Name: a triple primary cell culture model of the human blood-brain barrier for studying ischemic stroke in vitro
Uploaded: 2022-10-06T14:05:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (NIH) bidrag MH128022, MH122235, MH072567, MH122235, HL126559, DA044579, DA039576, DA040537, DA050528 och DA047157.

OBS: Se materialförteckningen för detaljer relaterade till alla celler, material, utrustning och lösningar som används i detta protokoll.
1. BBB-modellinställning för trippelcellsodling
<ol><li>Sädande pericyter<ol><li>Odla HBVP i T75-odlingskolvar med en aktiverad yta för celladhesion i en 5%CO2-inkubator vid 37 °C tills den är sammanflytande. När sammanflödet har uppnåtts, aspirera det gamla pericytmediet och tvätta cellerna med 5 ...

<ol>
	<li>Mozaffarian, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+disease+and+stroke+statistics-2016+update:+a+report+from+the+American+Heart+Association.">Heart disease and stroke statistics-2016 update: a report from the American Heart Association.</a> Circulation. 133 (94), 38 (2016).</li><li>Yousufuddin, M., Young, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+and+ischemic+stroke.">Aging and ischemic stroke.</a> Aging. 11 (9), 2542-2544 (2019).</li><li>Donkor, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroke+in+the+21st+century:+a+snapshot+of+the+burden,+epidemiology,+and+quality+of+life.">Stroke in the 21st century: a snapshot of the burden, epidemiology, and quality of life.</a> Stroke Research and Treatment. , 3238165 (2018).</li><li>Kadry, H., Noorani, B., Cucullo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+blood-brain+barrier+overview+on+structure,+function,+impairment,+and+biomarkers+of+integrity.">A blood-brain barrier overview on structure, function, impairment, and biomarkers of integrity.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 17 (1), 69 (2020).</li><li>Brown, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+and+neurovascular+function+in+the+healthy+and+diseased+brain.">Pericytes and neurovascular function in the healthy and diseased brain.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 282 (2019).</li><li>Cabezas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+modulation+of+blood+brain+barrier:+perspectives+on+Parkinson's+disease.">Astrocytic modulation of blood brain barrier: perspectives on Parkinson's disease.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 211 (2014).</li><li>Abdullahi, W., Tripathi, D., Ronaldson, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+dysfunction+in+ischemic+stroke:+targeting+tight+junctions+and+transporters+for+vascular+protection.">Blood-brain barrier dysfunction in ischemic stroke: targeting tight junctions and transporters for vascular protection.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 315 (3), 343-356 (2018).</li><li>Candelario-Jalil, E., Dijkhuizen, R. M., Magnus, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammation,+stroke,+blood-brain+barrier+dysfunction,+and+imaging+modalities.">Neuroinflammation, stroke, blood-brain barrier dysfunction, and imaging modalities.</a> Stroke. 53 (5), 1473-1486 (2022).</li><li>He, Y., Yao, Y., Tsirka, S. E., Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-culture+models+of+the+blood-brain+barrier.">Cell-culture models of the blood-brain barrier.</a> Stroke. 45 (8), 2514-2526 (2014).</li><li>Thomsen, L. B., Burkhart, A., Moos, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+triple+culture+model+of+the+blood-brain+barrier+using+porcine+brain+endothelial+cells,+astrocytes+and+pericytes.">A triple culture model of the blood-brain barrier using porcine brain endothelial cells, astrocytes and pericytes.</a> PLoS One. 10 (8), 0134765 (2015).