Name: collection of alfalfa root exudates to study the impact of di(2-ethylhexyl) phthalate on metabolite production
Uploaded: 2023-06-02T12:45:00
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이 작업은 중국 국립 자연 과학 재단 (41877139), 중국 국립 자연 과학 재단 (41991335)의 주요 프로젝트, 중국 국가 핵심 연구 개발 프로그램 (2016YFD0800204), 장쑤성 자연 과학 재단 (No. BK20161616), "135"계획 및 중국 과학원의 프론티어 프로그램 (ISSASIP1615).

이 프로토콜의 목적은 수경 재배 실험에서 대사 분석에 이르기까지 일반적인 파이프라인을 제공하여 알팔파 뿌리 삼출물에 대한 DEHP의 효과를 정량화하는 것입니다.
1. 수경재배 배양 실험
참고: 이 프로토콜은 다양한 농도의 DEHP의 스트레스 하에서 알팔파(Medicago sativa) 묘목을 얻기 위해 고안된 알팔파 수경 재배 실험의 예를 제시합니다...

이 프로토콜은 DEHP 스트레스 하에서 알팔파의 뿌리 삼출물을 수집하고 측정하는 방법과 대사체 데이터를 분석하는 방법에 대한 일반적인 지침을 제공합니다. 이 프로토콜의 몇 가지 중요한 단계에 세심한 주의를 기울여야 합니다. 수경 재배 실험에서, 알팔파 묘목은 DEHP의 농도가 다른 영양 용액으로 채워진 유리 병에서 수경 재배 배양되었다. 유리병은 DEHP가 광분해되는 것을 방지하고 모든 배양...

