Name: collection of alfalfa root exudates to study the impact of di(2-ethylhexyl) phthalate on metabolite production
Uploaded: 2023-06-02T12:45:00
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Diese Arbeit wurde gemeinsam von der National Natural Science Foundation of China (41877139), den Großprojekten der National Natural Science Foundation of China (41991335), dem National Key Research and Development Program of China (2016YFD0800204), der Natural Science Foundation of Jiangsu Province (Nr. BK20161616), dem "135"-Plan und dem Frontiers Program der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (ISSASIP1615) unterstützt.

Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine allgemeine Pipeline von einem hydroponischen Kulturexperiment bis hin zu metabolomischen Analysen bereitzustellen, um die Wirkung von DEHP auf Luzernewurzelexsudate zu quantifizieren.
1. Hydroponisches Kulturexperiment
HINWEIS: Dieses Protokoll zeigt ein Beispiel für ein hydroponisches Luzerne-Kulturexperiment, das entwickelt wurde, um Luzerne-Sämlinge (Medicago sativa) unter dem Stress verschiedener ...

Dieses Protokoll bietet eine allgemeine Anleitung zur Erfassung und Messung der Wurzelexsudate von Luzerne unter DEHP-Stress sowie zur Analyse der Metabolomdaten. Einigen kritischen Schritten in diesem Protokoll muss besondere Aufmerksamkeit geschenkt werden. In hydroponischen Kulturexperimenten wurden Luzerne-Sämlinge hydroponisch in Glasflaschen kultiviert, die mit Nährlösungen mit unterschiedlichen DEHP-Konzentrationen gefüllt waren. Die Glasflaschen sollten während der gesamten Kulturperiode vor Licht geschützt...

