Name: a triple primary cell culture model of the human blood-brain barrier for studying ischemic stroke in vitro
Uploaded: 2022-10-06T14:05:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro at JoVE.com

Bu çalışma, MH128022, MH122235, MH072567, MH122235, HL126559, DA044579, DA039576, DA040537, DA050528 ve DA047157 Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) hibeleri tarafından desteklenmiştir.

NOT: Bu protokolde kullanılan tüm hücreler, malzemeler, ekipmanlar ve çözümlerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakın.
1. Üçlü hücre kültürü BBB model ayarı
<ol><li>Tohumlama perisitleri<ol><li>HBVP'yi T75 kültür şişelerinde, birleşene kadar 37 ° C'de% 5'lik bir CO2 inkübatörü içinde hücre yapışması için aktif bir yüzeye sahip olarak yetiştirin. Birleşmeye ulaşıldıktan sonra, eski perisit ortamın?...

<ol>
	<li>Mozaffarian, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+disease+and+stroke+statistics-2016+update:+a+report+from+the+American+Heart+Association.">Heart disease and stroke statistics-2016 update: a report from the American Heart Association.</a> Circulation. 133 (94), 38 (2016).</li><li>Yousufuddin, M., Young, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+and+ischemic+stroke.">Aging and ischemic stroke.</a> Aging. 11 (9), 2542-2544 (2019).</li><li>Donkor, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroke+in+the+21st+century:+a+snapshot+of+the+burden,+epidemiology,+and+quality+of+life.">Stroke in the 21st century: a snapshot of the burden, epidemiology, and quality of life.</a> Stroke Research and Treatment. , 3238165 (2018).</li><li>Kadry, H., Noorani, B., Cucullo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+blood-brain+barrier+overview+on+structure,+function,+impairment,+and+biomarkers+of+integrity.">A blood-brain barrier overview on structure, function, impairment, and biomarkers of integrity.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 17 (1), 69 (2020).</li><li>Brown, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+and+neurovascular+function+in+the+healthy+and+diseased+brain.">Pericytes and neurovascular function in the healthy and diseased brain.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 282 (2019).</li><li>Cabezas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+modulation+of+blood+brain+barrier:+perspectives+on+Parkinson's+disease.">Astrocytic modulation of blood brain barrier: perspectives on Parkinson's disease.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 211 (2014).</li><li>Abdullahi, W., Tripathi, D., Ronaldson, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+dysfunction+in+ischemic+stroke:+targeting+tight+junctions+and+transporters+for+vascular+protection.">Blood-brain barrier dysfunction in ischemic stroke: targeting tight junctions and transporters for vascular protection.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 315 (3), 343-356 (2018).</li><li>Candelario-Jalil, E., Dijkhuizen, R. M., Magnus, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammation,+stroke,+blood-brain+barrier+dysfunction,+and+imaging+modalities.">Neuroinflammation, stroke, blood-brain barrier dysfunction, and imaging modalities.</a> Stroke. 53 (5), 1473-1486 (2022).</li><li>He, Y., Yao, Y., Tsirka, S. E., Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-culture+models+of+the+blood-brain+barrier.">Cell-culture models of the blood-brain barrier.</a> Stroke. 45 (8), 2514-2526 (2014).</li><li>Thomsen, L. B., Burkhart, A., Moos, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+triple+culture+model+of+the+blood-brain+barrier+using+porcine+brain+endothelial+cells,+astrocytes+and+pericytes.">A triple culture model of the blood-brain barrier using porcine brain endothelial cells, astrocytes and pericytes.</a> PLoS One. 10 (8), 0134765 (2015).</li><li>Song, Y., Cai, X., Du, D., Dutta, P., Lin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+blood-brain+barrier+models+for+in+vitro+biological+analysis:+one+cell+type+vs+three+cell+types.">Comparison of blood-brain barrier models for in vitro biological analysis: one cell type vs three cell types.