디(2-에틸헥실) 프탈레이트(DEHP)는 가소성과 강도를 향상시키기 위해 가소제로 다양한 플라스틱 및 폴리머에 널리 사용되는 합성 화합물입니다. 지난 몇 년 동안, DEHP가 내분비 교란 물질이며 인간과 다른 동물의 호흡기, 신경계 및 생식계에 악영향을 미친다는 연구 결과가 증가했다 1,2,3. 건강 위험을 고려하여 미국 환경 보호국, 유럽 연합 및 중국 환경 모니터링 센터는 모두 DEHP를 우선 오염 물질 목록으로 분류했습니다. 토양은 플라스틱 멀칭 및 유기 비료의 적용, 폐수 관개 및 슬러지 농장 적용으로 인해 환경에서 DEHP의 중요한 흡수원으로 간주되었습니다4. 예상대로, DEHP는 농지 토양에서 유비쿼터스로 검출되었으며, 그 함량은 중국 5,6의 일부 지역에서 건조 토양 킬로그램 당 밀리그램에 이릅니다. DEHP는 주로 뿌리를 통해 식물에 들어갈 수 있으며 토양 생태계의 다양한 영양 수준에서 생체 확대를 겪을 수 있습니다7. 따라서 최근 수십 년 동안 식물에서 DEHP로 인한 스트레스에 대한 상당한 우려가 제기되었습니다.
식물은 일반적으로 DEHP 노출에 취약합니다. DEHP 스트레스는 종자 발아 및 정상적인 신진대사에 악영향을 미쳐 식물의 성장과 발육을 억제하는 것으로 관찰되었다 8,9. 예를 들어, DEHP는 엽엽 세포에 산화적 손상을 유도하고, 엽록소 및 삼투압의 함량을 감소시키며, 항산화 효소 활성을 증가시켜 결국 식용 식물의 수확량과 품질을 감소시킬 수 있습니다10,11. 그러나 DEHP 스트레스에 대한 식물의 반응에 대한 이전 연구의 대부분은 산화 스트레스와 생리적, 생화학적 특성에 초점을 맞추었습니다. 식물 대사와 관련된 해당 메커니즘은 덜 연구되었습니다. 뿌리 삼출물은 식물 뿌리가 분비되어 환경으로 방출되는 화합물을 설명하는 일반적인 용어입니다. 식물과 근권 토양 사이의 상호 작용 매개체로 간주되어 식물의 성장과 발달을 지원하는 데 중요한 역할을 합니다12. 뿌리 삼출물이 모든 광합성 탄소13의 약 30%-40%를 차지한다는 것은 잘 알려져 있습니다. 오염된 환경에서 뿌리 삼출물은 신진대사 또는 외부 배제를 통해 오염 물질의 스트레스에 대한 식물의 내성을 향상시키는 데 관여한다14. 결과적으로, 오염 스트레스에 대한 식물 뿌리 삼출물의 반응에 대한 깊은 이해는 세포 생화학 및 생물학적 현상과 관련된 기본 메커니즘을 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다15.
대사체학(Metabolomics) 기술은 세포(16, 17), 조직(18), 심지어 당, 유기산, 아미노산 및 지질을 포함한 유기체(19)의 삼출물 내에서 많은 수의 소분자 대사산물을 동시에 측정하기 위한 효율적인 전략을 제공한다. 전통적인 화학 분석 방법이나 기존의 화학 분석 방법과 비교했을 때, 대사체학 접근법은 검출할 수 있는 대사산물의 수를 크게 증가시켜20개를 검출할 수 있으며, 이는 더 높은 처리량의 방식으로 대사 산물을 식별하고 주요 대사 경로를 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 대사체학은 중금속21, 신종 오염 물질22 및 나노 입자19와 같은 스트레스 환경에서의 생물학적 반응 연구 분야에서 널리 사용되어 왔습니다. 식물에 대한 이러한 연구의 대부분은 내부 식물 조직의 대사 변화에 초점을 맞춘 반면, 환경 스트레스에 대한 뿌리 삼출물의 반응에 대해서는 보고된 바가 거의 없습니다. 따라서 본 연구의 목적은 DEHP가 대사산물 생산에 미치는 영향을 연구하기 위해 알팔파 뿌리 삼출물 수집에 대한 일반적인 지침을 도입하는 것입니다. 결과는 DEHP에 의한 식물 대사체학의 후속 연구를 위한 방법 지침을 제공할 것입니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adonitol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td></td>
			<td>&#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alfalfa seeds</td>
			<td>Jiangsu Academy of Agricultural Sciences (Nanjing, China)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>BSA124S-CW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSTFA</td>
			<td>REGIS Technologies</td>
			<td></td>
			<td>with 1% TMCS, v/v</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Heraeus Fresco17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatographic column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DB-5MS (30 m &#215; 250 &#956;m &#215; 0.25 &#956;m)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di(2-ethylhexyl) phthalate</td>
			<td>Dr. Ehrenstorfer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAMEs</td>
			<td>Dr. Ehrenstorfer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas chromatography(GC)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>7890A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grinding instrument</td>
			<td>Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd</td>
			<td>JXFSTPRP-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spectrometer(MS)</td>
			<td>LECO</td>
			<td>PEGASUS HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>CNW Technologies</td>
			<td></td>
			<td>HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methoxyaminatio hydrochloride</td>
			<td>TCI</td>
			<td></td>
			<td>AR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Eppendorf Quality</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd</td>
			<td>DHG-9023A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridine</td>
			<td>Adamas</td>
			<td></td>
			<td>HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>statistical analysis software (pathway enrichment, topology)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIMCA16.0.2&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>statistical analysis software (OPLS-DA etc)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra low temperature freezer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Forma 900 series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound</td>
			<td>Shenzhen Fangao Microelectronics Co., Ltd</td>
			<td>YM-080S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum dryer</td>
			<td>Taicang Huamei biochemical instrument factory</td>
			<td>LNG-T98</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

collection of alfalfa root exudates to study the impact of di(2-ethylhexyl) phthalate on metabolite production

뿌리 삼출물은 식물 뿌리와 주변 환경 간의 정보 통신 및 에너지 전달의 주요 매체입니다. 뿌리 삼출물 분비의 변화는 일반적으로 스트레스 조건에서 식물에 대한 외부 해독 전략입니다. 이 프로토콜은 대사 산물 생산에 대한 디(2-에틸헥실) 프탈레이트(DEHP)의 영향을 연구하기 위해 알팔파 뿌리 삼출물 수집에 대한 일반 지침을 도입하는 것을 목표로 합니다. 첫째, 알팔파 묘목은 수경 재배 실험에서 DEHP 스트레스 하에서 재배됩니다. 둘째, 식물을 50mL의 멸균된 초순수가 들어 있는 원심분리기 튜브로 옮겨 6시간 동안 뿌리삼출물을 수집합니다. 그런 다음 용액을 진공 동결 건조기에서 동결 건조합니다. 냉동된 샘플을 추출하고 비스(트리메틸실릴)) 트리플루오로아세트아미드(BSTFA) 시약으로 유도체화합니다. 이어서, 유도체화된 추출물은 비행 시간 질량 분석기(GC-TOF-MS)와 결합된 가스 크로마토그래프 시스템을 사용하여 측정됩니다. 그런 다음 획득한 대사 산물 데이터를 생물정보학적 방법을 기반으로 분석합니다. 뿌리 삼출물의 관점에서 알팔파에 대한 DEHP의 영향을 밝히기 위해 차등 대사 산물과 크게 변화된 대사 경로를 깊이 탐구해야 합니다.

