Name: collection of alfalfa root exudates to study the impact of di(2-ethylhexyl) phthalate on metabolite production
Uploaded: 2023-06-02T12:45:00
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इस काम को संयुक्त रूप से चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (41877139), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (41991335) की प्रमुख परियोजनाओं, चीन के राष्ट्रीय कुंजी अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (2016वाईएफडी0800204), जियांग्सू प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (संख्या बीके 20161616), "135" योजना और चीनी विज्ञान अकादमी (आईएसएसएसआईपी 1615) के फ्रंटियर ्स प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया गया था।

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य एक सामान्य पाइपलाइन प्रदान करना है, एक हाइड्रोपोनिक कल्चर प्रयोग से मेटाबोलिक विश्लेषण तक, अल्फाल्फा रूट एक्स्यूडेट्स पर डीईएचपी के प्रभाव को निर्धारित करना।
1. ...

यह प्रोटोकॉल डीईएचपी तनाव के तहत अल्फाल्फा के रूट एक्स्यूडेट्स को इकट्ठा करने और मापने के साथ-साथ मेटाबोलोम डेटा का विश्लेषण करने के तरीके के बारे में सामान्य मार्गदर्शन प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल...

डीआई (2-एथिलहेक्सिल) थैलेट (डीईएचपी) एक सिंथेटिक रासायनिक यौगिक है जो विभिन्न प्लास्टिक और पॉलिमर में प्लास्टिसाइज़र के रूप में व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है ताकि उनकी प्लास्टिसिटी और ताकत में सुधार हो सके। पिछले कुछ वर्षों में, अध्ययनों की बढ़ती संख्या ने सुझाव दिया है कि डीईएचपी एक अंतःस्रावी अवरोधक है और मनुष्यों औरअन्य जानवरों के श्वसन, तंत्रिका और प्रजनन प्रणाली पर प्रतिकूल प्रभाव पड़ता है। इसके स्वास्थ्य जोखिम को ध्यान में रखते हुए, संयुक्त राज्य अमेरिका पर्यावरण संरक्षण एजेंसी, यूरोपीय संघ और चीन के पर्यावरण निगरानी केंद्र ने डीईएचपी को प्राथमिकता प्रदूषकों की सूची में वर्गीकृत किया है। प्लास्टिक मल्चिंग और जैविक उर्वरकों के अनुप्रयोग, अपशिष्ट जल के साथ सिंचाई और कीचड़फार्म अनुप्रयोग के कारण मिट्टी को पर्यावरण में डीईएचपी का एक महत्वपूर्ण सिंक माना जाता है। जैसा कि अपेक्षित था, डीईएचपी को खेत की मिट्टी में सर्वव्यापी रूप से पाया गया है, जिसकीसामग्री चीन के कुछ क्षेत्रों में सूखे मिट्टी के प्रति किलोग्राम मिलीग्राम तक भी पहुंच जाती है। डीईएचपी मुख्य रूप से जड़ों के माध्यम से पौधों में प्रवेश कर सकता है औरमिट्टी के पारिस्थितिक तंत्र में विभिन्न ट्रॉफिक स्तरों पर जैवआवर्धन से गुजर सकता है। इसलिए, हाल के दशकों में पौधों में डीईएचपी-प्रेरित तनाव के बारे में महत्वपूर्ण चिंता जताई गई है।
पौधे आमतौर पर डीईएचपी एक्सपोजर के प्रति संवेदनशील होते हैं। डीईएचपी तनाव को बीज अंकुरण और सामान्य चयापचय पर प्रतिकूल प्रभाव डालने के लिए देखा गया है, जिससे पौधे की वृद्धि और विकासमें बाधा आती है। उदाहरण के लिए, डीईएचपी मेसोफिल कोशिकाओं को ऑक्सीडेटिव क्षति को प्रेरित कर सकता है, क्लोरोफिल और ऑस्मोलाइट की सामग्री को कम कर सकता है, और एंटीऑक्सिडेटिव एंजाइम गतिविधियों को बढ़ा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप अंततःखाद्य पौधों की उपज और गुणवत्ता में गिरावट आती है। हालांकि, डीईएचपी तनाव के लिए पौधों की प्रतिक्रिया पर पिछले अधिकांश अध्ययनों ने ऑक्सीडेटिव तनाव और शारीरिक और जैव रासायनिक विशेषताओं पर ध्यान केंद्रित किया है। पौधे के चयापचय से जुड़े संबंधित तंत्र कम अध्ययन किए जाते हैं। रूट एक्स्यूडेट्स एक सामान्य शब्द है जो यौगिकों का वर्णन करता है जो पौधे की जड़ें स्रावित होती हैं और पर्यावरण में छोड़ती हैं। उन्हें पौधों और राइजोस्फीयर मिट्टी के बीच बातचीत मीडिया के रूप में माना जाता है, जो पौधे की वृद्धिऔर विकास का समर्थन करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। यह अच्छी तरह से ज्ञात है कि रूट एक्स्यूडेट्स सभी प्रकाश संश्लेषक कार्बन13 का लगभग 30% -40% है। प्रदूषित वातावरण में, रूट एक्स्यूडेट्स चयापचय या बाहरी बहिष्करण के माध्यम से प्रदूषकों के तनाव के लिए पौधों की सहनशीलता में सुधार करने में शामिलहैं। नतीजतन, प्रदूषण तनाव के लिए पौधे की जड़ की प्रतिक्रिया की गहरी समझ सेल जैव रसायन और जैविक घटनासे जुड़े अंतर्निहित तंत्र को प्रकट करने में मदद कर सकती है।
