Name: collection of alfalfa root exudates to study the impact of di(2-ethylhexyl) phthalate on metabolite production
Uploaded: 2023-06-02T12:45:00
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这项工作得到了国家自然科学基金（41877139）、国家自然科学基金重大项目（41991335）、国家重点研发计划（2016YFD0800204）、江苏省自然科学基金（编号：BK20161616）、“135”计划、中国科学院前沿计划（ISSASIP1615）的联合支持。

该协议的目的是提供一个通用管道，从水培培养实验到代谢组学分析，量化DEHP对苜蓿根系分泌物的影响。
1. 水培培养实验
注意：该协议提供了苜蓿水培培养实验的示例，旨在在不同浓度的DEHP的压力下获得苜蓿（Medicago sativa）幼苗。设置三种处理：不添加任何成分的对照，并在营养液中加标1mg kg-1和10 mg kg-1的di（DEHP。根...

该协议提供了有关如何在DEHP胁迫下收集和测量苜蓿根系分泌物以及如何分析代谢组数据的一般指导。需要密切关注该协议中的一些关键步骤。在水培培养实验中，将苜蓿幼苗在装有不同浓度DEHP营养液的玻璃瓶中水培。在整个培养过程中，玻璃瓶应用铝箔覆盖，以防止玻璃瓶光解并确保所有培养溶液中DEHP浓度的均匀性25，26。DEHP 浓度设定为 1 mg L-1 和 10 ...

邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）是一种合成化合物，广泛用于各种塑料和聚合物中作为增塑剂，以提高其可塑性和强度。在过去的几年中，越来越多的研究表明DEHP是一种内分泌干扰物，对人类和其他动物的呼吸，神经和生殖系统有不利影响1，2，3。考虑到其健康风险，美国环境保护署、欧盟和中国环境监测中心均已将DEHP列入重点污染物清单。由于施用了塑料覆盖和有机肥料、废水灌溉和污泥农场的应用，土壤被认为是DEHP在环境中的重要汇4。不出所料，DEHP在农田土壤中普遍存在，其含量甚至高达毫克/公斤干土在中国5，6。DEHP主要通过根部进入植物，并在土壤生态系统中经历不同营养水平的生物放大作用7。因此，近几十年来，人们对植物中DEHP引起的胁迫提出了重大关注。
植物通常容易受到DEHP暴露的影响。已经观察到DEHP胁迫对种子发芽和正常新陈代谢产生不利影响，从而抑制植物生长发育8，9。例如，DEHP可诱导叶肉细胞氧化损伤，降低叶绿素和渗透剂的含量，提高抗氧化酶活性，最终导致食用植物产量和品质下降10，11。然而，以往关于植物对DEHP胁迫响应的研究大多集中在氧化应激和生理生化特性上。与植物代谢相关的相应机制研究较少。根系分泌物是一个通用术语，描述植物根部分泌并释放到环境中的化合物。它们被认为是植物与根际土壤之间的相互作用介质，在支持植物生长发育方面发挥着重要作用12。众所周知，根系分泌物约占所有光合碳的30%-40%13。在污染环境中，根系分泌物通过新陈代谢或外部排斥来提高植物对污染物胁迫的耐受性14。因此，深入了解植物根系分泌物对污染胁迫的反应可能有助于揭示与细胞生物化学和生物现象相关的潜在机制15。
代谢组学技术提供了一种有效的策略，用于同时测量细胞16，17，组织18甚至生物体19的渗出物内的大量小分子代谢物，包括糖，有机酸，氨基酸和脂质。与传统或经典的化学分析方法相比，代谢组学方法大大增加了可检测的代谢物数量20，这有助于以更高通量的方式鉴定代谢物并鉴定关键代谢途径。代谢组学已广泛应用于胁迫环境下的生物反应研究领域，如重金属21、新兴污染物22和纳米颗粒19。这些关于植物的研究大多集中在植物内部组织的代谢变化上，而很少有关于根系分泌物对环境胁迫的响应的报道。因此，本研究的目的是引入收集苜蓿根系分泌物的一般指南，以研究DEHP对代谢物产生的影响。研究结果将为DEHP后续研究植物代谢组学提供方法指导。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adonitol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td></td>
			<td>&#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alfalfa seeds</td>
			<td>Jiangsu Academy of Agricultural Sciences (Nanjing, China)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>BSA124S-CW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSTFA</td>
			<td>REGIS Technologies</td>
			<td></td>
			<td>with 1% TMCS, v/v</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Heraeus Fresco17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatographic column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DB-5MS (30 m &#215; 250 &#956;m &#215; 0.25 &#956;m)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di(2-ethylhexyl) phthalate</td>
			<td>Dr. Ehrenstorfer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAMEs</td>
			<td>Dr. Ehrenstorfer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas chromatography(GC)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>7890A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grinding instrument</td>
			<td>Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd</td>
			<td>JXFSTPRP-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spectrometer(MS)</td>
			<td>LECO</td>
			<td>PEGASUS HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>CNW Technologies</td>
			<td></td>
			<td>HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methoxyaminatio hydrochloride</td>
			<td>TCI</td>
			<td></td>
			<td>AR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Eppendorf Quality</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd</td>
			<td>DHG-9023A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridine</td>
			<td>Adamas</td>
			<td></td>
			<td>HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>statistical analysis software (pathway enrichment, topology)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIMCA16.0.2&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>statistical analysis software (OPLS-DA etc)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra low temperature freezer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Forma 900 series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound</td>
			<td>Shenzhen Fangao Microelectronics Co., Ltd</td>
			<td>YM-080S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum dryer</td>
			<td>Taicang Huamei biochemical instrument factory</td>
			<td>LNG-T98</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