본 실험에서는 상기 방법에 따라 알팔파 뿌리 삼출물을 채취, 추출, 분석하였다(도 1). 대조군, 저농도 DEHP(1mg L-1) 및 고농도 DEHP(10mg L-1)의 세 가지 처리군을 설정했습니다.
대조군의 크로마토그래프에서 총 778개의 피크가 검출되었으며, 그 중 질량 스펙트럼에 따라 314개의 대사산물을 식별할 수 있었습니다. 그림 2에...

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Collection of Alfalfa Root Exudates to Study the Impact of Di2-ethylhexyl Phthalate on Metabolite Production

뿌리 삼출물의 분비는 일반적으로 스트레스 조건에서 식물에 대한 외부 해독 전략입니다. 이 프로토콜은 비표적 대사체 분석을 통해 알팔파에 대한 생체이물의 영향을 평가하는 방법을 설명합니다.

디(2-에틸헥실) 프탈레이트가 대사 산물 생산에 미치는 영향을 연구하기 위한 알팔파 뿌리 삼출물 수집

Root exudates are the main media of information communication and energy transfer between plant roots and the surrounding environment. The change in ...

이 프로토콜은 비표적 대사체학 분석 동안 알팔파에 대한 생체이물의 영향을 평가하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 작동이 매우 간단하고 편리하며 더 많은 유형의 뿌리 삼출물을 식별 할 수 있습니다. 식물 뿌리 삼출물의 대사 지문을 구성하는 데 도움이 됩니다.10 분 동안 0.1 % 차아 염소산 나트륨으로 씨앗을 헹구어 medicago sativa 또는 알팔파 씨앗의 살균을 시작하십시오. 그런 다음 75% 에틸 알코올로 30분 동안 세척합니다. 다음으로, 멸균 된 씨앗을 증류수로 여러 번 헹굽니다.그런 다음 멸균 페트리 접시에 놓인 축축한 여과지에서 발아시킵니다. 어둠 속에서 섭씨 30도. 발아 후, 균일하게 발아된 크고 통통한 씨앗 20개를 영양액으로 채워진 배양병에 담아 생착 바구니에 옮깁니다.모든 배양 병을 제어된 조건의 성장 챔버에 넣습니다. 2 주 후, 15 개의 균일 한 알팔파 묘목을 새 유리 병에 옮겨 배양 실험을 위해 킬로그램 당 1 밀리그램 및 킬로그램 당 10 밀리그램 DEHP 스트레스에 노출시킵니다. 처리 및 제어 유리병을 알루미늄 호일과 파라필름으로 감싸서 DEHP의 광분해 및 휘발을 방지합니다.액체 수준을 유지하기 위해 매일 영양 용액을 보충하십시오. 알팔파 묘목의 일관된 성장 조건을 보장하기 위해 이틀에 한 번씩 병을 무작위로 놓고 회전시킵니다. 7 일간의 재배 후 병에서 알팔파 묘목을 제거하십시오.그리고 초순수로 여러 번 씻어서 뿌리 삼출물 수집을 준비하십시오. 10개의 균일한 알팔파 묘목을 50밀리리터의 멸균된 탈이온수로 채워진 원심분리기 튜브에 옮겨 뿌리 삼출물 수집 실험을 시작합니다. 뿌리 삼출물을 수집하려면 뿌리를 물에 담근 상태에서 튜브를 6시간 동안 똑바로 세워 두십시오.완료되면 원심분리기 튜브를 알루미늄 호일로 감싸 빛으로부터 뿌리를 보호합니다. 식물을 제거하고 대사 산물 프로파일링을 위해 수집된 액체를 동결 건조합니다. 동결 건조된 샘플에 1.8 밀리리터의 추출 용액을 첨가하여 추출 실험을 진행한다.30 초 동안 소용돌이에서. 다음으로, 얼음물 욕조에서 10 분 동안 튜브에 초음파를 적용하십시오. 샘플을 원심분리하기 전에.200마이크로리터의 상등액을 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 조심스럽게 옮깁니다. 