</a> ACS Applied Bio Materials. 2 (3), 1050-1055 (2019).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+nanoparticles+induce+tight+junction+disruption+and+astrocyte+neurotoxicity+in+a+rat+blood-brain+barrier+primary+triple+coculture+model.">Silver nanoparticles induce tight junction disruption and astrocyte neurotoxicity in a rat blood-brain barrier primary triple coculture model.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 6105-6118 (2015).</li><li>Appelt-Menzel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+human+blood-brain+barrier+co-culture+model+mimicking+the+neurovascular+unit+using+induced+pluri-+and+multipotent+stem+cells.">Establishment of a human blood-brain barrier co-culture model mimicking the neurovascular unit using induced pluri- and multipotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 894-906 (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+construction+of+a+reversible+arylazo-based+NIR+probe+for+cycling+hypoxia+imaging+in+vivo.">Rational construction of a reversible arylazo-based NIR probe for cycling hypoxia imaging in vivo.</a> Nature Communications. 12 (1), 2772 (2021).</li><li>Palacio-Casta&#241;eda, V., Kooijman, L., Venzac, B., Verdurmen, W. P. R., Le Gac, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+switching+of+tumor+cells+under+hypoxic+conditions+in+a+tumor-on-a-chip+model.">Metabolic switching of tumor cells under hypoxic conditions in a tumor-on-a-chip model.</a> Micromachines. 11 (4), 382 (2020).</li><li>Ramsauer, M., Krause, D., Dermietzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+of+the+blood-brain+barrier+in+vitro+and+the+function+of+cerebral+pericytes.">Angiogenesis of the blood-brain barrier in vitro and the function of cerebral pericytes.</a> FASEB Journal. 16 (10), 1274-1276 (2002).</li><li>Lyck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALCAM+(CD166)+is+involved+in+extravasation+of+monocytes+rather+than+T+cells+across+the+blood-brain+barrier.">ALCAM (CD166) is involved in extravasation of monocytes rather than T cells across the blood-brain barrier.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 37 (8), 2894-2909 (2017).</li><li>Rizzi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+triple+culture+cell+system+modeling+the+human+blood-brain+barrier.">A triple culture cell system modeling the human blood-brain barrier.</a> Journal of Visualized Experiments. (177), (2021).</li><li>Kumar, S., Shaw, L., Lawrence, C., Lea, R., Alder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P50:+Developing+a+physiologically+relevant+blood+brain+barrier+model+for+the+study+of+drug+disposition+in+glioma.">P50: Developing a physiologically relevant blood brain barrier model for the study of drug disposition in glioma.</a> Neuro-Oncology. 16 (6), (2014).</li><li>Stone, N. L., England, T. J., O'Sullivan, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+transwell+blood+brain+barrier+model+using+primary+human+cells.">A novel transwell blood brain barrier model using primary human cells.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 230 (2019).</li><li>Al Ahmad, A., Taboada, C. B., Gassmann, M., Ogunshola, O. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+and+pericytes+differentially+modulate+blood-brain+barrier+characteristics+during+development+and+hypoxic+insult.">Astrocytes and pericytes differentially modulate blood-brain barrier characteristics during development and hypoxic insult.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 31 (2), 693-705 (2011).</li></ol>

Bu protokolde, in vitro iskemik inme ortamında BBB disfonksiyonunu incelemek için güvenilir bir üçlü endotel hücre-perisit-astrosit kültürü BBB modeli oluşturmak için bir yöntem tanımladık. Perisitlerin in vivo endotel hücrelerinin en yakın komşuları olduğu göz önüne alındığında, HBVP bu model16'daki kuyu eklerinin alt tarafına kaplanmıştır. Bu konfigürasyon, astrositler ve endotel hücreleri arasındaki doğrudan hücreden hücreye iletişimden yo...