मेटाबोलॉमिक्स तकनीक कोशिकाओं 16,17, ऊतकों18, और यहां तक कि शर्करा, कार्बनिक एसिड, अमीनो एसिड और लिपिड सहित जीवों के एक्सयूडेट्स19 के भीतर एक साथ बड़ी संख्या में छोटे अणु मेटाबोलाइट्स को मापने के लिए एक कुशल रणनीति प्रदान करती है। पारंपरिक या शास्त्रीय रासायनिक विश्लेषण विधियों की तुलना में, मेटाबोलॉमिक्स दृष्टिकोण मेटाबोलाइट्स की संख्या को बहुत बढ़ाता है जिन्हें20 का पता लगाया जा सकता है, जो उच्च-थ्रूपुट तरीके से मेटाबोलाइट्स की पहचान करने और प्रमुख चयापचय मार्गों की पहचान करने में मदद कर सकते हैं। मेटाबोलॉमिक्स का व्यापक रूप से तनाव वातावरण में जैविक प्रतिक्रिया के अनुसंधान क्षेत्र में उपयोग किया गया है, जैसे कि भारी धातु21, उभरते प्रदूषक22, और नैनोकणों19। पौधों पर इन अध्ययनों में से अधिकांश ने आंतरिक पौधों के ऊतकों में चयापचय परिवर्तनों पर ध्यान केंद्रित किया है, जबकि कुछ को पर्यावरणीय तनाव के लिए रूट एक्स्यूडेट्स की प्रतिक्रिया पर रिपोर्ट किया गया है। इसलिए, इस अध्ययन का उद्देश्य मेटाबोलाइट उत्पादन पर डीईएचपी के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए अल्फाल्फा रूट एक्स्यूडेट्स के संग्रह के लिए सामान्य दिशानिर्देश पेश करना है। परिणाम डीईएचपी द्वारा प्लांट मेटाबोलॉमिक्स के अनुवर्ती अध्ययन के लिए एक विधि मार्गदर्शन प्रदान करेंगे।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adonitol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td></td>
			<td>&#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alfalfa seeds</td>
			<td>Jiangsu Academy of Agricultural Sciences (Nanjing, China)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>BSA124S-CW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSTFA</td>
			<td>REGIS Technologies</td>
			<td></td>
			<td>with 1% TMCS, v/v</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Heraeus Fresco17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatographic column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DB-5MS (30 m &#215; 250 &#956;m &#215; 0.25 &#956;m)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di(2-ethylhexyl) phthalate</td>
			<td>Dr. Ehrenstorfer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAMEs</td>
			<td>Dr. Ehrenstorfer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas chromatography(GC)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>7890A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grinding instrument</td>
			<td>Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd</td>
			<td>JXFSTPRP-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spectrometer(MS)</td>
			<td>LECO</td>
			<td>PEGASUS HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>CNW Technologies</td>
			<td></td>
			<td>HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methoxyaminatio hydrochloride</td>
			<td>TCI</td>
			<td></td>
			<td>AR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Eppendorf Quality</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd</td>
			<td>DHG-9023A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridine</td>
			<td>Adamas</td>
			<td></td>
			<td>HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>statistical analysis software (pathway enrichment, topology)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIMCA16.0.2&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>statistical analysis software (OPLS-DA etc)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra low temperature freezer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Forma 900 series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound</td>
			<td>Shenzhen Fangao Microelectronics Co., Ltd</td>
			<td>YM-080S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum dryer</td>
			<td>Taicang Huamei biochemical instrument factory</td>
			<td>LNG-T98</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

collection of alfalfa root exudates to study the impact of di(2-ethylhexyl) phthalate on metabolite production

