Name: a triple primary cell culture model of the human blood-brain barrier for studying ischemic stroke in vitro
Uploaded: 2022-10-06T14:05:00
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Este trabajo fue apoyado por las subvenciones MH128022, MH122235, MH072567, MH122235, HL126559, DA044579, DA039576, DA040537, DA050528 y DA047157.

NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todas las células, materiales, equipos y soluciones utilizados en este protocolo.
1. Ajuste del modelo BBB de cultivo celular triple
<ol><li>Siembra de pericitos<ol><li>Cultivar HBVP en matraces de cultivo T75 con una superficie activada para la adhesión celular dentro de una incubadora deCO2 al 5% a 37 °C hasta que sea confluente. Una vez alcanzada la confluencia, asp...

<ol>
	<li>Mozaffarian, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+disease+and+stroke+statistics-2016+update:+a+report+from+the+American+Heart+Association.">Heart disease and stroke statistics-2016 update: a report from the American Heart Association.</a> Circulation. 133 (94), 38 (2016).</li><li>Yousufuddin, M., Young, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+and+ischemic+stroke.">Aging and ischemic stroke.</a> Aging. 11 (9), 2542-2544 (2019).</li><li>Donkor, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroke+in+the+21st+century:+a+snapshot+of+the+burden,+epidemiology,+and+quality+of+life.">Stroke in the 21st century: a snapshot of the burden, epidemiology, and quality of life.</a> Stroke Research and Treatment. , 3238165 (2018).</li><li>Kadry, H., Noorani, B., Cucullo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+blood-brain+barrier+overview+on+structure,+function,+impairment,+and+biomarkers+of+integrity.">A blood-brain barrier overview on structure, function, impairment, and biomarkers of integrity.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 17 (1), 69 (2020).</li><li>Brown, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+and+neurovascular+function+in+the+healthy+and+diseased+brain.">Pericytes and neurovascular function in the healthy and diseased brain.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 282 (2019).</li><li>Cabezas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+modulation+of+blood+brain+barrier:+perspectives+on+Parkinson's+disease.">Astrocytic modulation of blood brain barrier: perspectives on Parkinson's disease.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 211 (2014).</li><li>Abdullahi, W., Tripathi, D., Ronaldson, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+dysfunction+in+ischemic+stroke:+targeting+tight+junctions+and+transporters+for+vascular+protection.">Blood-brain barrier dysfunction in ischemic stroke: targeting tight junctions and transporters for vascular protection.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 315 (3), 343-356 (2018).</li><li>Candelario-Jalil, E., Dijkhuizen, R. M., Magnus, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammation,+stroke,+blood-brain+barrier+dysfunction,+and+imaging+modalities.">Neuroinflammation, stroke, blood-brain barrier dysfunction, and imaging modalities.</a> Stroke. 53 (5), 1473-1486 (2022).</li><li>He, Y., Yao, Y., Tsirka, S. E., Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-culture+models+of+the+blood-brain+barrier.">Cell-culture models of the blood-brain barrier.</a> Stroke. 45 (8), 2514-2526 (2014).</li><li>Thomsen, L. B., Burkhart, A., Moos, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+triple+culture+model+of+the+blood-brain+barrier+using+porcine+brain+endothelial+cells,+astrocytes+and+pericytes.">A triple culture model of the blood-brain barrier using porcine brain endothelial cells, astrocytes and pericytes.</a> PLoS One. 10 (8), 0134765 (2015).</li><li>Song, Y., Cai, X., Du, D., Dutta, P., Lin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+blood-brain+barrier+models+for+in+vitro+biological+analysis:+one+cell+type+vs+three+cell+types.">Comparison of blood-brain barrier models for in vitro biological analysis: one cell type vs three cell types.</a> ACS Applied Bio Materials. 2 (3), 1050-1055 (2019).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+nanoparticles+induce+tight+junction+disruption+and+astrocyte+neurotoxicity+in+a+rat+blood-brain+barrier+primary+triple+coculture+model.">Silver nanoparticles induce tight junction disruption and astrocyte neurotoxicity in a rat blood-brain barrier primary triple coculture model.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 6105-6118 (2015).</li><li>Appelt-Menzel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+human+blood-brain+barrier+co-culture+model+mimicking+the+neurovascular+unit+using+induced+pluri-+and+multipotent+stem+cells.">Establishment of a human blood-brain barrier co-culture model mimicking the neurovascular unit using induced pluri- and multipotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 894-906 (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+construction+of+a+reversible+arylazo-based+NIR+probe+for+cycling+hypoxia+imaging+in+vivo.">Rational construction of a reversible arylazo-based NIR probe for cycling hypoxia imaging in vivo.</a> Nature Communications. 12 (1), 2772 (2021).</li><li>Palacio-Casta&#241;eda, V., Kooijman, L., Venzac, B., Verdurmen, W. P. R., Le Gac, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+switching+of+tumor+cells+under+hypoxic+conditions+in+a+tumor-on-a-chip+model.">Metabolic switching of tumor cells under hypoxic conditions in a tumor-on-a-chip model.</a> Micromachines. 11 (4), 382 (2020).</li><li>Ramsauer, M., Krause, D., Dermietzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+of+the+blood-brain+barrier+in+vitro+and+the+function+of+cerebral+pericytes.">Angiogenesis of the blood-brain barrier in vitro and the function of cerebral pericytes.</a> FASEB Journal. 16 (10), 1274-1276 (2002).</li><li>Lyck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALCAM+(CD166)+is+involved+in+extravasation+of+monocytes+rather+than+T+cells+across+the+blood-brain+barrier.">ALCAM (CD166) is involved in extravasation of monocytes rather than T cells across the blood-brain barrier.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 37 (8), 2894-2909 (2017).</li><li>Rizzi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+triple+culture+cell+system+modeling+the+human+blood-brain+barrier.">A triple culture cell system modeling the human blood-brain barrier.</a> Journal of Visualized Experiments. (177), (2021).</li><li>Kumar, S., Shaw, L., Lawrence, C., Lea, R., Alder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P50:+Developing+a+physiologically+relevant+blood+brain+barrier+model+for+the+study+of+drug+disposition+in+glioma.">P50: Developing a physiologically relevant blood brain barrier model for the study of drug disposition in glioma.</a> Neuro-Oncology. 16 (6), (2014).</li><li>Stone, N. L., England, T. J., O'Sullivan, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+transwell+blood+brain+barrier+model+using+primary+human+cells.">A novel transwell blood brain barrier model using primary human cells.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 230 (2019).</li><li>Al Ahmad, A., Taboada, C. B., Gassmann, M., Ogunshola, O. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+and+pericytes+differentially+modulate+blood-brain+barrier+characteristics+during+development+and+hypoxic+insult.">Astrocytes and pericytes differentially modulate blood-brain barrier characteristics during development and hypoxic insult.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 31 (2), 693-705 (2011).</li></ol>