İnme, dünya çapında önde gelen ölüm ve uzun süreli sakatlık nedenlerinden biridir1. İnme insidansı yaşla birlikte hızla artar ve 55 yaşından sonra her 10 yılda bir iki katına çıkar2. İskemik inme, tüm inme vakalarının %80'inden fazlasını kapsayan trombotik ve embolik olaylara bağlı serebral kan akımının bozulması sonucu ortaya çıkar3. Şimdi bile, iskemik inme sonrası doku ölümünü en aza indirmek için nispeten az sayıda tedavi seçeneği mevcuttur. Mevcut tedaviler zamana duyarlıdır ve sonuç olarak her zaman iyi klinik sonuçlara yol açmaz. Bu nedenle, inme sonrası iyileşmeyi etkileyen iskemik inmenin karmaşık hücresel mekanizmaları üzerine araştırmalara acilen ihtiyaç vardır.
BBB, kan ve beyin parankimi arasındaki moleküllerin değişimi için dinamik bir arayüzdür. Yapısal olarak, BBB, bir bazal membran, perisitler ve astrositik uç ayaklar4 ile çevrili bileşke kompleksleri ile birbirine bağlanmış beyin mikrovasküler endotel hücrelerinden oluşur. Perisitler ve astrositler, güçlü, sıkı kavşakların oluşumu için gerekli çeşitli faktörlerin salgılanması yoluyla BBB bütünlüğünün korunmasında önemli bir rol oynamaktadır 5,6. BBB'nin parçalanması, iskemik inmenin ayırt edici özelliklerinden biridir. Serebral iskemi ile ilişkili akut inflamatuar yanıt ve oksidatif stres, sıkı bağlantı protein komplekslerinin bozulmasına ve astrositler, perisitler ve endotel hücreleri arasındaki düzensiz çapraz konuşmaya neden olur ve bu da BBB7 boyunca parasellüler çözünür geçirgenliğin artmasına neden olur. BBB disfonksiyonu ayrıca beyin ödemi oluşumunu teşvik eder ve hemorajik transformasyon riskini arttırır8. Yukarıdakilerin tümü göz önüne alındığında, iskemik inme sırasında ve sonrasında BBB düzeyinde meydana gelen moleküler ve hücresel değişikliklerin anlaşılmasına büyük ilgi vardır.
Her ne kadar birçok in vitro BBB modeli son yıllarda geliştirilmiş ve çeşitli çalışmalarda kullanılmış olsa da, hiçbiri in vivo koşullarda tam olarak çoğalamamaktadır9. Bazı modeller, tek başına veya perisitler veya astrositlerle kombinasyon halinde iyi yerleştirilmiş geçirgen destekler üzerinde kültürlenmiş endotel hücre monokatmanlarına dayanırken, sadece daha yeni çalışmalar üçlü hücre kültürü model tasarımlarını ortaya koymuştur. Hemen hemen tüm mevcut üçlü kültür BBB modelleri, hayvan türlerinden izole edilen astrositler ve perisitler veya insan pluripotent kök hücrelerinden türetilen hücreler10,11,12,13 ile birlikte birincil beyin endotel hücrelerini içerir.
İnsan BBB'sini in vitro olarak daha iyi özetleme ihtiyacını kabul ederek, insan beyni mikrovasküler endotel hücreleri (HBMEC), birincil insan astrositleri (HA) ve birincil insan beyni vasküler perisitlerinden (HBVP) oluşan üçlü bir hücre kültürü in vitro BBB modeli kurduk. Bu üçlü kültür BBB modeli, 0,4 μm gözenek boyutuna sahip 6 delikli plakalı, polyester membran uçlar üzerine kurulmuştur. Bu iyi insertler, hücre bağlantısı için en uygun ortamı sağlar ve orta örnekleme veya bileşik uygulaması için hem apikal (kan) hem de bazolateral (beyin) bölmelere kolay erişim sağlar. Bu önerilen üçlü hücre kültürü BBB modelinin özellikleri, in vitro iskemik inmeyi taklit eden OGD sonrası TEER ve parasellüler akı, nemlendirilmiş, kapalı bir oda kullanılarak elde edilen oksijen (% <1O2) ve besin (glikozsuz ortam kullanılarak) eksikliği ile ölçülerek değerlendirilmektedir. Ek olarak, bu modeldeki indüklenmiş iskemik benzeri koşullar, hipoksik hücrelerin doğrudan görselleştirilmesiyle doğru bir şekilde doğrulanır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 mm Transwell with 0.4 &#181;m Pore Polyester Membrane Insert</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Glass Bottom Dishes</td>
			<td>MatTek Life Sciences (FISHERSCI)</td>
			<td>P35GC-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Astrocyte Medium</td>
			<td>Science Cell</td>
			<td>1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attachment Factor</td>
			<td>Cell Systems (Fisher Scientific)</td>
			<td>4Z0-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 60 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrainPhys Imaging Optimized Medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Classic Medium With Serum and CultureBoost</td>
			<td>4Z0-500</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes (Conical Bottom with CentriStar Cap</td>
			<td>VWR</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 75cm&#178; U-Shaped Canted Neck Not Treated Cell Culture Flask&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431464U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning CellBIND 96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countes Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ZGEXSCCOUNTESS2FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decon CiDehol 70 Isopropyl Alcohol Solution&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>04-355-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Petri Dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Medium (No glucose, No glutamine, No phenol red)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A14430-01</td>
			<td>Glucose-free medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (No Calcium, No Magnesium)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM Endothelial Cell Growth Basal Medium, Phenol Red Free, 500 mL</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM2 Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter with STX2 electrodes</td>
			<td>World Precison Instruments</td>
			<td>NC9792051</td>
			<td>Epithelial voltohmmeter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate&#8211;dextran (wt 20,000)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>FD20-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate&#8211;dextran (wt 70,000)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>FD70S-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorview FV3000 Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Tank (95% N2, 5% CO2)</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>X02NI95C2003071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (No calcium, No magnesium, no phenol red)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Astrocytes</td>
			<td>Science Cell</td>
			<td>1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Brain Vascular Pericytes</td>
			<td>Science Cell</td>
			<td>1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxia Incubator Chamber</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>27310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image-iT Green Hypoxia Reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>I14834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pericyte Medium</td>
			<td>Science Cell</td>
			<td>1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Human Brain Microvascular Endothelial Cells</td>
			<td>ACBRI 376</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking Platform Shaker, Double</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10860-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Flow Meter</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>27311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax iD3 Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>75886-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, 25 mm, 0.22 &#956;m, PVDF, Sterile</td>
			<td>NEST Scientific</td>
			<td>380121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP Mutli-well Plates (6 wells)</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>TP92406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP Tissue Culture Flasks T-75 Flasks</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>TP90075</td>
			<td>Flasks with activated surface for cell adhesion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Distilled Water</td>
			<td>Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td>10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uno Stage Top Incubator-</td>
			<td>Oko Lab</td>
			<td>UNO-T-H-CO2-TTL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a triple primary cell culture model of the human blood-brain barrier for studying ischemic stroke in vitro