</li><li>Song, Y., Cai, X., Du, D., Dutta, P., Lin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+blood-brain+barrier+models+for+in+vitro+biological+analysis:+one+cell+type+vs+three+cell+types.">Comparison of blood-brain barrier models for in vitro biological analysis: one cell type vs three cell types.</a> ACS Applied Bio Materials. 2 (3), 1050-1055 (2019).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+nanoparticles+induce+tight+junction+disruption+and+astrocyte+neurotoxicity+in+a+rat+blood-brain+barrier+primary+triple+coculture+model.">Silver nanoparticles induce tight junction disruption and astrocyte neurotoxicity in a rat blood-brain barrier primary triple coculture model.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 6105-6118 (2015).</li><li>Appelt-Menzel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+human+blood-brain+barrier+co-culture+model+mimicking+the+neurovascular+unit+using+induced+pluri-+and+multipotent+stem+cells.">Establishment of a human blood-brain barrier co-culture model mimicking the neurovascular unit using induced pluri- and multipotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 894-906 (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+construction+of+a+reversible+arylazo-based+NIR+probe+for+cycling+hypoxia+imaging+in+vivo.">Rational construction of a reversible arylazo-based NIR probe for cycling hypoxia imaging in vivo.</a> Nature Communications. 12 (1), 2772 (2021).</li><li>Palacio-Casta&#241;eda, V., Kooijman, L., Venzac, B., Verdurmen, W. P. R., Le Gac, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+switching+of+tumor+cells+under+hypoxic+conditions+in+a+tumor-on-a-chip+model.">Metabolic switching of tumor cells under hypoxic conditions in a tumor-on-a-chip model.</a> Micromachines. 11 (4), 382 (2020).</li><li>Ramsauer, M., Krause, D., Dermietzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+of+the+blood-brain+barrier+in+vitro+and+the+function+of+cerebral+pericytes.">Angiogenesis of the blood-brain barrier in vitro and the function of cerebral pericytes.</a> FASEB Journal. 16 (10), 1274-1276 (2002).</li><li>Lyck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALCAM+(CD166)+is+involved+in+extravasation+of+monocytes+rather+than+T+cells+across+the+blood-brain+barrier.">ALCAM (CD166) is involved in extravasation of monocytes rather than T cells across the blood-brain barrier.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 37 (8), 2894-2909 (2017).</li><li>Rizzi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+triple+culture+cell+system+modeling+the+human+blood-brain+barrier.">A triple culture cell system modeling the human blood-brain barrier.</a> Journal of Visualized Experiments. (177), (2021).</li><li>Kumar, S., Shaw, L., Lawrence, C., Lea, R., Alder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P50:+Developing+a+physiologically+relevant+blood+brain+barrier+model+for+the+study+of+drug+disposition+in+glioma.">P50: Developing a physiologically relevant blood brain barrier model for the study of drug disposition in glioma.</a> Neuro-Oncology. 16 (6), (2014).</li><li>Stone, N. L., England, T. J., O'Sullivan, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+transwell+blood+brain+barrier+model+using+primary+human+cells.">A novel transwell blood brain barrier model using primary human cells.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 230 (2019).</li><li>Al Ahmad, A., Taboada, C. B., Gassmann, M., Ogunshola, O. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+and+pericytes+differentially+modulate+blood-brain+barrier+characteristics+during+development+and+hypoxic+insult.">Astrocytes and pericytes differentially modulate blood-brain barrier characteristics during development and hypoxic insult.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 31 (2), 693-705 (2011).</li></ol>