collection of alfalfa root exudates to study the impact of di(2-ethylhexyl) phthalate on metabolite production

根系分泌物是植物根系与周围环境之间信息交流和能量传递的主要媒介。根系分泌物分泌物的变化通常是植物在胁迫条件下的外部解毒策略。该协议旨在引入收集苜蓿根系分泌物的一般指南，以研究邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）对代谢物产生的影响。首先，在水培培养实验中在DEHP胁迫下生长苜蓿幼苗。其次，将植物转移到含有50mL灭菌超纯水的离心管中6小时以收集根系分泌物。然后将溶液在真空冷冻干燥机中冷冻干燥。冷冻样品用双（三甲基硅基））三氟乙酰胺（BSTFA）试剂提取并衍生化。随后，使用气相色谱系统与飞行时间质谱仪（GC-TOF-MS）测量衍生化提取物。然后基于生物信息学方法分析获得的代谢物数据。应深入探讨差异代谢产物和显著改变的代谢途径，以揭示DEHP对苜蓿根系分泌物的影响。

在该实验中，根据上述方法收集，提取和分析苜蓿根系分泌物（图1）。设置三个治疗组：对照组，低浓度DEHP（1mg L−1）和高浓度DEHP（10mg L-1）。
对照色谱共检出778个峰，其中314个代谢物可根据质谱鉴定。如图 2所示，这些代谢物根据相对丰度可分为六种类型：碳水化合物（28.6%），酸（15.58%），脂类（13.87%），醇?...

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Collection of Alfalfa Root Exudates to Study the Impact of Di2-ethylhexyl Phthalate on Metabolite Production

根系分泌物的分泌通常是植物在胁迫条件下的外部解毒策略。该协议描述了如何通过非靶向代谢组学分析 评估 异生素对苜蓿的影响。

收集苜蓿根系分泌物以研究邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯对代谢物产生的影响

Root exudates are the main media of information communication and energy transfer between plant roots and the surrounding environment. The change in ...