En este protocolo, describimos un método para establecer un modelo fiable de cultivo de BBB triple de células endoteliales-pericito-astrocitos para estudiar la disfunción de la BHE en el contexto de un accidente cerebrovascular isquémico in vitro. Teniendo en cuenta que los pericitos son los vecinos más cercanos de las células endoteliales in vivo, el HBVP está plateado en la parte inferior de los insertos de pocillos en este modelo16. Aunque esta configuración carece de ...

El accidente cerebrovascular es una de las principales causas de muerte y discapacidad a largo plazo en todo el mundo1. La incidencia de accidente cerebrovascular aumenta rápidamente con la edad, duplicándose cada 10 años después de los 55 años2. El accidente cerebrovascular isquémico ocurre como resultado de la interrupción del flujo sanguíneo cerebral debido a eventos trombóticos y embólicos, que abarca más del 80% de todos los casos de accidente cerebrovascular3. Incluso ahora, hay relativamente pocas opciones de tratamiento disponibles para minimizar la muerte del tejido después de un accidente cerebrovascular isquémico. Los tratamientos que existen son sensibles al tiempo y, en consecuencia, no siempre conducen a buenos resultados clínicos. Por lo tanto, se necesita urgentemente investigación sobre los mecanismos celulares complejos del accidente cerebrovascular isquémico que afectan la recuperación posterior al accidente cerebrovascular.
La barrera hematoencefálica es una interfaz dinámica para el intercambio de moléculas entre la sangre y el parénquima cerebral. Estructuralmente, la BHE está compuesta por células endoteliales microvasculares cerebrales interconectadas por complejos de unión rodeados por una membrana basal, pericitos y patas terminales astrocíticas4. Los pericitos y astrocitos juegan un papel esencial en el mantenimiento de la integridad de la barrera hematoencefálica a través de la secreción de diversos factores necesarios para la formación de uniones fuertes y estrechas 5,6. La ruptura de la barrera hematoencefálica es una de las características distintivas del accidente cerebrovascular isquémico. La respuesta inflamatoria aguda y el estrés oxidativo asociado con la isquemia cerebral dan como resultado la interrupción de los complejos de proteínas de unión estrecha y la diafonía desregulada entre astrocitos, pericitos y células endoteliales, lo que conduce a una mayor permeabilidad al soluto paracelular a través de la barrera hematoencefálica7. La disfunción BBB promueve aún más la formación de edema cerebral y aumenta el riesgo de transformación hemorrágica8. Teniendo en cuenta todo lo anterior, existe un gran interés en comprender los cambios moleculares y celulares que ocurren a nivel de BBB durante y después del accidente cerebrovascular isquémico.
Aunque muchos modelos de BBB in vitro han sido desarrollados en las últimas décadas y utilizados en una variedad de estudios, ninguno de ellos puede replicar completamente las condiciones in vivo 9. Si bien algunos modelos se basan en monocapas de células endoteliales cultivadas en soportes permeables bien insertados solos o en combinación con pericitos o astrocitos, solo estudios más recientes han introducido diseños de modelos de cultivo celular triple. Casi todos los modelos existentes de triple cultivo de BBB incorporan células endoteliales cerebrales primarias junto con astrocitos y pericitos aislados de especies animales o células derivadas de células madre pluripotentes humanas10,11,12,13.
Reconociendo la necesidad de recapitular mejor la BHE humana in vitro, establecimos un modelo de triple cultivo celular in vitro BBB compuesto por células endoteliales microvasculares del cerebro humano (HBMEC), astrocitos humanos primarios (HA) y pericitos vasculares cerebrales humanos primarios (HBVP). Este modelo BBB de triple cultivo se configura en placas de 6 pocillos, insertos de membrana de poliéster con un tamaño de poro de 0,4 μm. Estos insertos de pozo proporcionan un entorno óptimo para la unión celular y permiten un fácil acceso a los compartimentos apical (sangre) y basolateral (cerebro) para el muestreo del medio o la aplicación de compuestos. Las características de este modelo propuesto de BBB de cultivo triple celular se evalúan midiendo TEER y flujo paracelular después de OGD imitando el accidente cerebrovascular isquémico in vitro, con una escasez de oxígeno (<1%O2) y nutrientes (mediante el uso de medio libre de glucosa) lograda mediante el uso de una cámara humidificada y sellada. Además, las condiciones isquémicas inducidas en este modelo se verifican con precisión mediante la visualización directa de células hipóxicas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 mm Transwell with 0.4 &#181;m Pore Polyester Membrane Insert</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Glass Bottom Dishes</td>