İskemik inme, sınırlı tedavi seçenekleri ile dünya çapında önemli bir ölüm ve sakatlık nedenidir. İskemik inmenin nöropatolojisi, hücre ölümüne ve bilişsel işlev bozukluğuna yol açan beyne giden kan akışında bir kesinti ile karakterizedir. İskemik inme sırasında ve sonrasında, kan-beyin bariyeri (BBB) disfonksiyonu yaralanma ilerlemesini kolaylaştırır ve zayıf hasta iyileşmesine katkıda bulunur. Mevcut BBB modelleri öncelikle endotel monokültürlerini ve astrositler veya perisitlerle çift ortak kültürleri içerir.
Bu tür modeller, hücreden hücreye iletişim için gerekli olan dinamik bir beyin mikro çevresini tamamen taklit etme yeteneğinden yoksundur. Ek olarak, yaygın olarak kullanılan BBB modelleri genellikle ölümsüzleştirilmiş insan endotel hücrelerini veya translasyonel sınırlamalar oluşturan hayvan kaynaklı (kemirgen, domuz veya sığır) hücre kültürlerini içerir. Bu yazıda, iskemik beyin hasarının in vitro olarak araştırılmasını sağlayan, sadece primer insan hücrelerini (beyin mikrovasküler endotel hücreleri, astrositler ve beyin vasküler perisitleri) içeren yeni bir iyi yerleştirme tabanlı BBB modeli açıklanmaktadır. 
Oksijen-glukoz yoksunluğunun (OGD) bariyer bütünlüğü üzerine etkileri pasif geçirgenlik, transendotelyal elektriksel direnç (TEER) ölçümleri ve hipoksik hücrelerin doğrudan görüntülenmesi ile değerlendirildi. Sunulan protokol, BBB'nin hücreler arası ortamını in vivo olarak taklit eden belirgin bir avantaj sunarak, iskemik beyin hasarı ortamında yeni terapötik stratejiler geliştirmek için daha gerçekçi bir in vitro BBB modeli olarak hizmet vermektedir.