I detta protokoll beskriver vi en metod för att sätta upp en tillförlitlig trippel endotelcell-pericyt-astrocytkultur BBB-modell för att studera BBB-dysfunktion vid inställning av ischemisk stroke in vitro. Med tanke på att pericyter är närmaste grannar till endotelceller in vivo, är HBVP pläterade på undersidan av brunnsinsatserna i denna modell16. Även om denna konfiguration saknar den direkta cell-till-cell-kommunikationen mellan astrocyter och endotelceller, möjl...

Stroke är en av de främsta orsakerna till dödsfall och långvarig funktionsnedsättning över hela världen1. Förekomsten av stroke ökar snabbt med åldern och fördubblas var 10: e år efter 55års ålder 2. Ischemisk stroke uppstår som ett resultat av cerebral blodflödesstörning på grund av trombotiska och emboliska händelser, som omfattar mer än 80% av alla strokefall3. Även nu finns det relativt få behandlingsalternativ tillgängliga för att minimera vävnadsdöd efter ischemisk stroke. De behandlingar som finns är tidskänsliga och leder därför inte alltid till goda kliniska resultat. Därför behövs forskning om komplexa cellulära mekanismer för ischemisk stroke som påverkar återhämtning efter stroke.
BBB är ett dynamiskt gränssnitt för utbyte av molekyler mellan blodet och hjärnans parenkym. Strukturellt består BBB av hjärnans mikrovaskulära endotelceller sammankopplade av korsningskomplex omgivna av ett källarmembran, pericyter och astrocytiska endfeet4. Pericyter och astrocyter spelar en viktig roll i upprätthållandet av BBB-integritet genom utsöndring av olika faktorer som är nödvändiga för bildandet av starka, täta korsningar 5,6. Nedbrytningen av BBB är ett av kännetecknen för ischemisk stroke. Akut inflammatoriskt svar och oxidativ stress i samband med cerebral ischemi resulterar i störningar av proteinkomplex med tät korsning och dysreglerad överhörning mellan astrocyter, pericyter och endotelceller, vilket leder till ökad paracellulär löst permeabilitet över BBB7. BBB-dysfunktion främjar ytterligare bildandet av hjärnödem och ökar risken för hemorragisk transformation8. Med tanke på allt ovanstående finns det stort intresse för att förstå de molekylära och cellulära förändringar som uppstår på BBB-nivå under och efter ischemisk stroke.
Även om många in vitro BBB-modeller har utvecklats under de senaste decennierna och använts i en mängd olika studier, kan ingen av dem helt replikera in vivo-förhållanden 9. Medan vissa modeller är baserade på endotelcellmonolager odlade på välplacerade permeabla stöd ensamma eller i kombination med pericyter eller astrocyter, har endast nyare studier introducerat trippelcellodlingsmodelldesigner. Nästan alla befintliga trippelodlings-BBB-modeller innehåller primära hjärnendotelceller tillsammans med astrocyter och pericyter isolerade från djurarter eller celler som härrör från mänskliga pluripotenta stamceller10,11,12,13.
Genom att erkänna behovet av att bättre rekapitulera den mänskliga BBB in vitro, etablerade vi en trippelcellodling in vitro BBB-modell bestående av mänskliga hjärnmikrovaskulära endotelceller (HBMEC), primära mänskliga astrocyter (HA) och primära humana hjärnvaskulära pericyter (HBVP). Denna trippelkultur BBB-modell är inställd på 6-brunnsplatta, polyestermembraninsatser med 0,4 μm porstorlek. Dessa brunnsinsatser ger en optimal miljö för cellfästning och möjliggör enkel åtkomst till både apikala (blod) och basolaterala (hjärn) fack för medium provtagning eller föreningsapplikation. Egenskaperna hos denna föreslagna trippelcellodlings-BBB-modell bedöms genom att mäta TEER och paracellulärt flöde efter OGD som efterliknar ischemisk stroke in vitro, med brist på syre (<1%O2) och näringsämnen (genom att använda glukosfritt medium) som uppnås genom att använda en fuktad, förseglad kammare. Dessutom verifieras inducerade ischemiska liknande förhållanden i denna modell exakt genom direkt visualisering av hypoxiska celler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 mm Transwell with 0.4 &#181;m Pore Polyester Membrane Insert</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Glass Bottom Dishes</td>
			<td>MatTek Life Sciences (FISHERSCI)</td>
			<td>P35GC-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Astrocyte Medium</td>
			<td>Science Cell</td>
			<td>1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attachment Factor</td>
			<td>Cell Systems (Fisher Scientific)</td>
			<td>4Z0-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 60 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrainPhys Imaging Optimized Medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Classic Medium With Serum and CultureBoost</td>
			<td>4Z0-500</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes (Conical Bottom with CentriStar Cap</td>
			<td>VWR</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 75cm&#178; U-Shaped Canted Neck Not Treated Cell Culture Flask&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431464U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning CellBIND 96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countes Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ZGEXSCCOUNTESS2FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decon CiDehol 70 Isopropyl Alcohol Solution&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>04-355-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Petri Dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Medium (No glucose, No glutamine, No phenol red)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A14430-01</td>
			<td>Glucose-free medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (No Calcium, No Magnesium)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM Endothelial Cell Growth Basal Medium, Phenol Red Free, 500 mL</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM2 Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter with STX2 electrodes</td>
			<td>World Precison Instruments</td>
			<td>NC9792051</td>
			<td>Epithelial voltohmmeter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate&#8211;dextran (wt 20,000)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>FD20-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate&#8211;dextran (wt 70,000)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>FD70S-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorview FV3000 Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Tank (95% N2, 5% CO2)</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>X02NI95C2003071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (No calcium, No magnesium, no phenol red)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Astrocytes</td>
			<td>Science Cell</td>
			<td>1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Brain Vascular Pericytes</td>
			<td>Science Cell</td>
			<td>1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxia Incubator Chamber</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>27310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image-iT Green Hypoxia Reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>I14834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pericyte Medium</td>
			<td>Science Cell</td>
			<td>1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Human Brain Microvascular Endothelial Cells</td>
			<td>ACBRI 376</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking Platform Shaker, Double</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10860-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Flow Meter</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>27311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax iD3 Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>75886-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, 25 mm, 0.22 &#956;m, PVDF, Sterile</td>
			<td>NEST Scientific</td>
			<td>380121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP Mutli-well Plates (6 wells)</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>TP92406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP Tissue Culture Flasks T-75 Flasks</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>TP90075</td>
			<td>Flasks with activated surface for cell adhesion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Distilled Water</td>
			<td>Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td>10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uno Stage Top Incubator-</td>
			<td>Oko Lab</td>
			<td>UNO-T-H-CO2-TTL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a triple primary cell culture model of the human blood-brain barrier for studying ischemic stroke in vitro