			<td>MatTek Life Sciences (FISHERSCI)</td>
			<td>P35GC-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Astrocyte Medium</td>
			<td>Science Cell</td>
			<td>1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attachment Factor</td>
			<td>Cell Systems (Fisher Scientific)</td>
			<td>4Z0-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 60 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrainPhys Imaging Optimized Medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Classic Medium With Serum and CultureBoost</td>
			<td>4Z0-500</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes (Conical Bottom with CentriStar Cap</td>
			<td>VWR</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 75cm&#178; U-Shaped Canted Neck Not Treated Cell Culture Flask&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431464U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning CellBIND 96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countes Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ZGEXSCCOUNTESS2FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decon CiDehol 70 Isopropyl Alcohol Solution&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>04-355-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Petri Dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Medium (No glucose, No glutamine, No phenol red)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A14430-01</td>
			<td>Glucose-free medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (No Calcium, No Magnesium)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM Endothelial Cell Growth Basal Medium, Phenol Red Free, 500 mL</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM2 Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter with STX2 electrodes</td>
			<td>World Precison Instruments</td>
			<td>NC9792051</td>
			<td>Epithelial voltohmmeter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate&#8211;dextran (wt 20,000)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>FD20-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate&#8211;dextran (wt 70,000)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>FD70S-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorview FV3000 Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Tank (95% N2, 5% CO2)</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>X02NI95C2003071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (No calcium, No magnesium, no phenol red)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Astrocytes</td>
			<td>Science Cell</td>
			<td>1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Brain Vascular Pericytes</td>
			<td>Science Cell</td>
			<td>1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxia Incubator Chamber</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>27310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image-iT Green Hypoxia Reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>I14834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pericyte Medium</td>
			<td>Science Cell</td>
			<td>1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Human Brain Microvascular Endothelial Cells</td>
			<td>ACBRI 376</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking Platform Shaker, Double</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10860-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Flow Meter</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>27311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax iD3 Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>75886-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, 25 mm, 0.22 &#956;m, PVDF, Sterile</td>
			<td>NEST Scientific</td>
			<td>380121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP Mutli-well Plates (6 wells)</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>TP92406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP Tissue Culture Flasks T-75 Flasks</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>TP90075</td>
			<td>Flasks with activated surface for cell adhesion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Distilled Water</td>
			<td>Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td>10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uno Stage Top Incubator-</td>
			<td>Oko Lab</td>
			<td>UNO-T-H-CO2-TTL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a triple primary cell culture model of the human blood-brain barrier for studying ischemic stroke in vitro

