипоксических клеток. Представленный протокол предлагает явное преимущество в проникновении межклеточной среды ГЭБ in vivo, служа более реалистичной моделью BBB in vitro для разработки новых терапевтических стратегий в условиях ишемической черепно-мозговой травмы.

Чтобы изучить влияние астроцитов и перицитов на барьерную функцию HBMEC, мы построили модель тройной клеточной культуры BBB на вставках клеточной культуры (рисунок 1A) вместе с монокультурой HBMEC и двумя моделями двойной кокультуры в качестве контроля (рисунок 1B</st...

Watch this Scientific Journal Video about A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro at JoVE.com

A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro

Здесь описан метод создания модели тройной клеточной культуры гематоэнцефалического барьера на основе первичных микрососудистых эндотелиальных клеток головного мозга человека, астроцитов и перицитов. Эта многоклеточная модель подходит для исследований дисфункции нервно-сосудистых единиц во время ишемического инсульта in vitro или для скрининга кандидатов на лекарства.

Модель тройной культуры первичных клеток гематоэнцефалического барьера человека для изучения ишемического инсульта in vitro

Ischemic stroke is a major cause of death and disability worldwide with limited therapeutic options. The neuropathology of ischemic stroke is ...

Наш протокол признает необходимость лучшего повторения гематоэнцефалического барьера человека in vitro для изучения сложных клеточных механизмов, которые влияют на восстановление после инсульта. Наша тройная модель демонстрирует надежную целостность, которая частично связана с большим разделением скважин, что позволяет нам уменьшить частоту изменений и избежать разрушения популяций. Наша модель является отличным инструментом для изучения молекулярных и клеточных изменений, которые происходят на гематоэнцефалическом барьере во время и после ишемического инсульта.Наш протокол позволяет открывать новые мишени и терапевтические средства для улучшения восстановления после инсульта. Современные методы лечения ишемического инсульта чувствительны ко времени и, следовательно, не всегда эффективны. Начните с культивирования HBVP в колбах для культивирования T75 с активированной поверхностью для адгезии клеток в инкубаторе диоксида углерода 5% при температуре 37 градусов Цельсия до слияния.Как только слияние будет достигнуто, аспирируйте старую перицитную среду и промойте клетки пятью миллилитрами теплого PBS Дульбекко. Аспирируйте PBS Дульбекко и отделяйте клетки от колбы, используя комбинацию из четырех миллилитров теплого раствора трипсина ЭДТА и одного миллилитра PBS Дульбекко. Инкубируйте колбу в течение пяти минут при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе углекислого газа.Посмотрите под микроскопом, чтобы убедиться, что клетки отделены от колбы. Добавьте в колбу пять миллилитров теплой перицитной среды, содержащей 2% FBS, и переложите отсоединенные ячейки в 50-миллилитровую центрифужную трубку. Центрифугируйте клеточную суспензию в течение трех минут по 200 г, позволяя клеткам образовывать гранулу в нижней части трубки.Аспирируйте среду из трубки, гарантируя, что гранула ячейки останется неповрежденной. Повторно суспендировать клеточную гранулу в перицитной среде. Рассчитайте количество среды в зависимости от слияния ячеек и количества необходимых луночных вставок.Возьмите 10 микролитров повторно взвешенных клеток, поместите их в слайд подсчета клеток и подсчитайте количество клеток. Определяют плотность клеток и семени 300 000 клеток на вставку в одном миллилитре перицитной среды на аблюминальной стороне колодезных вкладышей. Культивируют первичные астроциты человека, используя астроцитарную среду, содержащую 2% FBS, как описано в рукописи текста.Определяют плотность клеток и выселяют 300 000 клеток на лунку на дно ткани культуры шестилуночными пластинами. Накройте пластину, чтобы предотвратить испарение, и инкубируйте в течение ночи. Аналогичным образом, культивируют HBMEC в блюдах для культивирования тканей, используя полную классическую среду, содержащую 10% FBS, как описано в текстовой рукописи.Извлеките из инкубатора тканевую культуру шестилуночными пластинками, содержащими астроциты, и луночными вставками, содержащими перициты. Аспирировать астроцитарную среду из тканевой культуры шестилуночными пластинками и добавить в каждую лунку по одному миллилитру перицитной среды и по одному миллилитру астроцитарной среды. Аспирируйте перицитную среду из луночных вставок и поместите их в тканевую культуру шестилуночных пластинок, содержащих засеянные астроциты.