Ischemisk stroke är en viktig orsak till dödsfall och funktionshinder över hela världen med begränsade terapeutiska alternativ. Neuropatologin för ischemisk stroke kännetecknas av ett avbrott i blodtillförseln till hjärnan som leder till celldöd och kognitiv dysfunktion. Under och efter ischemisk stroke underlättar dysfunktion i blod-hjärnbarriären (BBB) skadeprogression och bidrar till dålig patientåterhämtning. Nuvarande BBB-modeller inkluderar främst endotelmonokulturer och dubbla samkulturer med antingen astrocyter eller pericyter.
Sådana modeller saknar förmågan att fullt ut imitera en dynamisk hjärnmikromiljö, vilket är viktigt för cell-till-cell-kommunikation. Dessutom innehåller vanliga BBB-modeller ofta odödliga mänskliga endotelceller eller djur-härledda (gnagare, svin eller nötkreatur) cellkulturer som utgör translationella begränsningar. Denna artikel beskriver en ny välinsättningsbaserad BBB-modell som endast innehåller primära mänskliga celler (hjärnmikrovaskulära endotelceller, astrocyter och hjärnvaskulära pericyter) som möjliggör undersökning av ischemisk hjärnskada in vitro. 
Effekterna av syre-glukosbrist (OGD) på barriärintegritet bedömdes genom passiv permeabilitet, transendotelial elektrisk resistans (TEER) -mätningar och direkt visualisering av hypoxiska celler. Det presenterade protokollet erbjuder en tydlig fördel som efterliknar den intercellulära miljön hos BBB in vivo, vilket fungerar som en mer realistisk in vitro BBB-modell för att utveckla nya terapeutiska strategier vid inställning av ischemisk hjärnskada.

För att undersöka effekterna av astrocyter och pericyter på barriärfunktionen hos HBMEC konstruerade vi BBB-modellen för trippelcellodling på cellodlingsinsatser (figur 1A) tillsammans med HBMEC-monokultur och två dubbla samodlingsmodeller som kontroller (figur 1B). Dubbla samkulturkontroller inkluderade en kontaktfri samkultur av HBMEC med HA och kontaktsamkultur av HBMEC med HBVP. Efter 6 dagar i samkultur utsattes alla experimentella inställningar fö...

