Name: collection of alfalfa root exudates to study the impact of di(2-ethylhexyl) phthalate on metabolite production
Uploaded: 2023-06-02T12:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Collection of Alfalfa Root Exudates to Study the Impact of Di2-ethylhexyl Phthalate on Metabolite Production at JoVE.com

この研究は、中国国家自然科学基金会(41877139)、中国国家自然科学財団の主要プロジェクト(41991335)、中国国家重点研究開発プログラム(2016YFD0800204)、江蘇省自然科学基金会(No. BK20161616)、「135」計画、および中国科学院のフロンティアプログラム(ISSASIP1615)。

このプロトコルの目的は、水耕栽培実験からメタボローム分析までの一般的なパイプラインを提供し、アルファルファの根の滲出液に対するDEHPの効果を定量化することです。
1. 水耕栽培実験
注:このプロトコルは、さまざまな濃度のDEHPのストレス下でアルファルファ(メディカゴサティバ)の苗を得るために設計されたアルファルフ?...

このプロトコルは、DEHPストレス下でアルファルファの根の滲出液を収集および測定する方法、およびメタボロームデータを分析する方法に関する一般的なガイダンスを提供します。このプロトコルのいくつかの重要なステップに細心の注意を払う必要があります。水耕栽培実験では、アルファルファの苗木を、異なる濃度のDEHPを含む栄養溶液で満たされたガラス瓶で水耕栽培しました。ガ?...

フタル酸ジ(2-エチルヘキシル)(DEHP)は、可塑性と強度を向上させるための可塑剤としてさまざまなプラスチックやポリマーに広く使用されている合成化合物です。過去数年間で、DEHPが内分泌かく乱物質であり、人間や他の動物の呼吸器系、神経系、生殖器系に悪影響を与えることを示唆する研究が増えています1,2,3。その健康リスクを考慮して、米国環境保護庁、欧州連合、および中国環境モニタリングセンターはすべて、優先汚染物質のリストにDEHPを分類しています。土壌は、プラスチックマルチングと有機肥料の適用、廃水による灌漑、および汚泥農場の適用により、環境中のDEHPの重要なシンクと見なされてきました4。予想通り、DEHPは農地の土壌で遍在的に検出されており、その含有量は中国の一部の地域では乾燥土壌1キログラムあたり最大ミリグラムにまで達しています5,6。DEHPは主に根を介して植物に入り、土壌生態系のさまざまな栄養レベルで生物濃縮を受けることができます7。したがって、ここ数十年にわたって、植物におけるDEHP誘発ストレスについて重大な懸念が提起されてきました。
植物は通常、DEHP曝露に対して脆弱です。DEHPストレスは、種子の発芽と正常な代謝に悪影響を及ぼし、それによって植物の成長と発達を阻害することが観察されています8,9。例えば、DEHPは葉肉細胞に酸化的損傷を誘発し、クロロフィルおよび浸透圧の含有量を減少させ、抗酸化酵素活性を上昇させ、最終的には食用植物の収量および品質を低下させる可能性がある10,11。しかし、DEHPストレスに対する植物の応答に関する以前の研究のほとんどは、酸化ストレスと生理学的および生化学的特性に焦点を当ててきました。植物の代謝に関連する対応するメカニズムはあまり研究されていません。根の滲出液は、植物の根が分泌し、環境に放出する化合物を表す総称です。それらは植物と根圏土壌の間の相互作用媒体と考えられており、植物の成長と発達をサポートする上で重要な役割を果たしています12。根の滲出液がすべての光合成炭素13の約30%〜40%を占めることはよく知られています。汚染された環境では、根の滲出液は、代謝または外部排除を通じて汚染物質のストレスに対する植物の耐性を改善することに関与しています14。結果として、汚染ストレスに対する植物の根の滲出液の応答を深く理解することは、細胞の生化学および生物学的現象に関連する根本的なメカニズムを明らかにするのに役立つ可能性があります15。
メタボロミクス技術は、細胞16、17、組織18、さらには糖、有機酸、アミノ酸、脂質を含む生物19の滲出液内の多数の低分子代謝物を同時に測定するための効率的な戦略を提供します。従来または従来の化学分析法と比較して、メタボロミクスアプローチは検出可能な代謝物の数を大幅に増加させ20、これはより高いスループットの方法で代謝物を同定し、主要な代謝経路を特定するのに役立ちます。メタボロミクスは、重金属21、新興汚染物質22、ナノ粒子19などのストレス環境における生物学的応答の研究分野で広く使用されています。植物に関するこれらの研究のほとんどは、植物内部の代謝変化に焦点を当てていますが、環境ストレスに対する根の滲出液の反応について報告されたものはほとんどありません。したがって、この研究の目的は、アルファルファ根の滲出液を収集するための一般的なガイドラインを導入することです 代謝産物産生に対するDEHPの影響を研究します。この結果は、DEHPによる植物メタボロミクスの追跡調査のためのメソッドガイダンスを提供します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adonitol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td></td>
			<td>&#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alfalfa seeds</td>
			<td>Jiangsu Academy of Agricultural Sciences (Nanjing, China)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>BSA124S-CW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSTFA</td>
			<td>REGIS Technologies</td>
			<td></td>
			<td>with 1% TMCS, v/v</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Heraeus Fresco17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatographic column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DB-5MS (30 m &#215; 250 &#956;m &#215; 0.25 &#956;m)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di(2-ethylhexyl) phthalate</td>
			<td>Dr. Ehrenstorfer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAMEs</td>
			<td>Dr. Ehrenstorfer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas chromatography(GC)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>7890A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grinding instrument</td>
			<td>Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd</td>
			<td>JXFSTPRP-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spectrometer(MS)</td>
			<td>LECO</td>
			<td>PEGASUS HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>CNW Technologies</td>
			<td></td>
			<td>HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methoxyaminatio hydrochloride</td>
			<td>TCI</td>
			<td></td>
			<td>AR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Eppendorf Quality</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd</td>
			<td>DHG-9023A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridine</td>
			<td>Adamas</td>
			<td></td>
			<td>HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>statistical analysis software (pathway enrichment, topology)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIMCA16.0.2&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>statistical analysis software (OPLS-DA etc)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra low temperature freezer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Forma 900 series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound</td>
			<td>Shenzhen Fangao Microelectronics Co., Ltd</td>
			<td>YM-080S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum dryer</td>
			<td>Taicang Huamei biochemical instrument factory</td>
			<td>LNG-T98</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