원심분리기 튜브에서 45마이크로리터의 상층액을 흡인하고 품질 관리 또는 QC 샘플에 혼합하여 최종 부피 270마이크로리터로 만듭니다. 완료되면 진공 농축기에서 추출물을 동결 건조합니다.건조가 완료되면 5마이크로리터의 내부 표준 리보뉴클레아제를 첨가하고 건조를 계속합니다. 증발 후, 30 마이크로 리터의 메톡시 아민화 염산염 용액을 첨가하고 튜브를 섭씨 80도에서 30 분 동안 배양한다. 다음으로, 유도체화를 위해 튜브를 섭씨 70도에서 1.5시간 동안 놓기 전에 샘플에 40마이크로리터의 BSTFA 시약을 추가합니다.배양이 끝나고 유도체화된 샘플이 실온에 도달하면 클로로포름에 용해된 지방산 메틸 에스테르 5마이크로리터를 유도체화된 샘플에 추가합니다. 30m x 250μm x 0.25μm 크기의 모세관 컬럼을 사용하여 분당 1.0밀리리터의 유속으로 운반 가스 헬륨으로 뿌리 삼출물 1마이크로리터를 분리합니다. 사출 온도를 섭씨 280도로 설정합니다.그리고 이송 라인 온도를 섭씨 280도로 유지하십시오. 분리를 위한 오븐 프로그램을 설정합니다. 추출물을 분리한 후 마이너스 70전자 볼트의 에너지로 전자 충돌 모드에서 질량 분석을 수행합니다.이온 소스 온도를 섭씨 250도로 유지합니다. 초당 12.5 스펙트럼의 속도로 전하로 50 - 500 질량의 질량 스캔 범위를 가진 전체 스캔 모니터링 모드를 사용하여 질량 스펙트럼을 얻습니다. 778개의 피크가 대조군 샘플의 크로마토그래프에서 검출되었습니다.그 중 314개의 대사산물이 질량 스펙트럼에 따라 확인되었습니다. 산은 지방산, 아미노산, 유기산 및 페놀산으로 더 세분되었습니다. 또한 피리미딘, 하이드록시 피리미딘, 플라보노이드, 페놀, 케톤, 피리미딘 및 디테르펜을 포함한 알팔파 뿌리 삼출물에서도 뿌리 삼출물에 일반적으로 존재하는 일부 일반적인 물질이 검출되었습니다.VIP 점수를 기반으로 히트 맵을 그려 다양한 DEHP 치료 간의 차등 대사 산물의 변화를 시각화했습니다. 대조군 샘플과 비교하여 DEHP 노출은 50 개의 대사 산물과 알팔파 뿌리 삼출물의 함량을 크게 변화 시켰습니다. 주로 일부 탄수화물과 저분자량 유기산을 포함합니다.대사 경로 분석 결과 DEHP는 광합성의 산물인 탄수화물의 대사를 현저히 억제하여 DEHP가 알팔파의 광합성을 어느 정도 억제할 수 있음을 나타내었으며, DEHP는 DEHP의 스트레스에 저항하는 데 도움이 되는 지방산의 대사를 촉진하는 것으로 나타났습니다. 정확한 대사체 데이터 분석을 보장하기 위해 각 처리에 대해 최소한 종자 뿌리 삼출물을 수행해야 합니다. 우리는 차별적 인 대사를 결정하고 오염 물질의 환경 거동에서 중요한 규칙을 추가로 조사 할 수 있습니다.식물과 더 넓은 분야의 생물학적 군집 사이의 상호 작용은 대부분 이 방법을 사용하여 해독할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Environment

Collection of Alfalfa Root Exudates to Study the Impact of Di(2-ethylhexyl) Phthalate on Metabolite Production

Transcript and Metabolite Profiling for the Evaluation of Tobacco Tree and Poplar as Feedstock for the Bio-based Industry

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연구

환경과학

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