Astrositlerin ve perisitlerin HBMEC'nin bariyer fonksiyonu üzerindeki etkilerini incelemek için, HBMEC monokültürü ve kontrol olarak iki çift ko-kültür modeli ile birlikte hücre kültürü ekleri üzerinde üçlü hücre kültürü BBB modelini (Şekil 1A) oluşturduk (Şekil 1B). Çift ko-kültür kontrolleri, HBMEC'nin HA ile temassız bir ortak kültürünü ve HBMEC'nin HBVP ile temas ortak kültürünü içeriyordu. Ko-kültürde 6 gün kaldıktan ...

Watch this Scientific Journal Video about A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro at JoVE.com

A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro

Burada, birincil insan beyni mikrovasküler endotel hücrelerine, astrositlere ve perisitlere dayanan kan-beyin bariyerinin üçlü hücre kültürü modelini oluşturma yöntemini açıklıyoruz. Bu çok hücreli model, in vitro iskemik inme sırasında nörovasküler birim disfonksiyonunun incelenmesi veya ilaç adaylarının taranması için uygundur.

İskemik İnme In Vitro Çalışması için İnsan Kan-Beyin Bariyerinin Üçlü Birincil Hücre Kültürü Modeli

Ischemic stroke is a major cause of death and disability worldwide with limited therapeutic options. The neuropathology of ischemic stroke is ...