Посейте HBMEC при плотности 300 000 клеток на лунку в двух миллилитрах полной классической среды на апикальную сторону тех же луночных вставок. Трижды вымойте клетки PBS от Dulbecco. Для трехклеточных культур, подвергшихся кислородно-глюкозному депривации, добавляют бесглюковую среду как к апикальному, так и к базолатеральному компартментам.Заменить питательную среду свежей средой и нормоксическими контрольными клеточными культурами. Поместите контрольные тройные культуры в инкубатор 5% углекислого газа при температуре 37 градусов Цельсия. Поместите чашку Петри, содержащую 20 миллилитров стерильной воды, в камеру инкубатора гипоксии, чтобы обеспечить адекватное увлажнение культур.Откройте камеру, отпустив кольцевой зажим, затем расположите клеточные культуры на полках. Запечатайте камеру, закрепив кольцевой зажим. Откройте входное и выходное отверстия камеры и прикрепите трубку с верхней части расходомера камеры.Прикрепите трубку от нижней части расходомера к бензобаку с помощью воздушного фильтра. Откройте клапан управления потоком резервуара, повернув его против часовой стрелки, чтобы обеспечить минимальный поток газа. Медленно откройте клапан регулятора давления, повернув по часовой стрелке.Промывайте камеру газовой смесью в течение пяти минут со скоростью потока 20 литров в минуту. Отсоедините камеру от источника газа и плотно закройте оба белых пластиковых зажима. Выключите клапан управления потоком резервуара, повернув его по часовой стрелке.Закройте клапан регулятора давления, повернув против часовой стрелки. Поместите камеру гипоксии в обычный инкубатор, установленный при 37 градусах Цельсия в течение четырех часов. Поместите стерилизованный инструмент TEER в шкаф биобезопасности и подключите электроды к эпителиальному вольтомометру.Стерилизуйте электроды в 30 миллилитрах 70% раствора изопропилового спирта в течение минимум 30 минут. Включите прибор TEER и установите для функции значение Ом. Извлеките электроды из 70% раствора изопропилового спирта и поместите их в 20 миллилитров PBS Dulbecco в течение как минимум 30 минут, пока цифровое считывание на устройстве TEER не считывает ноль Ом.Вставьте длинный зубец электрода через одно из трех отверстий в колодце вставки ангара заготовки скважины, опуская ее до тех пор, пока она не коснется дна скважины. Убедитесь, что короткий зубец покоится над верхушечной культурой на нижней части колодезной вставки. Подождите, пока значения цифрового считывания на приборе TEER выровняются, прежде чем записывать значение.Поместите электроды обратно в PBS Dulbecco, чтобы промыть их между измерениями. Продолжайте собирать все измерения TEER для еще двух элементов управления вставками пустой скважины. Соберите измерения TEER на образцах пластин, как показано ранее.После того, как все измерения были проведены, электрод возвращается в 70% раствор изопропилового спирта в течение 30 минут. Затем отсоедините электроды от прибора TEER и дайте им высохнуть на воздухе. Рассчитайте значения TEER.Аспирировать среду из базолатерального компартмента и заменить ее двумя миллилитрами фенольной красной свободной среды роста эндотелиальных клеток в модели гематоэнцефалического барьера тройной клеточной культуры. Дважды промыть ячейки в апикальном отсеке с помощью HBSS. Добавьте один миллилитр раствора декстрана FITC в апикальный отсек и накройте пластину алюминиевой фольгой, затем поместите пластину в инкубатор, установленный при 37 градусах Цельсия с 5% углекислым газом в течение одного часа.Возьмите 100 микролитров среды из базолатеральных отсеков и переложите ее в черную 96-луночную пластину. Измерьте флуоресценцию с помощью считывателя микропластин с длинами волн возбуждения и излучения, установленными на 480 и 530 нанометров соответственно. Семена 200 микролитров HBMEC, первичных астроцитов и HBVP в центре поли-D-лизина покрыты 35-миллиметровой стеклянной нижней посуды при плотности 150 000 клеток на блюдо.Перед посевом HBMEC покройте дно посуды фактором крепления. Позвольте клеткам прикрепиться к стеклянной поверхности, оставив их на ночь при 37 градусах Цельсия в инкубаторе углекислого газа. Как только слияние будет достигнуто, отбросьте культуральную среду и добавьте два миллилитра предварительно нагретой среды без глюкозы для кислородно-глюкозного голодания или нормальной среды для контрольной группы.