Name: collection of alfalfa root exudates to study the impact of di(2-ethylhexyl) phthalate on metabolite production
Uploaded: 2023-06-02T12:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Collection of Alfalfa Root Exudates to Study the Impact of Di2-ethylhexyl Phthalate on Metabolite Production at JoVE.com

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (41877139), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (41991335) Büyük Projeleri, Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (2016YFD0800204), Jiangsu Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (No. BK20161616), "135" Planı ve Çin Bilimler Akademisi Sınır Programı (ISSASIP1615).

Bu protokolün amacı, DEHP'nin yonca kökü eksüdaları üzerindeki etkisini ölçen bir hidroponik kültür deneyinden metabolomik analize kadar genel bir boru hattı sağlamaktır.
1. Topraksız kültür deneyi
NOT: Bu protokol, farklı DEHP konsantrasyonlarının stresi altında yonca (Medicago sativa) fideleri elde etmek için tasarlanmış bir yonca hidroponik kültür deneyinin bir örneğini sunmaktadır. Üç tedavi kuruldu: herhang...

Bu protokol, DEHP stresi altında yonca kök eksüdalarının nasıl toplanacağı ve ölçüleceği ve metabolom verilerinin nasıl analiz edileceği konusunda genel rehberlik sağlar. Bu protokoldeki bazı kritik adımlara çok dikkat edilmesi gerekiyor. Hidroponik kültür deneylerinde, yonca fideleri, farklı konsantrasyonlarda DEHP'ye sahip besin çözeltileri ile doldurulmuş cam şişelerde hidroponik olarak kültürlenmiştir. Cam şişeler, DEHP'nin fotolizini önlemek ve tüm kültür çözeltilerinde DEHP kons...