El accidente cerebrovascular isquémico es una causa importante de muerte y discapacidad en todo el mundo con opciones terapéuticas limitadas. La neuropatología del accidente cerebrovascular isquémico se caracteriza por una interrupción en el suministro de sangre al cerebro que conduce a la muerte celular y la disfunción cognitiva. Durante y después del accidente cerebrovascular isquémico, la disfunción de la barrera hematoencefálica (BHE) facilita la progresión de la lesión y contribuye a una recuperación deficiente del paciente. Los modelos actuales de BBB incluyen principalmente monocultivos endoteliales y cocultivos dobles con astrocitos o pericitos.
Tales modelos carecen de la capacidad de imitar completamente un microambiente cerebral dinámico, que es esencial para la comunicación de célula a célula. Además, los modelos de BBB comúnmente utilizados a menudo contienen células endoteliales humanas inmortalizadas o cultivos celulares derivados de animales (roedores, porcinos o bovinos) que plantean limitaciones de traducción. Este artículo describe un nuevo modelo de BBB basado en bien insertados que contiene solo células humanas primarias (células endoteliales microvasculares cerebrales, astrocitos y pericitos vasculares cerebrales) que permite la investigación de la lesión cerebral isquémica in vitro. 
Los efectos de la privación de oxígeno-glucosa (OGD) sobre la integridad de la barrera se evaluaron mediante mediciones de permeabilidad pasiva, resistencia eléctrica transendotelial (TEER) y visualización directa de células hipóxicas. El protocolo presentado ofrece una clara ventaja al imitar el entorno intercelular de la BHE in vivo, sirviendo como un modelo de BHE in vitro más realista para desarrollar nuevas estrategias terapéuticas en el contexto de la lesión cerebral isquémica.

Para examinar los efectos de los astrocitos y pericitos en la función de barrera de HBMEC, construimos el modelo BBB de cultivo celular triple en insertos de cultivo celular (Figura 1A) junto con monocultivo HBMEC y dos modelos de doble cocultivo como controles (Figura 1B). Los controles de cocultivo doble incluyeron un cocultivo sin contacto de HBMEC con AH y un cocultivo de contacto de HBMEC con HBVP. Después de 6 días en cocultivo, todas las configuracione...