Watch this Scientific Journal Video about A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro at JoVE.com

A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro

Här beskriver vi metoden för att etablera en trippelcellsodlingsmodell av blod-hjärnbarriären baserad på primära mänskliga hjärnmikrovaskulära endotelceller, astrocyter och pericyter. Denna flercelliga modell är lämplig för studier av neurovaskulär enhetsdysfunktion under ischemisk stroke in vitro eller för screening av läkemedelskandidater.

En trippel primär cellodlingsmodell av den mänskliga blod-hjärnbarriären för att studera ischemisk stroke in vitro

Ischemic stroke is a major cause of death and disability worldwide with limited therapeutic options. The neuropathology of ischemic stroke is ...

Vårt protokoll erkänner behovet av att bättre rekapitulera den mänskliga blod-hjärnbarriären in vitro för studier av komplexa cellulära mekanismer som påverkar återhämtning efter stroke. Vår trippelmodell uppvisar robust integritet som delvis är relaterad till stora uppdelningar av brunnsinsatser, vilket gör att vi kan minska förändringsfrekvensen och undvika störningar i populationer. Vår modell är ett utmärkt verktyg för att studera de molekylära och cellulära förändringar som uppstår vid blod-hjärnbarriären under och efter ischemisk stroke.Vårt protokoll möjliggör upptäckt av nya mål och terapier för att förbättra återhämtningen efter stroke. Nuvarande behandlingar för ischemisk stroke är tidskänsliga och är följaktligen inte alltid effektiva. Börja med att odla HBVP i T75-odlingskolvar med en aktiverad yta för celladhesion inom en 5% koldioxidinkubator vid 37 grader Celsius tills den är sammanflytande.När sammanflödet har uppnåtts, aspirera det gamla pericytmediet och tvätta cellerna med fem milliliter varm Dulbeccos PBS. Aspirera Dulbeccos PBS och lossa cellerna från kolven med en kombination av fyra milliliter varm trypsin EDTA-lösning och en milliliter Dulbeccos PBS. Inkubera kolven i fem minuter vid 37 grader Celsius i en koldioxidinkubator.Visa under ett mikroskop för att bekräfta om cellerna är lossnade från kolven. Tillsätt fem ml varmt pericytmedium innehållande 2% FBS till kolven och överför de fristående cellerna till ett 50 ml centrifugrör. Centrifugera cellsuspensionen i tre minuter vid 200 g så att cellerna kan bilda en pellet i botten av röret.Aspirera mediet från röret så att cellpelleten förblir intakt. Återsuspendera cellpelleten i pericytmedium. Beräkna mängden medium beroende på cellernas sammanflöde och antalet brunninsatser som behövs.Ta 10 mikroliter av de återsuspenderade cellerna, placera dem i en cellräkningsbild och räkna antalet celler. Bestäm celldensiteten och frö 300 000 celler per insats i en milliliter pericytmedium på den abluminala sidan av brunnsinsatserna. Odla primära mänskliga astrocyter med hjälp av astrocytmediet som innehåller 2% FBS som beskrivs i textmanuskriptet.Bestäm celldensiteten och frö 300 000 celler per brunn på botten av vävnadskulturens sexbrunnsplattor. Täck plattan för att förhindra avdunstning och inkubera över natten. På samma sätt odla HBMEC i vävnadsodlingsrätter med komplett klassiskt medium som innehåller 10% FBS som beskrivs i textmanuskriptet.Ta ut vävnadsodlingens sexbrunnsplattor innehållande astrocyter och brunnsinsatserna som innehåller pericyter från inkubatorn. Aspirera astrocytmediet från vävnadsodlingens sexbrunnsplattor och tillsätt en milliliter pericytmedium och en milliliter astrocytmedium till varje brunn. Aspirera pericytmediet från brunnsinsatserna och placera dem i vävnadsodlingens sexbrunnsplattor som innehåller de fröade astrocyterna.Frö HBMEC med en densitet av 300 000 celler per brunn i två milliliter komplett klassiskt medium på den apikala sidan av samma brunnsinsatser. Tvätta cellerna tre gånger med Dulbeccos PBS. För trippelcellkulturer som utsätts för syre-glukosbrist, tillsätt glukosfritt medium till både apikala och basolaterala fack.Byt ut odlingsmediet med färskt medium och normoxiska kontrollcellkulturer. Placera kontroll trippelkulturer i 5% koldioxidinkubatorn vid 37 grader Celsius. Placera en petriskål som innehåller 20 ml sterilt vatten i hypoxiinkubatorkammaren för att ge tillräcklig befuktning av kulturerna.