Protokolümüz, inme sonrası iyileşmeyi etkileyen karmaşık hücresel mekanizmaların incelenmesi için insan kan-beyin bariyerini in vitro olarak daha iyi özetleme ihtiyacını kabul etmektedir. Üçlü modelimiz, kısmen kuyu uçlarının büyük bölümlenmesiyle ilgili sağlam bir bütünlük sergileyerek değişim sıklığını azaltmamıza ve popülasyonların bozulmasını önlememize olanak tanır. Modelimiz, iskemik inme sırasında ve sonrasında kan-beyin bariyerinde meydana gelen moleküler ve hücresel değişiklikleri incelemek için harika bir araçtır.Protokolümüz, inme sonrası iyileşmeyi iyileştirmek için yeni hedeflerin ve terapötiklerin keşfedilmesine izin verir. İskemik inme için mevcut tedaviler zamana duyarlıdır ve sonuç olarak her zaman etkili değildir. T75 kültür şişelerinde HBVP'yi, birleşene kadar% 5'lik bir karbondioksit inkübatörü içinde% 5 karbondioksit inkübatörü içinde hücre yapışması için aktif bir yüzeye sahip olarak yetiştirerek başlayın.Birleşmeye ulaşıldıktan sonra, eski perisit ortamını aspire edin ve hücreleri beş mililitre ılık Dulbecco'nun PBS'si ile yıkayın. Dulbecco'nun PBS'sini aspire edin ve dört mililitre sıcak tripsin EDTA çözeltisi ve bir mililitre Dulbecco'nun PBS'sinin bir kombinasyonunu kullanarak hücreleri şişeden ayırın. Şişeyi bir karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede beş dakika boyunca inkübe edin.Hücrelerin şişeden ayrılıp ayrılmadığını doğrulamak için mikroskop altında görüntüleyin. Şişeye% 2 FBS içeren beş mililitre ılık perisit ortamı ekleyin ve ayrılan hücreleri 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Hücre süspansiyonunu 200 g'da üç dakika boyunca santrifüj ederek hücrelerin tüpün dibinde bir pelet oluşturmasını sağlayın.Hücre peletinin bozulmadan kalmasını sağlamak için ortamı tüpten aspire edin. Hücre peletini perisit ortamında tekrar askıya alın. Hücrelerin birleşmesine ve gereken kuyu eklerinin sayısına bağlı olarak ortam miktarını hesaplayın.Yeniden askıya alınan hücrelerin 10 mikrolitresini alın, bunları bir hücre sayma slaytına yerleştirin ve hücre sayısını sayın. Hücre yoğunluğunu belirleyin ve kuyu eklerinin abluminal tarafına bir mililitre perisit ortamında kesici uç başına 300.000 hücre tohumlayın. Metin makalesinde açıklandığı gibi% 2 FBS içeren astrosit ortamını kullanarak birincil insan astrositlerini geliştirin.Hücre yoğunluğunu belirleyin ve doku kültürünün altı kuyucuklu plakalarının dibine kuyucuk başına 300.000 hücre tohumlayın. Buharlaşmayı önlemek için plakayı örtün ve gece boyunca inkübe edin. Benzer şekilde, HBMEC'yi doku kültürü kaplarında, metin makalesinde açıklandığı gibi% 10 FBS içeren eksiksiz klasik ortam kullanarak geliştirin.Astrositler içeren doku kültürü altı kuyucuklu plakaları ve perisitler içeren kuyu eklerini inkübatörden çıkarın. Astrosit ortamını doku kültürü altı kuyucuklu plakalardan aspire edin ve her bir kuyucuğa bir mililitre perisit ortamı ve bir mililitre astrosit ortamı ekleyin. Perisit ortamını kuyu eklerinden aspire edin ve tohumlanmış astrositleri içeren doku kültürü altı kuyucuklu plakalara yerleştirin.Tohum HBMEC, iki mililitre tam klasik ortamda kuyu başına 300.000 hücre yoğunluğunda aynı kuyunun apikal tarafına yerleştirilir. Hücreleri Dulbecco'nun PBS'si ile üç kez yıkayın. Oksijen-glikoz yoksunluğuna maruz kalan üçlü hücre kültürleri için, hem apikal hem de bazolateral bölmelere glikozsuz ortam ekleyin.Kültür ortamını taze ortam ve normoksik kontrol hücresi kültürleri ile değiştirin. Kontrol üçlü kültürlerini% 5 karbondioksit inkübatörüne 37 santigrat derecede yerleştirin. Kültürlerin yeterli nemlendirilmesini sağlamak için hipoksi inkübatör odasına 20 mililitre steril su içeren bir Petri kabı yerleştirin.Halka