collection of alfalfa root exudates to study the impact of di(2-ethylhexyl) phthalate on metabolite production

根の滲出液は、植物の根と周囲の環境との間の情報通信とエネルギー伝達の主要な媒体です。根の滲出液の分泌の変化は、通常、ストレス条件下での植物の外部解毒戦略です。このプロトコルは、アルファルファ根の滲出液を収集するための一般的なガイドラインを導入して、フタル酸ジ(2-エチルヘキシル)(DEHP)が代謝産物産生に与える影響を研究することを目的としています。まず、水耕栽培実験においてアルファルファ苗をDEHPストレス下で生育させる。次に、植物を50mLの滅菌超純水を含む遠沈管に6時間移し、根の滲出液を採取します。次いで、溶液を真空凍結乾燥機中で凍結乾燥する。凍結サンプルを抽出し、ビス(トリメチルシリル))トリフルオロアセトアミド(BSTFA)試薬で誘導体化します。続いて、誘導体化された抽出物は、飛行時間型質量分析計(GC-TOF-MS)と組み合わせたガスクロマトグラフシステムを使用して測定されます。取得した代謝物データは、バイオインフォマティクス手法に基づいて分析されます。根の滲出液を考慮してアルファルファに対するDEHPの影響を明らかにするために、異なる代謝産物と有意に変化した代謝経路を深く調査する必要があります。.

この実験では、アルファルファの根の滲出液を上記の方法に従って収集、抽出、および分析しました(図1)。対照、低濃度のDEHP(1 mg L−1)、および高濃度のDEHP(10 mg L−1)の3つの治療群が設定されました。
コントロールのクロマトグラフで合計778のピークが検出され、そのうち314の代謝産物がマススペクトルに従って識別できました。 <s...