После кислородно-глюкозной депривации замените среду оптимизированной для визуализации средой во всех чашках, затем выполните флуоресцентную визуализацию живых клеток с помощью фильтра GFP и инкубатора конфокального микроскопа верхней ступени, как описано в текстовой рукописи. Барьерную целостность эндотелиального монослоя в указанных конфигурациях модели гематоэнцефалического барьера оценивали путем определения TEER до и после кислородно-глюкозной депривации, а также после 24 часов реоксигенации. В течение четырех часов кислородно-глюкозная депривация вызывала значительное снижение значений TEER только в монокультуре HBMEC и модели кокультуры с HBMEC и HBVP.Эти сниженные уровни достигли исходных уровней после 24 часов повторной оксигенации. Значения TEER в модели тройной кокультуры были значительно выше, чем в контроле двойной кокультуры или контроле монокультуры сразу после кислородно-глюкозного депривации. Параклеточная проницаемость эндотелиальных монослоев до 20 килодалтонной молекулярной массы, декстрана FITC, была резко увеличена в монокультуре HBMEC и в меньшей степени в модели кокультуры с HBMEC и HBVP по сравнению с нормоксическим контролем.Кроме того, уровни проницаемости декстрана FITC в 20 килодалтонов были самыми низкими в модели тройного мозгового барьера среди всех моделей в условиях нормоксической и кислородно-глюкозной депривации. Ни в одной из моделей не наблюдалось никаких изменений в потоке декстрана FITC через эндотелиальные монослои. Все первичные типы людей, подвергшиеся кислородно-глюкозной депривации, демонстрировали сильную зеленую флуоресценцию, доказывая, что изображенные живые клетки были гипоксическими.После посева сосудистых перицитов головного мозга человека на аблюминальную сторону колодезных вкладышей очень важно накрыть их откидной пластиной, чтобы предотвратить испарение. В нашей модели мы используем относительно небольшой диаметр пор 0,4 микрометра полиэфирных луночных вставок, что делает его пригодным для скрининга кандидатов на лекарства при любом заболевании, которое требует пересечения гематоэнцефалического барьера для лечения. Эта методика дает прекрасную возможность визуализировать модификацию белков и транспортеров при необходимости.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Термостабилизации, Expression, очистки и кристаллизации Серотонин Transporter человека Обязанный<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Используя строительные леса, липосом Развести липидами проксимальный белок-белковых взаимодействий<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Времяразрешенная ионизацией электрораспылением водорода дейтерий Обмен масс-спектрометрии для изучения белка структуры и динамики

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Простое управление архитектуры в гидрогели на основе белков для приложений культуры клеток

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Колориметрический метод измерения содержания железа в растениях

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Калибровка бесплатно в Vitro количественная оценка белка гомо олигомеризации с использованием коммерческих приборов и свободным, открытым исходным кодом программное обеспечение для анализа яркости

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Изучая РНК посредники РНК активирована во время цикла Mammalian клетки киназы протеина

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput

Стратегия по выявлению соединений, влияющих на рост клеток и выживаемость в культурных клетках млекопитающих при низкой до умеренной пропускной связи

Cytotoxicity is a critical parameter that needs to be quantified when studying drugs that may have therapeutic benefits. Because of this, many drug ...

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability DARTS assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

Полуколичественный препарат affinity Ответственный Целевой стабильности (DARTS) спросить для изучения Rapamycin / mTOR взаимодействия

Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) is a robust method for detection of novel small molecule protein targets. It can be used to verify known ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Применение биослойной интерферометрии (BLI) для изучения белково-белковых взаимодействий в транскрипции

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...