Öppna kammaren genom att släppa ringklämman och ordna sedan cellkulturerna på hyllorna. Försegla kammaren genom att fästa ringklämman. Öppna kammarens inlopps- och utloppsportar och fäst slangen från toppen av kammarens flödesmätare.Fäst slangen från botten av flödesmätaren till bensintanken via ett luftfilter. Öppna tankens flödesreglerventil genom att vrida den moturs för att tillåta minimalt gasflöde. Öppna långsamt tryckregulatorventilen genom att vrida medurs.Spola kammaren med gasblandningen i fem minuter med en flödeshastighet på 20 liter per minut. Koppla bort kammaren från gaskällan och stäng båda vita plastklämmorna ordentligt. Stäng av tankens flödesreglerventil genom att vrida medurs.Stäng tryckregulatorventilen genom att vrida moturs. Placera hypoxikammaren i en konventionell inkubator vid 37 grader Celsius i fyra timmar. Placera det steriliserade TEER-instrumentet i biosäkerhetsskåpet och anslut elektroderna till epitelvolt ohm-mätaren.Sterilisera elektroderna i 30 ml 70% isopropylalkohollösning i minst 30 minuter. Slå på TEER-instrumentet och ställ in funktionen på ohm. Ta bort elektroderna från 70% isopropylalkohollösningen och placera dem i 20 ml Dulbeccos PBS i minst 30 minuter tills den digitala avläsningen på TEER-enheten läser noll ohm.För in elektrodens långa stift genom en av de tre öppningarna i brunnsinsatshangaren på den tomma brunnsinsatskontrollen och sänk den tills den vidrör botten av brunnen. Se till att den korta spetsen vilar ovanför den apikala kulturen på botten av brunnsinsatsen. Vänta tills de digitala avläsningsvärdena på TEER-instrumentet planar ut innan du registrerar värdet.Placera elektroderna tillbaka i Dulbeccos PBS för att tvätta dem mellan mätningarna. Fortsätt att samla in alla TEER-mätningar för ytterligare två tomma brunnssättningskontroller. Samla in TEER-mätningarna av provplattorna på det sätt som visats tidigare.När alla mätningar har gjorts återgår elektroden till 70% isopropylalkohollösningen i 30 minuter. Koppla sedan bort elektroderna från TEER-instrumentet och låt dem lufttorka. Beräkna TEER-värdena.Aspirera mediet från det basolaterala facket och ersätt det med två milliliter fenolrött fritt endotelcellstillväxtmedium i trippelcellkulturens blod-hjärnbarriärmodell. Tvätta cellerna i det apikala facket två gånger med HBSS. Tillsätt en milliliter av FITC dextran-lösningen i det apikala facket och täck plattan med aluminiumfolie och placera sedan plattan i inkubatorsatsen vid 37 grader Celsius med 5% koldioxid i en timme.Ta 100 mikroliter medium från de basolaterala facken och överför det till en svart 96-brunnsplatta. Mät fluorescensen med hjälp av en mikroplattläsare med excitationen och emissionsvåglängderna inställda på 480 respektive 530 nanometer. Frö 200 mikroliter HBMEC, primära astrocyter och HBVP i mitten av poly-D-lysinbelagda 35 millimeter glasbottenskålar med en densitet av 150 000 celler per skål.Innan du sår HBMEC, täck botten av diskarna med fästfaktorn. Låt cellerna fästa på glasytan genom att lämna dem över natten vid 37 grader Celsius i en koldioxidinkubator. När sammanflödet har uppnåtts, kassera odlingsmediet och tillsätt två milliliter förvärmt glukosfritt medium för syre-glukosbrist eller normalt medium för kontroller.Efter syre-glukosbristbehandling, ersätt mediet med det bildoptimerade mediet i alla diskar och utför sedan fluorescensavbildning med GFP-filtret och konfokalmikroskopinkubatorn i toppstadiet enligt beskrivningen