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A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro

Aquí, describimos el método para establecer un modelo de cultivo celular triple de la barrera hematoencefálica basado en células endoteliales microvasculares primarias del cerebro humano, astrocitos y pericitos. Este modelo multicelular es adecuado para estudios de disfunción de unidades neurovasculares durante el ictus isquémico in vitro o para el cribado de candidatos a fármacos.

Un modelo triple de cultivo celular primario de la barrera hematoencefálica humana para estudiar el accidente cerebrovascular isquémico in vitro

Ischemic stroke is a major cause of death and disability worldwide with limited therapeutic options. The neuropathology of ischemic stroke is ...

Nuestro protocolo reconoce la necesidad de recapitular mejor la barrera hematoencefálica humana in vitro para el estudio de mecanismos celulares complejos que afectan la recuperación posterior al accidente cerebrovascular. Nuestro modelo triple exhibe una integridad robusta que está relacionada en parte con la gran compartimentación de los insertos de pozos, lo que nos permite disminuir la frecuencia de cambio y evitar la interrupción de las poblaciones. Nuestro modelo es una gran herramienta para estudiar los cambios moleculares y celulares que ocurren en la barrera hematoencefálica durante y después del accidente cerebrovascular isquémico.Nuestro protocolo permite el descubrimiento de nuevos objetivos y terapias para mejorar la recuperación posterior al accidente cerebrovascular. Los tratamientos actuales para el accidente cerebrovascular isquémico son sensibles al tiempo y, en consecuencia, no siempre son efectivos. Comience cultivando HBVP en matraces de cultivo T75 con una superficie activada para la adhesión celular dentro de una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados hasta que sea confluente.Una vez alcanzada la confluencia, aspire el medio pericito viejo y lave las células con cinco mililitros de PBS de Dulbecco caliente. Aspirar el PBS de Dulbecco y separar las células del matraz utilizando una combinación de cuatro mililitros de solución tibia de tripsina EDTA y un mililitro de PBS de Dulbecco. Incubar el matraz durante cinco minutos a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono.Ver bajo un microscopio para confirmar si las células están separadas del matraz. Añadir cinco mililitros de medio de pericito caliente que contenga 2% de FBS al matraz y transferir las células desprendidas a un tubo de centrífuga de 50 mililitros. Centrifugar la suspensión celular durante tres minutos a 200 g permitiendo que las células formen un pellet en el fondo del tubo.Aspire el medio del tubo asegurándose de que el pellet celular permanezca intacto. Vuelva a suspender el pellet celular en medio pericito. Calcule la cantidad de medio dependiendo de la confluencia de las células y el número de insertos de pocillos necesarios.Tome 10 microlitros de las células resuspendidas, colóquelas en un portaobjetos de conteo de células y cuente el número de células. Determinar la densidad celular y sembrar 300, 000 células por inserto en un mililitro de medio pericito en el lado abluminal de los insertos del pozo. Cultivar astrocitos humanos primarios utilizando el medio astrocito que contiene 2% FBS como se describe en el manuscrito de texto.Determinar la densidad celular y sembrar 300, 000 células por pocillo en el fondo de las placas de seis pocillos de cultivo de tejidos. Cubra la placa para evitar la evaporación e incube durante la noche. Del mismo modo, cultive HBMEC en placas de cultivo de tejidos utilizando un medio clásico completo que contenga 10% de FBS como se describe en el texto manuscrito.Saque las placas de seis pocillos de cultivo de tejidos que contienen astrocitos y los insertos de pocillos que contienen pericitos de la incubadora. Aspirar el medio astrocito de las placas de seis pocillos de cultivo de tejidos y añadir un mililitro de medio de pericito y un mililitro de medio de astrocito a cada pocillo. Aspirar el medio pericito de los insertos de pocillos y colocarlos en las placas de seis pocillos de cultivo de tejidos que contienen los astrocitos sembrados.Semilla de HBMEC a una densidad de 300.000 células por pocillo en dos mililitros de medio clásico completo en el lado apical de los mismos insertos de pocillos. Lave las células tres veces con PBS de Dulbecco. Para cultivos de células triples sometidos a privación de oxígeno-glucosa, agregue un medio libre de glucosa a los compartimentos apical y basolateral.Sustituir el medio de cultivo por medio fresco y cultivos celulares de control normóxico. Coloque cultivos triples de control en la incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados. Coloque una placa de Petri que contenga 20 mililitros de agua estéril en la cámara de la incubadora de hipoxia para proporcionar una humidificación adecuada de los cultivos.Abra la cámara liberando la abrazadera del anillo, luego coloque los cultivos celulares en los estantes. Selle la cámara asegurando la abrazadera del anillo. Abra los puertos de entrada y salida de la cámara y conecte el tubo desde la parte superior del medidor de flujo de la cámara.Conecte el tubo desde la parte inferior del medidor de flujo al tanque de gas a través de un filtro de aire. Abra la válvula de control de flujo del tanque girándola en sentido contrario a las agujas del reloj para permitir un flujo de gas mínimo. Abra lentamente la válvula reguladora de presión girando en el sentido de las agujas del reloj.Enjuague la cámara con la mezcla de gases durante cinco minutos a un caudal de 20 litros por minuto. Desconecte la cámara de la fuente de gas y cierre firmemente ambas abrazaderas de plástico blanco. Apague la válvula de control de flujo del tanque