该协议描述了如何在非靶向代谢组学分析时评估异生素对苜蓿的影响。该技术非常简单，操作方便，可以识别更多类型的根系渗出物。这有助于构建植物根系分泌物的代谢组学指纹图谱。开始药用0.1%次氯酸钠冲洗种子10分钟，开始药用苜蓿或苜蓿种子的灭菌。然后用75%乙醇洗涤30分钟。接下来，用蒸馏水冲洗灭菌的种子几次。然后在放置在无菌培养皿中的潮湿滤纸上发芽。在黑暗中处于30摄氏度。发芽后，将20个均匀发芽的大丰满种子转移到装满营养液的培养瓶中的植入篮中。将所有培养瓶放入具有受控条件的生长室中。两周后，将15株均匀的苜蓿幼苗转移到一个新的玻璃瓶中，将它们暴露于每公斤1毫克和每公斤10毫克的DEHP压力下进行培养实验。用铝箔和封口膜包裹处理和控制玻璃瓶，以防止DEHP的光解和挥发。每天补充营养液以维持液位。每两天随机放置和旋转瓶子，以确保苜蓿幼苗的生长条件一致。栽培七天后，从瓶子中取出苜蓿幼苗。并用超纯水清洗几次，为收集根系分泌物做准备。通过将10个均匀的苜蓿幼苗转移到装有50毫升灭菌去离子水的离心管中，开始根系渗出物收集实验。要收集根系分泌物，请将管子直立六小时，根部浸入水中。完成后，用铝箔包裹离心管以保护根部免受光照。取出植物并冷冻干燥收集的液体以进行代谢物分析。通过在冷冻干燥的样品中加入1.8毫升提取溶液来进行提取实验。涡旋30秒。接下来，在冰水浴中将超声波施加到管子上10分钟。在离心样品之前。小心地将200微升上清液转移到1.5毫升微量离心管中。从离心管中吸出45微升上清液，并将其混合到质量控制或QC样品中，最终体积为270微升。完成后，在真空浓缩器中冷冻干燥提取物。干燥完成后，加入五微升内标核糖核酸酶并继续干燥。蒸发后，加入30微升甲氧基胺化盐酸盐溶液，将试管在80摄氏度下孵育30分钟。接下来，向样品中加入40微升BSTFA试剂，然后将试管置于70摄氏度下1.5小时以进行衍生化。孵育结束并且衍生化样品达到室温后，向衍生化样品中加入五微升溶解在氯仿中的脂肪酸甲酯。使用尺寸为 30 米 x 250 微米 x 0.25 微米的毛细管柱，以每分钟 1.0 毫升的流速用载气氦气分离 1 微升根分泌物。将注射温度设置为280摄氏度。并将传输线温度保持在280摄氏度。设置用于分离的烤箱程序。分离提取物后，以电子碰撞模式进行质谱分析，能量为负70电子伏特。将离子源温度保持在250摄氏度。使用全扫描监测模式获得质谱，质量扫描范围为50至500质量，以每秒12.5个谱图的速率。在对照样品的色谱仪中检测到778个峰。其中314种代谢物根据质谱鉴定。酸进一步细分为脂肪酸、氨基酸、有机酸和酚酸。此外，在苜蓿根系分泌物中也检测到一些通常存在于根系分泌物中的常见物质，包括嘧啶类、羟基嘧啶类、类黄酮类、酚类、酮类、嘧啶类和二萜类。根据VIP评分绘制热图，以可视化不同DEHP处理中差异代谢物的变化。与对照样品相比，DEHP暴露显著改变了50种代谢物和苜蓿根系分泌物的含量。主要包括一些碳水化合物和低分子量有机酸。代谢途径分析表明，DEHP显著抑制了作为光合作用产物的碳水化合物的代谢，表明DEHP可以在一定程度上抑制苜蓿的光合作用，DEHP被认为可以促进脂肪酸的代谢，有助于抵抗DEHP的压力。至少应为每次处理进行种子根系渗出物，以确保准确的代谢组学数据分析。我们可以确定差异代谢，并进一步研究污染物环境行为中的重要规则。植物与更广泛的野外生物群落之间的相互作用可以通过这种方法来破译。

Research

JoVE Journal

Environment

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环境科学

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