i textmanuskriptet. Barriärintegriteten hos endotelmonolagret i de angivna konfigurationerna av blod-hjärnbarriärmodellen bedömdes genom att bestämma TEER före och efter syre-glukosbrist, liksom efter 24 timmars återsyresättning. Under fyra timmar orsakade syre-glukosbristen en signifikant minskning av TEER-värdena endast i HBMEC-monokultur och samodlingsmodellen med HBMEC och HBVP.Dessa minskade nivåer nådde baslinjenivåerna efter 24 timmars återsyresättning. TEER-värdena i trippelsamkulturmodellen var signifikant högre än de i de dubbla samkulturkontrollerna eller monokulturkontrollen omedelbart efter syreglukosbrist. Den paracellulära permeabiliteten hos endotelmonolager till 20 kilodalton molekylmassa, FITC dextran, ökade drastiskt i HBMEC-monokulturen och i mindre utsträckning i samodlingsmodellen med HBMEC och HBVP jämfört med normoxiska kontroller.Dessutom var 20 kilodalton FITC dextranpermeabilitetsnivåer de lägsta i den tredubbla hjärn-blodbarriärmodellen bland alla modeller under normoxiska och syre-glukosberövande tillstånd. Inga förändringar observerades i 70 kilodalton, FITC dextranflöde över endotelmonolager i någon av modellerna. Alla primära mänskliga typer som utsattes för syre-glukosbrist uppvisade stark grön fluorescens, vilket bevisade att de avbildade levande cellerna var hypoxiska.Efter sådd av humana hjärnvaskulära pericyter på den abluminala sidan av brunnsinsatser är det mycket viktigt att täcka dem med flipplattan för att förhindra avdunstning. I vår modell använder vi en relativt liten pordiameter på 0,4 mikrometer polyesterbrunnar vilket gör den lämplig för screening av läkemedelskandidater till alla sjukdomar som kräver att man passerar blod-hjärnbarriären för behandling. Denna teknik ger ett utmärkt tillfälle att visualisera modifiering av proteiner och transportörer om det behövs.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, rening och kristallisation av den mänskliga Serotonin Transporter Bound till<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Använda Scaffold Liposomer att återskapa Lipid-proximala protein-proteininteraktioner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tidsupplöst elektrosprayjonisering Väte-deuterium Exchange-masspektrometri för att studera Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Enkelt att använda arkitekturer i Protein-baserade hydrogeler för Cell kultur applikationer

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

En kolorimetrisk metod för att mäta järnhalten i växter

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrering-gratis In Vitro kvantifiering av Protein Homo-oligomerisering använder kommersiella instrumentering och fri, öppen källkod ljusstyrka analys programvara

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Studera RNA interactmedlemmar av proteinkinas RNA-aktiverad under däggdjur cellcykeln

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput

En strategi för att identifiera substanser som påverkar cell tillväxt och överlevnad i odlade däggdjursceller vid låg till måttlig genomströmning

Cytotoxicity is a critical parameter that needs to be quantified when studying drugs that may have therapeutic benefits. Because of this, many drug ...

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability DARTS assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

En semi-kvantitativ Läkemedelstillhörighet lyhörd mål stabilitet (Dart) test för att studera rapamycin/mTOR interaktion

Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) is a robust method for detection of novel small molecule protein targets. It can be used to verify known ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Tillämpning av Biolayer interferometri (BLI) för att studera protein-proteininteraktioner vid transkription

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...