girando en el sentido de las agujas del reloj.Cierre la válvula reguladora de presión girando en sentido contrario a las agujas del reloj. Coloque la cámara de hipoxia en una incubadora convencional a 37 grados centígrados durante cuatro horas. Coloque el instrumento TEER esterilizado en el gabinete de bioseguridad y enchufe los electrodos en el medidor de ohmios de voltios epiteliales.Esterilice los electrodos en 30 mililitros de solución de alcohol isopropílico al 70% durante un mínimo de 30 minutos. Encienda el instrumento TEER y ajuste la función a ohmios. Retire los electrodos de la solución de alcohol isopropílico al 70% y colóquelos en 20 mililitros de PBS de Dulbecco durante un mínimo de 30 minutos hasta que la lectura digital en el dispositivo TEER lea cero ohmios.Inserte la punta larga del electrodo a través de una de las tres aberturas en el hangar de inserción del pozo en blanco que lo baje hasta que toque el fondo del pozo. Asegúrese de que la púa corta descanse sobre el cultivo apical en la parte inferior del inserto del pozo. Espere hasta que los valores de lectura digital en el instrumento TEER se nivelen antes de registrar el valor.Vuelva a colocar los electrodos en el PBS de Dulbecco para lavarlos entre mediciones. Continúe recopilando todas las mediciones TEER para dos controles de inserción de pozo en blanco más. Recopile las mediciones TEER de las placas de muestra como se demostró anteriormente.Una vez que se han realizado todas las mediciones, el electrodo vuelve a la solución de alcohol isopropílico al 70% durante 30 minutos. Luego desconecte los electrodos del instrumento TEER y déjelos secar al aire. Calcule los valores TEER.Aspirar el medio del compartimiento basolateral y reemplazarlo con dos mililitros de medio de crecimiento de células endoteliales libres de rojo fenol en el modelo de barrera hematoencefálica de cultivo de células triples. Lave las celdas en el compartimiento apical dos veces con HBSS. Agregue un mililitro de la solución de dextrano FITC en el compartimiento apical y cubra la placa con papel de aluminio, luego coloque la placa en la incubadora a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante una hora.Tome 100 microlitros de medio de los compartimentos basolaterales y transfiéralo a una placa negra de 96 pocillos. Mida la fluorescencia utilizando un lector de microplacas con las longitudes de onda de excitación y emisión establecidas en 480 y 530 nanómetros, respectivamente. Semilla 200 microlitros de HBMEC, astrocitos primarios y HBVP en el centro de platos con fondo de vidrio de 35 milímetros recubiertos de poli-D-lisina a una densidad de 150, 000 células por plato.Antes de sembrar HBMEC, cubra la parte inferior de los platos con el factor de fijación. Permita que las células se adhieran a la superficie del vidrio dejándolas durante la noche a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono. Una vez alcanzada la confluencia, deseche el medio de cultivo y agregue dos mililitros de medio libre de glucosa precalentado para la privación de oxígeno-glucosa o medio normal para los controles.Después del tratamiento de privación de oxígeno-glucosa, reemplace el medio con el medio optimizado para imágenes en todos los platos, luego realice imágenes de fluorescencia de células vivas con el filtro GFP y la incubadora de microscopio confocal de etapa superior como se describe en el manuscrito de texto. La integridad de la barrera de la monocapa endotelial en las configuraciones indicadas del modelo de barrera hematoencefálica se evaluó determinando TEER antes y después de las privaciones de oxígeno-glucosa, así como después de 24 horas de reoxigenación. Durante cuatro horas, la privación de oxígeno-glucosa causó una disminución significativa en los valores de TEER solo en el monocultivo HBMEC y el modelo de cocultivo con HBMEC y HBVP.Estos niveles disminuidos alcanzaron los niveles basales después de 24 horas de reoxigenación. Los valores de TEER en el modelo de triple cocultivo fueron significativamente más altos que los de los controles de doble cocultivo o control de monocultivo inmediatamente después de la privación de oxígeno-glucosa. La permeabilidad paracelular de las monocapas endoteliales a 20 kilodalton de masa molecular, FITC dextrano, se incrementó drásticamente en el monocultivo de HBMEC y, en menor medida, en el modelo de cocultivo con HBMEC y HBVP en comparación con los controles normóxicos.Además, los niveles de permeabilidad dextrano FITC de 20 kilodalton fueron los más bajos en el modelo de triple barrera cerebro-sangre entre todos los modelos en condiciones de privación normóxica y de oxígeno-glucosa. No se observaron cambios en el flujo de dextrano de 70 kilodalton, FITC a través de monocapas endoteliales en ninguno de los modelos. Todos los tipos humanos primarios expuestos a la privación de oxígeno-glucosa exhibieron una fuerte fluorescencia verde, lo que demuestra que las células vivas fotografiadas eran hipóxicas.Después de sembrar pericitos vasculares del cerebro humano en el lado abluminal de los insertos de pozo, es muy importante cubrirlos con la placa abatible para evitar la evaporación. En nuestro modelo, utilizamos un diámetro de poro relativamente pequeño de 0,4 micrómetros de insertos de pocillos de poliéster, lo que lo hace adecuado para la detección de candidatos a fármacos para cualquier enfermedad que requiera cruzar la barrera hematoencefálica para el tratamiento. Esta técnica proporciona una excelente oportunidad para visualizar la modificación de proteínas y transportadores si es necesario.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Termoestabilización, Expresión, purificación y cristalización del transportador de serotonina humano enlazado a<em&gt; S</em&gt; citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Investigación