Di (2-etilheksil) ftalat (DEHP), plastisitelerini ve mukavemetlerini arttırmak için çeşitli plastik ve polimerlerde plastikleştirici olarak yaygın olarak kullanılan sentetik bir kimyasal bileşiktir. Son birkaç yılda, giderek artan sayıda çalışma, DEHP'nin bir endokrin bozucu olduğunu ve insanların ve diğer hayvanların solunum, sinir ve üreme sistemleri üzerinde olumsuz etkisi olduğunu ileri sürmüştür 1,2,3. Sağlık riski göz önüne alındığında, Amerika Birleşik Devletleri Çevre Koruma Ajansı, Avrupa Birliği ve Çin Çevre İzleme Merkezi, DEHP'yi öncelikli kirleticiler listesinde sınıflandırmıştır. Toprak, plastik malçlama ve organik gübrelerin uygulanması, atık su ile sulama ve çamur çiftliği uygulaması nedeniyle DEHP'nin çevrede önemli bir lavabosu olarak kabul edilmiştir4. Beklendiği gibi, DEHP, içeriği Çin'deki bazı bölgelerde kilogram kuru toprak başına miligrama kadar ulaşan tarım arazisi topraklarında her yerde tespit edilmiştir 5,6. DEHP, bitkilere esas olarak kökler yoluyla girebilir ve toprak ekosistemlerinde farklı trofik seviyelerde biyomagnifikasyona uğrayabilir7. Bu nedenle, son yıllarda bitkilerde DEHP'nin neden olduğu stres hakkında önemli endişeler ortaya çıkmıştır.
Bitkiler genellikle DEHP maruziyetine karşı savunmasızdır. DEHP stresinin tohum çimlenmesi ve normal metabolizma üzerinde olumsuz bir etki yarattığı ve böylece bitki büyümesini ve gelişimini engellediği gözlenmiştir 8,9. Örneğin, DEHP mezofil hücrelerine oksidatif hasara neden olabilir, klorofil ve ozmolit içeriğini azaltabilir ve antioksidatif enzim aktivitelerini yükseltebilir, sonuçta yenilebilir bitkilerin veriminde ve kalitesinde bir düşüşe neden olabilir10,11. Bununla birlikte, bitkilerin DEHP stresine tepkisi üzerine yapılan önceki çalışmaların çoğu, oksidatif strese ve fizyolojik ve biyokimyasal özelliklere odaklanmıştır. Bitki metabolizması ile ilişkili karşılık gelen mekanizmalar daha az çalışılmıştır. Kök eksüdaları, bitki köklerinin salgıladığı ve çevreye saldığı bileşikleri tanımlayan genel bir terimdir. Bitkiler ve rizosfer toprağı arasındaki etkileşim ortamı olarak kabul edilmişlerdir ve bitki büyümesini ve gelişimini desteklemede önemli bir rol oynamaktadırlar12. Kök eksüdalarının tüm fotosentetik karbon13'ün yaklaşık% 30-40'ını oluşturduğu iyi bilinmektedir. Kirlenmiş ortamlarda, kök eksüdaları, bitkilerin metabolizma veya dış dışlama yoluyla kirleticilerin stresine karşı toleransını arttırmada rol oynar14. Sonuç olarak, bitki kökü eksüdalarının kirlilik stresine tepkisinin derinlemesine anlaşılması, hücre biyokimyası ve biyolojik fenomenlerle ilişkili temel mekanizmaların ortaya çıkarılmasına yardımcı olabilir15.
Metabolomik teknoloji, hücreler 16,17, dokular18 ve hatta şekerler, organik asitler, amino asitler ve lipitler dahil olmak üzere organizmalarıneksüdaları 19 içinde aynı anda çok sayıda küçük molekül metabolitini ölçmek için etkili bir strateji sağlar. Geleneksel veya klasik kimyasal analiz yöntemleriyle karşılaştırıldığında, metabolomik yaklaşım, tespit edilebilen metabolit sayısını büyük ölçüde artırır20, bu da metabolitleri daha yüksek verimli bir şekilde tanımlamaya ve anahtar metabolik yolları tanımlamaya yardımcı olabilir. Metabolomik, ağır metaller21, ortaya çıkan kirleticiler22 ve nanopartiküller19 gibi stres ortamlarında biyolojik tepkinin araştırma alanında yaygın olarak kullanılmaktadır. Bitkiler üzerinde yapılan bu çalışmaların çoğu, iç bitki dokularındaki metabolik değişikliklere odaklanırken, kök eksüdalarının çevresel strese tepkisi hakkında çok az şey bildirilmiştir. Bu nedenle, bu çalışmanın amacı, DEHP'nin metabolit üretimi üzerindeki etkisini incelemek için yonca kökü eksüdalarının toplanması için genel kılavuzları tanıtmaktır. Sonuçlar, DEHP tarafından bitki metabolomiklerinin takip çalışması için bir yöntem rehberliği sağlayacaktır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adonitol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td></td>
			<td>&#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alfalfa seeds</td>
			<td>Jiangsu Academy of Agricultural Sciences (Nanjing, China)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>BSA124S-CW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSTFA</td>
			<td>REGIS Technologies</td>
			<td></td>
			<td>with 1% TMCS, v/v</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Heraeus Fresco17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatographic column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DB-5MS (30 m &#215; 250 &#956;m &#215; 0.25 &#956;m)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di(2-ethylhexyl) phthalate</td>
			<td>Dr. Ehrenstorfer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAMEs</td>
			<td>Dr. Ehrenstorfer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas chromatography(GC)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>7890A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grinding instrument</td>
			<td>Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd</td>
			<td>JXFSTPRP-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spectrometer(MS)</td>
			<td>LECO</td>
			<td>PEGASUS HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>CNW Technologies</td>
			<td></td>
			<td>HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methoxyaminatio hydrochloride</td>
			<td>TCI</td>
			<td></td>
			<td>AR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Eppendorf Quality</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd</td>
			<td>DHG-9023A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridine</td>
			<td>Adamas</td>
			<td></td>
			<td>HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>statistical analysis software (pathway enrichment, topology)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIMCA16.0.2&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>statistical analysis software (OPLS-DA etc)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra low temperature freezer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Forma 900 series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound</td>
			<td>Shenzhen Fangao Microelectronics Co., Ltd</td>
			<td>YM-080S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum dryer</td>
			<td>Taicang Huamei biochemical instrument factory</td>
			<td>LNG-T98</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

collection of alfalfa root exudates to study the impact of di(2-ethylhexyl) phthalate on metabolite production