Watch this Scientific Journal Video about Collection of Alfalfa Root Exudates to Study the Impact of Di2-ethylhexyl Phthalate on Metabolite Production at JoVE.com

Collection of Alfalfa Root Exudates to Study the Impact of Di2-ethylhexyl Phthalate on Metabolite Production

根の滲出液の分泌は、通常、ストレス条件下での植物の外部解毒戦略です。このプロトコルでは、非標的メタボローム分析 を介して アルファルファに対する生体異物の影響を評価する方法について説明します。

代謝産物生産に対するフタル酸ジ(2-エチルヘキシル)の影響を研究するためのアルファルファ根滲出液の収集

Root exudates are the main media of information communication and energy transfer between plant roots and the surrounding environment. The change in ...

このプロトコルでは、非標的メタボロミクス分析中にアルファルファに対する生体異物の影響を評価する方法について説明します。この技術は非常に単純で操作に便利であり、より多くの種類の根滲出液を特定することができます。これは、植物の根の滲出液のメタボロームフィンガープリントを構築するのに役立ちます。メディカゴサティバまたはアルファルファ種子の滅菌は、種子を0.1%次亜塩素酸ナトリウムで10分間すすぐことから始めます。続いて、75%エチルアルコールで30分間洗浄した。次に、滅菌した種子を蒸留水で数回すすいでください。そして、滅菌シャーレに入れた湿ったろ紙の上でそれらを発芽させます。暗闇の中で摂氏30度で。発芽後、均一に発芽した大きなふっくらとした種子20個を、栄養液で満たされた培養瓶の生着バスケットに移します。すべての培養ボトルを、制御された条件を持つ成長チャンバーに入れます。2週間後、15本の均一なアルファルファ苗を新しいガラス瓶に移し、培養実験のために1キログラムあたり1ミリグラムと1キログラムあたり10ミリグラムのDEHPストレスにさらします。DEHPの光分解と揮発を防ぐために、処理および制御ガラス瓶をアルミホイルとパラフィルムで包みます。液体レベルを維持するために、毎日栄養溶液を補給します。アルファルファの苗の一貫した成長条件を確保するために、2日ごとにボトルをランダムに配置して回転させます。7日間の栽培後、アルファルファの苗をボトルから取り出します。そして、それらを超純水で数回洗浄して、根の滲出液の収集に備えます。10ミリリットルの滅菌脱イオン水で満たされた遠心分離管に50個の均一なアルファルファ苗を移すことによって、根の滲出液収集実験を開始します。根の滲出液を集めるには、根を水に浸した状態でチューブを6時間直立させます。完了したら、遠心管をアルミホイルで包み、根を光から保護します。植物を取り除き、代謝物プロファイリングのために集めた液体を凍結乾燥します。凍結乾燥サンプルに1.8ミリリットルの抽出溶液を加えて抽出実験を進めます。30秒間渦で。次に、氷水浴中で10分間超音波をチューブに当てる。サンプルを遠心分離する前に。200マイクロリットルの上清を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに慎重に移します。遠心チューブから45マイクロリットルの上清を吸引し、最終容量270マイクロリットルで品質管理またはQCサンプルに混合します。完了したら、真空濃縮器で抽出物を凍結乾燥します。乾燥が完了したら、5マイクロリットルの内部標準リボヌクレアーゼを加え、乾燥を続けます。蒸発後、30マイクロリットルのメトキシアミノ化塩酸塩溶液を加え、チューブを摂氏80度で30分間インキュベートします。次に、40マイクロリットルのBSTFA試薬をサンプルに加え、チューブを摂氏70度で1.5時間かけて誘導体化します。インキュベーションが終了し、誘導体化サンプルが室温に達したら、クロロホルムに溶解した5マイクロリットルの脂肪酸メチルエステルを誘導体化サンプルに加えます。30メートル×250マイクロメートル×0.25マイクロメートルのキャピラリーカラムを使用して、1マイクロリットルの根の滲出液を毎分1.0ミリリットルの流速でキャリアガスヘリウムで分離します。射出温度を摂氏280度に設定します。また、転送ラインの温度を摂氏280度に維持します。分離用のオーブンプログラムを設定します。抽出物を分離した後、マイナス70電子ボルトのエネルギーで電子衝突モードで質量分析を行う。イオン源の温度を摂氏250度に維持します。毎秒12.5スペクトルの速度で電荷によって50〜500質量の質量スキャン範囲でフルスキャンモニタリングモードを使用して質量スペクトルを取得します。778個のピークが対照サンプルのクロマトグラフで検出されました。そのうち314の代謝産物が質量スペクトルに従って同定された。酸はさらに脂肪酸、アミノ酸、有機酸およびフェノール酸に細分された。さらに、根の滲出液に一般的に存在するいくつかの一般的な物質は、ピリミジン、ヒドロキシピリミジン、フラボノイド、フェノール、ケトン、ピリミジン、ジテルペンを含むアルファルファの根の滲出液からも検出されました。異なるDEHP治療間の異なる代謝物の変動を視覚化するために、VIPスコアに基づいてヒートマップをプロットしました。対照サンプルと比較して、DEHP曝露は50の代謝産物およびアルファルファ根滲出液の含有量を有意に変化させた。主にいくつかの炭水化物と低分子量有機酸を含みます。代謝経路解析の結果、DEHPは光合成の産物である糖質の代謝を有意に阻害することが示され、DEHPはアルファルファの光合成をある程度抑制できることが示され、DEHPはDEHPのストレスに抵抗するのに役立つ脂肪酸の代謝を促進することが見られました。正確なメタボロームデータ分析を確実にするために、少なくとも種子根の滲出液を各処理に対して実行する必要があります。.代謝差を決定し、汚染物質の環境挙動における重要なルールをさらに調査することができます。植物とより広い分野の生物群集との間の相互作用は、主にこの方法を使用して解読することができます。