Di(2-ethylhexyl)phthalat (DEHP) ist eine synthetische chemische Verbindung, die in verschiedenen Kunststoffen und Polymeren als Weichmacher verwendet wird, um deren Plastizität und Festigkeit zu verbessern. In den letzten Jahren deuten immer mehr Studien darauf hin, dass DEHP ein endokriner Disruptor ist und sich nachteilig auf die Atemwege, Nerven und Fortpflanzungssysteme von Menschen und anderen Tieren auswirkt 1,2,3. In Anbetracht seines Gesundheitsrisikos haben die Umweltschutzbehörde der Vereinigten Staaten, die Europäische Union und das Environmental Monitoring Center of China DEHP in die Liste der prioritären Schadstoffe aufgenommen. Der Boden wurde aufgrund der Anwendung von Kunststoffmulch und organischem Dünger, der Bewässerung mit Abwasser und der Anwendung von Schlammfarmen als wichtige Senke von DEHP in der Umwelt angesehen4. Erwartungsgemäß wurde DEHP ubiquitär in landwirtschaftlich genutzten Böden nachgewiesen, deren Gehalt in einigen Regionen Chinas sogar bis zu Milligramm pro Kilogramm getrockneter Böden erreicht 5,6. DEHP kann hauptsächlich über die Wurzeln in Pflanzen eindringen und auf verschiedenen trophischen Ebenen in Bodenökosystemen biomagnifikiert werden7. Daher wurde in den letzten Jahrzehnten erhebliche Besorgnis über DEHP-induzierten Stress in Pflanzen geäußert.
Pflanzen sind in der Regel anfällig für eine DEHP-Exposition. Es wurde beobachtet, dass DEHP-Stress eine nachteilige Wirkung auf die Samenkeimung und den normalen Stoffwechsel ausübt und dadurch das Wachstum und die Entwicklung der Pflanzen hemmt 8,9. Zum Beispiel kann DEHP oxidative Schäden an Mesophyllzellen induzieren, den Gehalt an Chlorophyll und Osmolyten verringern und die antioxidative Enzymaktivität erhöhen, was schließlich zu einer Abnahme des Ertrags und der Qualität essbarer Pflanzen führt10,11. Die meisten bisherigen Studien über die Reaktion von Pflanzen auf DEHP-Stress konzentrierten sich jedoch auf oxidativen Stress und physiologische und biochemische Eigenschaften. Die entsprechenden Mechanismen, die mit dem pflanzlichen Stoffwechsel verbunden sind, sind weniger erforscht. Wurzelexsudate ist ein Oberbegriff, der Verbindungen beschreibt, die Pflanzenwurzeln absondern und in die Umwelt abgeben. Sie gelten als Interaktionsmedien zwischen Pflanzen und dem Boden der Rhizosphäre und spielen eine wichtige Rolle bei der Unterstützung des Pflanzenwachstums und der Pflanzenentwicklung12. Es ist bekannt, dass Wurzelexsudate etwa 30%-40% des gesamten photosynthetischenKohlenstoffs ausmachen 13. In verschmutzten Umgebungen sind Wurzelausscheidungen an der Verbesserung der Toleranz von Pflanzen gegenüber dem Stress von Schadstoffen durch Stoffwechsel oder äußeren Ausschluss beteiligt14. Folglich könnte ein tiefes Verständnis der Reaktion von Pflanzenwurzelexsudaten auf Verschmutzungsstress dazu beitragen, die zugrunde liegenden Mechanismen aufzudecken, die mit der Zellbiochemie und biologischen Phänomenen verbunden sind15.
Die Metabolomik-Technologie bietet eine effiziente Strategie zur gleichzeitigen Messung einer großen Anzahl von niedermolekularen Metaboliten in Zellen 16,17, Geweben18 und sogar Exsudaten von Organismen 19, einschließlich Zuckern, organischen Säuren, Aminosäuren und Lipiden. Im Vergleich zu herkömmlichen oder klassischen chemischen Analysemethoden erhöht der Metabolomik-Ansatz die Anzahl der nachweisbaren Metaboliten erheblich20, was dazu beitragen kann, Metaboliten mit höherem Durchsatz zu identifizieren und wichtige Stoffwechselwege zu identifizieren. Die Metabolomik ist im Forschungsbereich der biologischen Reaktion in Stressumgebungen, wie z. B. Schwermetalle21, neu auftretende Schadstoffe22 und Nanopartikel19, weit verbreitet. Die meisten dieser Studien an Pflanzen konzentrierten sich auf die metabolischen Veränderungen im inneren Pflanzengewebe, während nur wenige über die Reaktion von Wurzelexsudaten auf Umweltstress berichtet wurden. Ziel dieser Studie ist es daher, allgemeine Richtlinien für die Entnahme von Luzernewurzelexsudaten einzuführen, um den Einfluss von DEHP auf die Metabolitenproduktion zu untersuchen. Die Ergebnisse dienen als methodischer Leitfaden für die Folgestudie der pflanzlichen Metabolomik mittels DEHP.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Adonitol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td></td>
			<td>&#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alfalfa seeds</td>
			<td>Jiangsu Academy of Agricultural Sciences (Nanjing, China)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>BSA124S-CW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSTFA</td>
			<td>REGIS Technologies</td>
			<td></td>
			<td>with 1% TMCS, v/v</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Heraeus Fresco17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatographic column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DB-5MS (30 m &#215; 250 &#956;m &#215; 0.25 &#956;m)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di(2-ethylhexyl) phthalate</td>
			<td>Dr. Ehrenstorfer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAMEs</td>
			<td>Dr. Ehrenstorfer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas chromatography(GC)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>7890A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grinding instrument</td>
			<td>Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd</td>
			<td>JXFSTPRP-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spectrometer(MS)</td>
			<td>LECO</td>
			<td>PEGASUS HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>CNW Technologies</td>
			<td></td>
			<td>HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methoxyaminatio hydrochloride</td>
			<td>TCI</td>
			<td></td>
			<td>AR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Eppendorf Quality</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd</td>
			<td>DHG-9023A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridine</td>
			<td>Adamas</td>
			<td></td>
			<td>HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>statistical analysis software (pathway enrichment, topology)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIMCA16.0.2&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>statistical analysis software (OPLS-DA etc)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra low temperature freezer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Forma 900 series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound</td>
			<td>Shenzhen Fangao Microelectronics Co., Ltd</td>
			<td>YM-080S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum dryer</td>
			<td>Taicang Huamei biochemical instrument factory</td>
			<td>LNG-T98</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