Kök eksüdaları, bitki kökleri ile çevre arasındaki bilgi iletişimi ve enerji transferinin ana ortamıdır. Kök eksüdalarının salgılanmasındaki değişiklik genellikle stres koşulları altındaki bitkiler için harici bir detoksifikasyon stratejisidir. Bu protokol, di (2-etilheksil) ftalatın (DEHP) metabolit üretimi üzerindeki etkisini incelemek için yonca kökü eksüdalarının toplanması için genel kılavuzlar getirmeyi amaçlamaktadır. İlk olarak, yonca fideleri topraksız bir kültür deneyinde DEHP stresi altında yetiştirilir. İkincisi, bitkiler kök eksüdalarını toplamak için 6 saat boyunca 50 mL sterilize ultra saf su içeren santrifüj tüplerine aktarılır. Çözeltiler daha sonra vakumlu dondurarak kurutucuda dondurularak kurutulur. Dondurulmuş numuneler bis(trimetilsilil)) trifloroasetamid (BSTFA) reaktifi ile ekstrakte edilir ve türetilir. Daha sonra, türetilmiş ekstraktlar, uçuş zamanı kütle spektrometresi (GC-TOF-MS) ile birleştirilmiş bir gaz kromatograf sistemi kullanılarak ölçülür. Elde edilen metabolit verileri daha sonra biyoinformatik yöntemlere dayanarak analiz edilir. Diferansiyel metabolitler ve önemli ölçüde değişmiş metabolizma yolakları, kök eksüdaları açısından DEHP'nin yonca üzerindeki etkisini ortaya çıkarmak için derinlemesine araştırılmalıdır.

Bu deneyde, yonca kökü eksüdaları yukarıdaki yöntemlere göre toplanmış, ekstrakte edilmiş ve analiz edilmiştir (Şekil 1). Üç tedavi grubu oluşturuldu: kontrol, düşük DEHP konsantrasyonu (1 mg L-1) ve yüksek DEHP konsantrasyonu (10 mg L-1).
Kontrolün kromatografında toplam 778 pik tespit edildi ve bunların 314 metaboliti kütle spektrumlarına göre tanımlanabildi. Şekil 2'de gösterildiği...

Watch this Scientific Journal Video about Collection of Alfalfa Root Exudates to Study the Impact of Di2-ethylhexyl Phthalate on Metabolite Production at JoVE.com

Collection of Alfalfa Root Exudates to Study the Impact of Di2-ethylhexyl Phthalate on Metabolite Production

Kök eksüdalarının salgılanması genellikle stres koşulları altındaki bitkiler için harici bir detoksifikasyon stratejisidir. Bu protokol, ksenobiyotiklerin yonca üzerindeki etkisinin hedefsiz metabolomik analiz yoluyla nasıl değerlendirileceğini açıklar.

Di (2-etilheksil) Ftalatın Metabolit Üretimi Üzerindeki Etkisini İncelemek için Yonca Kökü Eksüdalarının Toplanması

Root exudates are the main media of information communication and energy transfer between plant roots and the surrounding environment. The change in ...