Bioquímica

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

El uso de andamios liposomas para reconstituir las interacciones proteína-proteína-lípidos proximal<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Resuelta en el tiempo de ionización por electrospray de hidrógeno-deuterio Espectrometría de Masas de cambio para el estudio de la estructura proteica y Dinámica

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Fácil manipulación de arquitecturas en Hidrogeles basados en proteínas para aplicaciones de la cultura de célula

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Un método colorimétrico para medir el contenido de hierro en plantas

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibración-libre In Vitro cuantificación de proteína Homo-Oligomerización utilizando instrumentación comercial y Software de análisis de brillo libre de código abierto

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Estudio de interactianos de ARN de la proteína quinasa activada por ARN durante el ciclo de la célula mamífera

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput

Una estrategia para identificar compuestos que afectan el crecimiento celular y la supervivencia en células de mamíferos cultivadas a un rendimiento bajo a moderado

Cytotoxicity is a critical parameter that needs to be quantified when studying drugs that may have therapeutic benefits. Because of this, many drug ...

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability DARTS assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

Un ensayo semicuantitativo de estabilidad de objetivos sensibles a la afinidad de drogas (DARTS, por sus) para estudiar la interacción con Rapamicina/mTOR

Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) is a robust method for detection of novel small molecule protein targets. It can be used to verify known ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Aplicación de la interferometría de Biolayer (BLI) para el estudio de las interacciones proteínas y proteínas en la transcripción

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...