रूट एक्स्यूडेट्स पौधे की जड़ों और आसपास के वातावरण के बीच सूचना संचार और ऊर्जा हस्तांतरण का मुख्य माध्यम हैं। रूट एक्स्यूडेट्स के स्राव में परिवर्तन आमतौर पर तनाव की स्थिति में पौधों के लिए एक बाहरी विषहरण रणनीति है। इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य मेटाबोलाइट उत्पादन पर डाई (2-एथिलहेक्सिल) थैलेट (डीईएचपी) के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए अल्फाल्फा रूट एक्स्यूडेट्स के संग्रह के लिए सामान्य दिशानिर्देश पेश करना है। सबसे पहले, अल्फाल्फा के पौधों को हाइड्रोपोनिक कल्चर प्रयोग में डीईएचपी तनाव के तहत उगाया जाता है। दूसरा, पौधों को सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित किया जाता है जिसमें 6 घंटे के लिए 50 मिलीलीटर स्टरलाइज्ड अल्ट्राप्योर पानी होता है ताकि रूट एक्स्यूडेट्स एकत्र किए जा सकें। समाधान को तब वैक्यूम फ्रीज ड्रायर में फ्रीज-सुखाया जाता है। जमे हुए नमूनों को बीआईएस (ट्राइमिथाइलसिलिल)) ट्राइफ्लोरोसिटामाइड (बीएसटीएफए) अभिकर्मक के साथ निकाला और व्युत्पन्न किया जाता है। इसके बाद, व्युत्पन्न अर्क को गैस क्रोमैटोग्राफ सिस्टम का उपयोग करके मापा जाता है जो टाइम-ऑफ-फ्लाइट मास स्पेक्ट्रोमीटर (जीसी-टीओएफ-एमएस) के साथ युग्मित होता है। अधिग्रहित मेटाबोलाइट डेटा का विश्लेषण जैव सूचना विज्ञान विधियों के आधार पर किया जाता है। रूट एक्स्यूडेट्स के मद्देनजर अल्फाल्फा पर डीईएचपी के प्रभाव को प्रकट करने के लिए अंतर मेटाबोलाइट्स और महत्वपूर्ण रूप से परिवर्तित चयापचय मार्गों का गहराई से पता लगाया जाना चाहिए।

इस प्रयोग में, अल्फाल्फा रूट एक्स्यूडेट्स को उपरोक्त विधियों (चित्रा 1) के अनुसार एकत्र, निकाला और विश्लेषण किया गया था। तीन उपचार समूह स्थापित किए गए थे: नियंत्रण, डीईएचपी की कम एकाग्रता (1 मि?...

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Collection of Alfalfa Root Exudates to Study the Impact of Di2-ethylhexyl Phthalate on Metabolite Production

रूट एक्स्यूडेट्स का स्राव आमतौर पर तनाव की स्थिति में पौधों के लिए एक बाहरी विषहरण रणनीति है। यह प्रोटोकॉल बताता है कि गैर-लक्षित मेटाबोलिक विश्लेषण के माध्यम से अल्फाल्फा पर ज़ेनोबायोटिक्स के प्रभाव का आकलन कैसे किया जाए।

मेटाबोलाइट उत्पादन पर डीआई (2-एथिलहेक्सिल) थैलेट के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए अल्फाल्फा रूट एक्स्यूडेट्स का संग्रह

Root exudates are the main media of information communication and energy transfer between plant roots and the surrounding environment. The change in ...