collection of alfalfa root exudates to study the impact of di(2-ethylhexyl) phthalate on metabolite production

Wurzelexsudate sind die wichtigsten Medien der Informationskommunikation und des Energietransfers zwischen Pflanzenwurzeln und der Umgebung. Die Veränderung der Sekretion von Wurzelexsudaten ist in der Regel eine externe Entgiftungsstrategie für Pflanzen unter Stressbedingungen. Dieses Protokoll zielt darauf ab, allgemeine Richtlinien für die Sammlung von Luzernewurzelexsudaten einzuführen, um die Auswirkungen von Di(2-ethylhexyl)phthalat (DEHP) auf die Metabolitenproduktion zu untersuchen. Zunächst werden Luzerne-Sämlinge unter DEHP-Stress in einem hydroponischen Kulturexperiment gezüchtet. Zweitens werden die Pflanzen für 6 h in Zentrifugenröhrchen mit 50 ml sterilisiertem Reinstwasser überführt, um Wurzelexsudate zu sammeln. Anschließend werden die Lösungen in einem Vakuum-Gefriertrockner gefriergetrocknet. Die gefrorenen Proben werden extrahiert und mit Bis(trimethylsilyl)trifluoracetamid (BSTFA)-Reagenz derivatisiert. Anschließend werden die derivatisierten Extrakte mit einem Gaschromatographensystem in Verbindung mit einem Flugzeit-Massenspektrometer (GC-TOF-MS) gemessen. Die gewonnenen Metabolitendaten werden dann mit bioinformatischen Methoden analysiert. Differentielle Metaboliten und signifikant veränderte Stoffwechselwege sollten eingehend erforscht werden, um die Auswirkungen von DEHP auf Luzerne im Hinblick auf Wurzelexsudate aufzudecken.

In diesem Experiment wurden Luzernewurzelexsudate gesammelt, extrahiert und nach den oben genannten Methoden analysiert (Abbildung 1). Es wurden drei Behandlungsgruppen eingerichtet: Kontrollgruppe, niedrige Konzentration von DEHP (1 mg L−1) und hohe Konzentration von DEHP (10 mg L−1).
Im Chromatographen der Kontrollgruppe wurden insgesamt 778 Peaks detektiert, von denen 314 Metaboliten anhand der Massenspektren identifiziert werden konnt...

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Collection of Alfalfa Root Exudates to Study the Impact of Di2-ethylhexyl Phthalate on Metabolite Production

Die Sekretion von Wurzelexsudaten ist in der Regel eine externe Entgiftungsstrategie für Pflanzen unter Stressbedingungen. Dieses Protokoll beschreibt, wie die Wirkung von Xenobiotika auf Luzerne durch eine nicht zielgerichtete metabolomische Analyse bewertet werden kann.

Sammlung von Alfalfa-Wurzelexsudaten zur Untersuchung des Einflusses von Di(2-ethylhexyl)phthalat auf die Metabolitenproduktion

Root exudates are the main media of information communication and energy transfer between plant roots and the surrounding environment. The change in ...