Research

JoVE Journal

Environment

Collection of Alfalfa Root Exudates to Study the Impact of Di(2-ethylhexyl) Phthalate on Metabolite Production

Transcript and Metabolite Profiling for the Evaluation of Tobacco Tree and Poplar as Feedstock for the Bio-based Industry

バイオベースの産業の原料としてたばこ木とポプラの評価のための転写産物および代謝物プロファイリング

The global demand for food, feed, energy, and water poses extraordinary challenges for future generations. It is evident that robust platforms for the ...

A Gusseted Thermogradient Table to Control Soil Temperatures for Evaluating Plant Growth and Monitoring Soil Processes

マチ付きThermogradient表は、植物の成長を評価し、土壌プロセスの監視のための土壌の温度を制御します

Thermogradient tables were first developed in the 1950s primarily to test seed germination over a range of temperatures simultaneously without using a ...

Production and Measurement of Organic Particulate Matter in the Harvard Environmental Chamber

生産およびハーバード大学環境チャンバーにおける有機粒子状物質の測定

The production and the evolution of atmospheric organic particulate matter (PM) are insufficiently understood for accurate simulations of atmospheric ...

Self-standing Electrochemical Set-up to Enrich Anode-respiring Bacteria On-site

敷地内に陽極 respiring 細菌を豊かに自立の電気化学的セットアップ

Anaerobic respiration coupled with electron transport to insoluble minerals (referred to as extracellular electron transport [EET]) is thought to be ...

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

植物感染試験: スプレーと傷を介した植物病原体イネいもち病菌接種

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current ...

An Optimized Rhizobox Protocol to Visualize Root Growth and Responsiveness to Localized Nutrients

根の生長およびローカライズされた栄養素に対する反応性を可視化する最適化された Rhizobox プロトコル

Roots are notoriously difficult to study. Soil is both a visual and mechanical barrier, making it difficult to track roots in situ without destructive ...

Composition and Distribution Analysis of Bioaerosols Under Different Environmental Conditions

組成と異なる環境条件下におけるバイオエアロゾルの分布解析

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, ...

Data Collection on Marine Litter Ingestion in Sea Turtles and Thresholds for Good Environmental Status

ウミガメの海洋ごみ摂取に関するデータ収集と良好な環境状態の閾値

The following protocol is intended to respond to the requirements set by the European Union&#39;s Marine Strategy Framework Directives (MSFD) for the ...

Evaluating the Impact of Hydraulic Fracturing on Streams using Microbial Molecular Signatures

微生物分子シグネチャを用いた河川における水圧破砕の影響評価

Hydraulic fracturing (HF), commonly called &#34;fracking&#34;, uses a mixture of high-pressure water, sand, and chemicals to fracture rocks, releasing oil ...