यह प्रोटोकॉल बताता है कि गैर-लक्षित मेटाबोलॉमिक्स विश्लेषण के दौरान अल्फाल्फा पर ज़ेनोबायोटिक्स के प्रभाव का आकलन कैसे करें। तकनीक ऑपरेशन के लिए बहुत सरल और सुविधाजनक है और अधिक प्रकार के रूट एक्स्यूडेट्स की पहचान की जा सकती है। जो पौधे की जड़ के चयापचय फिंगरप्रिंटिंग के निर्माण में मदद करता है।10 मिनट के लिए 0.1% सोडियम हाइपोक्लोराइट के साथ बीज धोकर मेडिकागो सैटिवा या अल्फाल्फा बीज की नसबंदी शुरू करें। इसके बाद 30 मिनट के लिए 75% एथिल अल्कोहल के साथ धोएं। इसके बाद, आसुत जल के साथ कई बार निष्फल बीज धोएं।और फिर उन्हें बाँझ पेट्री डिश में रखे नम फिल्टर पेपर पर अंकुरित करें। अंधेरे में 30 डिग्री सेल्सियस पर। अंकुरण के बाद, पोषक तत्वों के घोल से भरी एक कल्चर बोतल में एक एनग्राफमेंट टोकरी पर 20 समान रूप से अंकुरित बड़े मोटे बीज स्थानांतरित करें।सभी संस्कृति की बोतलों को नियंत्रित परिस्थितियों वाले विकास कक्ष में रखें। दो सप्ताह के बाद, 15 समान अल्फाल्फा रोपाई को एक नई कांच की बोतल में स्थानांतरित करें ताकि उन्हें एक मिलीग्राम प्रति किलोग्राम और 10 मिलीग्राम प्रति किलोग्राम डीईएचपी तनाव के संपर्क में लाया जा सके। डीईएचपी के फोटोलिसिस और वाष्पीकरण को रोकने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी और पैराफिल्म के साथ उपचार लपेटें और कांच की बोतलों को नियंत्रित करें।तरल स्तर को बनाए रखने के लिए रोजाना पोषक तत्व समाधान को पूरक करें। अल्फाल्फा के पौधों के लिए लगातार विकास की स्थिति सुनिश्चित करने के लिए हर दो दिनों में बोतलों को बेतरतीब ढंग से रखें और घुमाएं। खेती के सात दिनों के बाद, बोतलों से अल्फाल्फा के पौधे हटा दें।और उन्हें रूट एक्स्यूडेट्स के संग्रह के लिए तैयार करने के लिए कई बार अल्ट्राप्योर पानी से धोएं। 50 मिलीलीटर निष्फल विआयनीकृत पानी से भरे सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में 10 समान अल्फाल्फा रोपाई को स्थानांतरित करके रूट एक्स्यूडेट संग्रह प्रयोग शुरू करें। रूट एक्स्यूडेट्स को इकट्ठा करने के लिए, ट्यूबों को छह घंटे तक सीधा रखें और जड़ों को पानी में डुबोएं।एक बार हो जाने के बाद, जड़ों को प्रकाश से बचाने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को लपेटें। पौधों को हटा दें और मेटाबोलाइट प्रोफाइलिंग के लिए एकत्र किए गए तरल को फ्रीज करें। फ्रीज सूखे नमूनों में 1.8 मिलीलीटर निष्कर्षण समाधान जोड़कर निष्कर्षण प्रयोग के साथ आगे बढ़ें।30 सेकंड के लिए भंवर में। इसके बाद, बर्फ के पानी के स्नान में 10 मिनट के लिए ट्यूबों पर अल्ट्रासाउंड तरंगों को लागू करें। नमूनों को सेंट्रीफ्यूज करने से पहले।1.5 मिलीलीटर माइक्रो सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 200 माइक्रोलीटर सुपरनैटेंट को सावधानीपूर्वक स्थानांतरित करें। सेंट्रीफ्यूज ट्यूब से सतह पर तैरनेवाला के 45 माइक्रोलीटर को एस्पिरेट करें और इसे 270 माइक्रोलीटर की अंतिम मात्रा में गुणवत्ता नियंत्रण या क्यूसी नमूने में मिलाएं। एक बार हो जाने के बाद, एक वैक्यूम कंसंट्रेटर में अर्क को फ्रीज करें।एक बार सुखाने के बाद, आंतरिक मानक राइबोन्यूक्लिज़ के पांच माइक्रोलीटर जोड़ें और सूखना जारी रखें। वाष्पीकरण के बाद, मेथॉक्सीमिनेशन हाइड्रोक्लोराइड समाधान के 30 माइक्रोलीटर जोड़ें और ट्यूबों को 30 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। इसके बाद, उपहास के लिए 1.5 घंटे के लिए ट्यूबों को 70 डिग्री सेल्सियस पर रखने से पहले नमूनों में बीएसटीएफए अभिकर्मक के 40 माइक्रोलीटर जोड़ें।