Dieses Protokoll beschreibt, wie die Auswirkungen von Xenobiotika auf Luzerne während einer nicht zielgerichteten Metabolomik-Analyse bewertet werden können. Die Technik ist sehr einfach und bequem zu bedienen und es können mehr Arten von Wurzelexsudaten identifiziert werden. Dies hilft, den metabolomischen Fingerabdruck von Pflanzenwurzelexsudaten zu konstruieren.Beginnen Sie die Sterilisation der Medicago sativa- oder Luzernesamen, indem Sie die Samen 10 Minuten lang mit 0,1 % Natriumhypochlorit abspülen. Anschließend 30 Minuten lang mit 75%igem Ethylalkohol waschen. Spülen Sie die sterilisierten Samen anschließend mehrmals mit destilliertem Wasser ab.Und keimen Sie dann auf dem feuchten Filterpapier, das in eine sterile Petrischale gelegt wird. Bei 30 Grad Celsius im Dunkeln. Nach der Keimung 20 gleichmäßig gekeimte, große, pralle Samen in einen Pfropfkorb in einer mit Nährlösung gefüllten Kulturflasche geben.Stellen Sie alle Kulturflaschen in eine Wachstumskammer mit kontrollierten Bedingungen. Übertragen Sie nach zwei Wochen 15 einheitliche Luzerne-Sämlinge in eine neue Glasflasche, um sie für das Kulturexperiment einem Milligramm pro Kilogramm und 10 Milligramm pro Kilogramm DEHP-Stress auszusetzen. Wickeln Sie die Behandlungs- und Kontrollglasflaschen mit Aluminiumfolie und Parafilm ein, um eine Photolyse und Verflüchtigung des DEHP zu verhindern.Ergänzen Sie die Nährlösung täglich, um den Flüssigkeitsstand aufrechtzuerhalten. Platzieren und drehen Sie die Flaschen alle zwei Tage nach dem Zufallsprinzip, um konsistente Wachstumsbedingungen für die Luzerne-Sämlinge zu gewährleisten. Entfernen Sie nach sieben Tagen Anbau die Luzerne-Sämlinge aus den Flaschen.Und waschen Sie sie mehrmals mit Reinstwasser, um sie auf die Sammlung von Wurzelausscheidungen vorzubereiten. Beginnen Sie das Experiment zur Sammlung von Wurzelexsudat, indem Sie 10 gleichmäßige Luzernesämlinge in Zentrifugenröhrchen geben, die mit 50 Millilitern sterilisiertem deionisiertem Wasser gefüllt sind. Um Wurzelausscheidungen zu sammeln, halten Sie die Schläuche sechs Stunden lang aufrecht und tauchen Sie die Wurzeln in Wasser.Wenn Sie fertig sind, wickeln Sie die Zentrifugenröhrchen mit Alufolie ein, um die Wurzeln vor Licht zu schützen. Entfernen Sie die Pflanzen und gefrieren Sie die gesammelte Flüssigkeit für die Erstellung von Metabolitenprofilen. Fahren Sie mit dem Extraktionsexperiment fort, indem Sie den gefriergetrockneten Proben 1,8 Milliliter Extraktionslösung hinzufügen.30 Sekunden im Wirbel. Wenden Sie anschließend die Ultraschallwellen 10 Minuten lang in einem Eiswasserbad auf die Röhren an. Vor dem Zentrifugieren der Proben.200 Mikroliter Überstand vorsichtig in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen umfüllen. Saugen Sie 45 Mikroliter Überstand aus dem Zentrifugenröhrchen ab und mischen Sie es mit einem Endvolumen von 270 Mikrolitern in Qualitätskontroll- oder QC-Proben. Sobald Sie fertig sind, gefrieren Sie die Extrakte in einem Vakuumkonzentrator.Sobald die Trocknung abgeschlossen ist, fügen Sie fünf Mikroliter interne Standard-Ribonuklease hinzu und trocknen Sie weiter. Nach dem Verdampfen werden 30 Mikroliter Methoxyaminierungshydrochloridlösung hinzugefügt und die Röhrchen 30 Minuten lang bei 80 Grad Celsius inkubiert. Als nächstes fügen Sie den Proben 40 Mikroliter