kelepçesini serbest bırakarak odayı açın, ardından hücre kültürlerini raflara yerleştirin. Halka kelepçesini sabitleyerek odayı kapatın. Odanın giriş ve çıkış portlarını açın ve boruyu odanın debimetresinin üstünden takın.Boruyu debimetrenin altından bir hava filtresi aracılığıyla gaz tankına takın. Minimum gaz akışına izin vermek için tank akış kontrol valfini saat yönünün tersine çevirerek açın. Saat yönünde dönerek basınç regülatörü valfini yavaşça açın.Odayı gaz karışımı ile dakikada 20 litre akış hızında beş dakika boyunca yıkayın. Odayı gaz kaynağından ayırın ve her iki beyaz plastik kelepçeyi sıkıca kapatın. Saat yönünde dönerek tank akış kontrol valfini kapatın.Saat yönünün tersine dönerek basınç regülatörü valfini kapatın. Hipoksi odasını dört saat boyunca 37 santigrat dereceye ayarlanmış geleneksel bir inkübatöre yerleştirin. Sterilize edilmiş TEER cihazını biyogüvenlik kabinine yerleştirin ve elektrotları epitel volt ohm metreye takın.Elektrotları en az 30 dakika boyunca 30 mililitre% 70 izopropil alkol çözeltisinde sterilize edin. TEER cihazını açın ve işlevi ohm olarak ayarlayın. Elektrotları% 70 izopropil alkol çözeltisinden çıkarın ve TEER cihazındaki dijital okuma sıfır ohm okuyana kadar en az 30 dakika boyunca 20 mililitre Dulbecco'nun PBS'sine yerleştirin.Elektrotun uzun çatalını, boş kuyu ekleme kontrolünün kuyu yerleştirme hangarındaki üç açıklıktan birinden geçirin ve kuyunun dibine dokunana kadar indirin. Kısa çatalın, kuyu ucunun altındaki apikal kültürün üzerinde durduğundan emin olun. Değeri kaydetmeden önce TEER cihazındaki dijital okuma değerleri aynı seviyeye gelene kadar bekleyin.Elektrotları ölçümler arasında yıkamak için Dulbecco'nun PBS'sine geri yerleştirin. İki boş kuyu eki kontrolü için tüm TEER ölçümlerini toplamaya devam edin. Daha önce gösterildiği gibi numune plakalarının TEER ölçümlerini toplayın.Tüm ölçümler yapıldıktan sonra, elektrot 30 dakika boyunca% 70 izopropil alkol çözeltisine geri döner. Ardından elektrotları TEER cihazından ayırın ve havayla kurumasını bekleyin. TEER değerlerini hesaplayın.Ortamı bazolateral bölmeden aspire edin ve üçlü hücre kültürü kan-beyin bariyeri modelinde iki mililitre fenol kırmızı serbest endotel hücre büyüme ortamı ile değiştirin. Apikal bölmedeki hücreleri HBSS ile iki kez yıkayın. Apikal bölmeye bir mililitre FITC dekstran çözeltisi ekleyin ve plakayı alüminyum folyo ile örtün, ardından plakayı bir saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat dereceye ayarlanmış inkübatöre yerleştirin.Bazolateral bölmelerden 100 mikrolitre ortam alın ve siyah bir 96 delikli plakaya aktarın. Floresansı, uyarma ve emisyon dalga boyları sırasıyla 480 ve 530 nanometreye ayarlanmış bir mikroplaka okuyucu kullanarak ölçün. Tohum 200 mikrolitre HBMEC, birincil astrositler ve HBVP'nin merkezinde poli-D-lizin kaplı 35 milimetre cam taban tabakları, çanak başına 150.000 hücre yoğunluğunda.HBMEC'yi tohumlamadan önce, bulaşıkların dibini bağlantı faktörü ile kaplayın. Hücrelerin bir karbondioksit inkübatöründe gece boyunca 37 santigrat derecede bırakarak cam yüzeye yapışmasına izin verin. Birleşmeye ulaşıldıktan sonra, kültür ortamını atın ve oksijen-glikoz yoksunluğu için iki mililitre önceden ısıtılmış glikozsuz ortam veya kontroller için normal ortam ekleyin.Oksijen-glukoz yoksunluğu tedavisinden sonra, ortamı tüm yemeklerde görüntüleme için optimize edilmiş ortamla değiştirin, ardından GFP filtresi ve metin makalesinde açıklandığı gibi üst aşama konfokal mikroskop inkübatörü ile floresan canlı hücre görüntülemesi gerçekleştirin. Belirtilen kan-beyin bariyer modeli konfigürasyonlarında endotel tek katmanının bariyer bütünlüğü, oksijen-glikoz