एक बार जब इनक्यूबेशन खत्म हो जाता है और व्युत्पन्न नमूना कमरे के तापमान तक पहुंच जाता है, तो व्युत्पन्न नमूनों में क्लोरोफॉर्म में घुलने वाले फैटी एसिड मिथाइल एस्टर के पांच माइक्रोलीटर जोड़ें। 30 मीटर से 250 माइक्रोमीटर बाय 0.25 माइक्रोमीटर मापने वाले केशिका स्तंभ का उपयोग करके, 1.0 मिलीलीटर प्रति मिनट की प्रवाह दर पर वाहक गैस हीलियम के साथ जड़ के एक माइक्रोलीटर को अलग करें। इंजेक्शन का तापमान 280 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।और स्थानांतरण रेखा का तापमान 280 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें। पृथक्करण के लिए ओवन प्रोग्राम सेट करें। अर्क को अलग करने के बाद, माइनस 70 इलेक्ट्रॉन वोल्ट की ऊर्जा के साथ इलेक्ट्रॉन टकराव मोड में मास स्पेक्ट्रोमेट्री करें।आयन स्रोत तापमान को 250 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें। प्रति सेकंड 12.5 स्पेक्ट्रा की दर से चार्ज द्वारा 50 से 500 द्रव्यमान की मास स्कैन रेंज के साथ पूर्ण स्कैन मॉनिटरिंग मोड का उपयोग करके मास स्पेक्ट्रा प्राप्त करें। नियंत्रण नमूने के क्रोमैटोग्राफ में 778 चोटियों का पता लगाया गया था।जिनमें से 314 मेटाबोलाइट्स की पहचान मास स्पेक्ट्रा के अनुसार की गई थी। एसिड को आगे फैटी एसिड, अमीनो एसिड, कार्बनिक एसिड और फेनोलिक एसिड में विभाजित किया गया था। इसके अलावा, आमतौर पर रूट एक्स्यूडेट्स में मौजूद कुछ सामान्य पदार्थों का पता अल्फाल्फा रूट एक्स्यूडेट्स में भी लगाया गया था, जिसमें पाइरिमिडाइन, हाइड्रॉक्सी पाइरिमिडीन, फ्लेवोनोइड्स, फिनोल, केटोन्स, पाइरिमिडाइन और डाइटरपेन शामिल थे।विभिन्न डीईएचपी उपचारों के बीच अंतर मेटाबोलाइट्स में भिन्नता की कल्पना करने के लिए वीआईपी स्कोर के आधार पर एक हीट मैप प्लॉट किया गया था। नियंत्रण नमूनों की तुलना में, डीईएचपी एक्सपोजर ने 50 मेटाबोलाइट्स और अल्फाल्फा रूट एक्स्यूडेट्स की सामग्री को काफी बदल दिया। मुख्य रूप से कुछ कार्बोहाइड्रेट और कम आणविक भार कार्बनिक एसिड सहित।चयापचय मार्ग विश्लेषण से पता चला है कि डीईएचपी ने कार्बोहाइड्रेट के चयापचय को काफी हद तक रोक दिया है जो प्रकाश संश्लेषण का उत्पाद है, यह दर्शाता है कि डीईएचपी अल्फाल्फा के प्रकाश संश्लेषण को कुछ हद तक दबा सकता है, डीईएचपी को फैटी एसिड के चयापचय को बढ़ावा देने के लिए देखा गया था, जो डीईएचपी से तनाव का विरोध करने में मदद करता है। सटीक मेटाबोलिक डेटा विश्लेषण सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक उपचार के लिए कम से कम बीज रूट एक्स्यूडेट्स का प्रदर्शन किया जाना चाहिए। हम विभेदक चयापचय निर्धारित कर सकते हैं और दूषित पदार्थों के पर्यावरणीय व्यवहार में महत्वपूर्ण नियमों की जांच कर सकते हैं।पौधों और व्यापक क्षेत्र जैविक समुदाय के बीच बातचीत को ज्यादातर इस विधि का उपयोग करके समझा जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Environment

Collection of Alfalfa Root Exudates to Study the Impact of Di(2-ethylhexyl) Phthalate on Metabolite Production

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