BSTFA-Reagenz hinzu, bevor Sie die Röhrchen für 1,5 Stunden zur Derivatisierung bei 70 Grad Celsius platzieren.Sobald die Inkubation beendet ist und die derivatisierte Probe Raumtemperatur erreicht hat, fügen Sie den derivatisierten Proben fünf Mikroliter in Chloroform gelöste Fettsäuremethylester hinzu. Mit einer Kapillarsäule von 30 mal 250 Mikrometern mal 0,25 Mikrometer trennen Sie einen Mikroliter der Wurzelexsudate mit einem Trägergas Helium bei einem Durchfluss von 1,0 Milliliter pro Minute. Stellen Sie die Einspritztemperatur auf 280 Grad Celsius ein.Und halten Sie die Temperatur der Transferleitung bei 280 Grad Celsius. Stellen Sie das Ofenprogramm auf Trennung ein. Nach dem Trennen der Extrakte wird eine Massenspektrometrie im Elektronenkollisionsmodus mit einer Energie von minus 70 Elektronenvolt durchgeführt.Halten Sie die Temperatur der Ionenquelle bei 250 Grad Celsius. Erfassen Sie Massenspektren mit dem Full-Scan-Überwachungsmodus mit einem Massenscanbereich von 50 bis 500 Masse durch Ladung bei einer Rate von 12,5 Spektren pro Sekunde. 778 Peaks wurden im Chromatographen der Kontrollprobe nachgewiesen.Davon wurden 314 Metaboliten anhand der Massenspektren identifiziert. Die Säuren wurden weiter unterteilt in Fettsäuren, Aminosäuren, organische Säuren und Phenolsäuren. Darüber hinaus wurden auch einige gängige Substanzen, die im Allgemeinen in den Wurzelexsudaten vorhanden sind, in Luzernewurzelexsudaten nachgewiesen, darunter Pyrimidine, Hydroxypyrimidine, Flavonoide, Phenole, Ketone, Pyrimidine und Diterpene.Basierend auf dem VIP-Score wurde eine Heatmap erstellt, um die Variation der differentiellen Metaboliten zwischen verschiedenen DEHP-Behandlungen zu visualisieren. Im Vergleich zu den Kontrollproben veränderte die DEHP-Exposition den Gehalt an 50 Metaboliten und Luzernewurzelexsudaten signifikant. Enthält hauptsächlich einige Kohlenhydrate und niedermolekulare organische Säuren.Die Analyse der Stoffwechselwege zeigte, dass DEHP den Stoffwechsel von Kohlenhydraten, die das Produkt der Photosynthese sind, signifikant hemmt, was darauf hindeutet, dass DEHP die Photosynthese von Luzerne bis zu einem gewissen Grad unterdrücken kann. DEHP fördert den Stoffwechsel von Fettsäuren, die helfen, Stress durch DEHP zu widerstehen. Zumindest die Samenwurzelexsudate sollten für jede Behandlung durchgeführt werden, um eine genaue Analyse der metabolomischen Daten zu gewährleisten. Wir können differentielle Metabolisierungen bestimmen und die wichtigen Regeln im Umweltverhalten von Schadstoffen weiter untersuchen.Die Wechselwirkungen zwischen Pflanzen und der weiteren biologischen Gemeinschaft können vor allem mit dieser Methode entschlüsselt werden.

Research

JoVE Journal

Environment

Collection of Alfalfa Root Exudates to Study the Impact of Di(2-ethylhexyl) Phthalate on Metabolite Production

Transcript and Metabolite Profiling for the Evaluation of Tobacco Tree and Poplar as Feedstock for the Bio-based Industry

Transcript und Metabolite Profiling für die Beurteilung von Tabakbaum und Pappel als Rohstoff für die Bio-basierte Industrie

The global demand for food, feed, energy, and water poses extraordinary challenges for future generations. It is evident that robust platforms for the ...

Forschung

Umwelt

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