yoksunluklarından önce ve sonra ve ayrıca 24 saatlik yeniden oksijenasyondan sonra TEER belirlenerek değerlendirildi. Dört saat boyunca oksijen-glukoz yoksunluğu sadece HBMEC monokültüründe ve HBMEC ve HBVP ile ko-kültür modelinde TEER değerlerinde önemli bir azalmaya neden olmuştur.Bu azalan seviyeler, 24 saatlik yeniden oksijenlenmenin ardından temel seviyelere ulaştı. Üçlü ko-kültür modelindeki TEER değerleri, oksijen-glukoz yoksunluğundan hemen sonra çift ko-kültür kontrolleri veya monokültür kontrolündekilerden anlamlı derecede yüksekti. Endotel monokatmanlarının 20 kilodalton moleküler kütleye, FITC dextran'a parasellüler geçirgenliği, HBMEC monokültüründe ve HBMEC ve HBVP ile ko-kültür modelinde normoksik kontrollere kıyasla daha az ölçüde artmıştır.Ayrıca, 20 kilodalton FITC dekstran geçirgenlik seviyeleri, normoksik ve oksijen-glikoz yoksunluğu koşulları altındaki tüm modeller arasında üçlü beyin-kan bariyeri modelinde en düşük seviyedeydi. Modellerin hiçbirinde endotel monokatmanları arasında 70 kilodalton, FITC dekstran akısında herhangi bir değişiklik gözlenmedi. Oksijen-glikoz yoksunluğuna maruz kalan tüm birincil insan tipleri, görüntülenen canlı hücrelerin hipoksik olduğunu kanıtlayan güçlü yeşil floresan sergiledi.İnsan beyni vasküler perisitlerini kuyu eklerinin abluminal tarafına tohumladıktan sonra, buharlaşmayı önlemek için bunları çevirme plakası ile örtmek çok önemlidir. Modelimizde, nispeten küçük, 0.4 mikrometre gözenek çapına sahip polyester kuyu ekleri kullanıyoruz, bu da tedavi için kan-beyin bariyerini geçmeyi gerektiren herhangi bir hastalığa ilaç adaylarının taranması için uygun hale getiriyor. Bu teknik, gerekirse proteinlerin ve taşıyıcıların modifikasyonunu görselleştirmek için mükemmel bir fırsat sağlar.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Termo, İfade, saflaştırılması, ve İnsan serotonin Transporter Kristalizasyon Bound<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için<em&gt; İn Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zaman çözülmesi elektro sprey iyonizasyon Hidrojen-döteryum Değişim Kütle Spektrometre Protein Yapısı ve Dinamikleri incelenmesi için

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Protein bazlı Hydrogels mimarilerde kolayca idare hücre kültür uygulamaları için

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Demir içeriği tesislerinde ölçme kolorimetrik yöntemi

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrasyon-Alerjik Vitro miktar Protein Homo-Oligomerizasyonda ticari araçları ve ücretsiz, açık kaynak parlaklık analiz yazılımı kullanarak

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

RNA Interactors Protein kinaz memeli hücre döngüsü sırasında RNA-harekete geçirmek, eğitim

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput

Düşük-Orta Throughput'ta Kültürlü Memeli Hücrelerinde Hücre Büyümesini ve SağkalımLarını Etkileyen Bileşikleri Belirleme Stratejisi

Cytotoxicity is a critical parameter that needs to be quantified when studying drugs that may have therapeutic benefits. Because of this, many drug ...

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability DARTS assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

Rapamisin/mTOR etkileşimini incelemek için Yarı Kantitatif İlaç Affinity Responsive Target Stability (DARTS)

Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) is a robust method for detection of novel small molecule protein targets. It can be used to verify known ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Transkripsiyon protein-protein etkileşimlerini Incelemek için Biolayer Interferometri (BLı) uygulaması

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...