Bu protokol, hedeflenmemiş metabolomik analiz sırasında ksenobiyotiklerin yonca üzerindeki etkisinin nasıl değerlendirileceğini açıklamaktadır. Teknik operasyon için çok basit ve kullanışlıdır ve daha fazla kök eksüda türü tanımlanabilir. Bu, bitki kökü eksüdalarının metabolomik parmak izini oluşturmaya yardımcı olur.Medicago sativa veya yonca tohumlarının sterilizasyonuna, tohumları% 0.1 sodyum hipoklorit ile 10 dakika boyunca durulayarak başlayın. Ardından 30 dakika boyunca% 75 etil alkol ile yıkayın. Daha sonra, sterilize edilmiş tohumları damıtılmış suyla birkaç kez durulayın.Ve sonra onları steril bir petri kabına yerleştirilmiş nemli filtre kağıdı üzerinde çimlendirin. Karanlıkta 30 santigrat derecede. Çimlenmeden sonra, 20 adet düzgün çimlenmiş büyük dolgun tohumu, besin çözeltisi ile doldurulmuş bir kültür şişesinde bir aşılama sepetine aktarın.Tüm kültür şişelerini kontrollü koşullara sahip bir büyüme odasına yerleştirin. İki hafta sonra, kültür deneyi için 15 üniform yonca fidanını kilogram başına bir miligram ve kilogram başına 10 miligram DEHP stresine maruz bırakmak için yeni bir cam şişeye aktarın. DEHP'nin fotolizini ve uçuculaşmasını önlemek için işlem ve kontrol cam şişelerini alüminyum folyo ve parafilm ile sarın.Sıvı seviyesini korumak için besin çözeltisini günlük olarak takviye edin. Yonca fideleri için tutarlı büyüme koşulları sağlamak için şişeleri her iki günde bir rastgele yerleştirin ve döndürün. Yedi günlük ekimden sonra, yonca fidelerini şişelerden çıkarın.Ve kök eksüdalarının toplanmasına hazırlamak için birkaç kez ultra saf suyla yıkayın. Kök eksüda toplama deneyine, 10 üniform yonca fidanını 50 mililitre sterilize deiyonize su ile doldurulmuş santrifüj tüplerine aktararak başlayın. Kök eksüdalarını toplamak için, tüpleri suya batırılmış köklerle altı saat boyunca dik tutun.İşiniz bittiğinde, kökleri ışıktan korumak için santrifüj tüplerini alüminyum folyo ile sarın. Bitkileri çıkarın ve metabolit profillemesi için toplanan sıvıyı dondurarak kurutun. Dondurularak kurutulmuş numunelere 1,8 mililitre ekstraksiyon çözeltisi ekleyerek ekstraksiyon deneyine devam edin.30 saniye boyunca vortekste. Daha sonra, ultrason dalgalarını bir buzlu su banyosunda 10 dakika boyunca tüplere uygulayın. Numuneleri santrifüj etmeden önce.200 mikrolitre süpernatantı 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne dikkatlice aktarın. Santrifüj tüpünden 45 mikrolitre süpernatant aspire edin ve 270 mikrolitrelik nihai bir hacimde kalite kontrol veya QC numunelerine karıştırın. Tamamlandığında, ekstraktları bir vakum konsantratöründe dondurarak kurutun.Kurutma tamamlandıktan sonra, beş mikrolitre dahili standart ribonükleaz ekleyin ve kurumaya devam edin. Buharlaşmadan sonra, 30 mikrolitre metoksiaminasyon hidroklorür çözeltisi ekleyin ve tüpleri 30 dakika boyunca 80 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, tüpleri türevlendirme için 1,5 saat boyunca 70 santigrat dereceye yerleştirmeden önce numunelere 40 mikrolitre BSTFA reaktifi ekleyin.İnkübasyon bittiğinde ve türetilmiş numune oda sıcaklığına ulaştığında, türetilmiş numunelere kloroformda çözünmüş beş mikrolitre yağ asidi metil esteri ekleyin. 30 metre x 250 mikrometre x 0.25 mikrometre ölçülerinde bir kılcal sütun kullanarak, kök eksüdalarının bir mikrolitresini dakikada 1.0 mililitre akış hızında bir taşıyıcı gaz helyumu ile ayırın. Enjeksiyon sıcaklığını 280 santigrat dereceye ayarlayın.Ve transfer hattı sıcaklığını 280 santigrat derecede tutun. Fırın programını ayırma için ayarlayın. Ekstraktları ayırdıktan sonra, eksi 70 elektron voltluk bir enerjiyle elektron çarpışma modunda kütle spektrometresi yapın.İyon kaynağı sıcaklığını 250 santigrat derecede tutun. Saniyede 12,5 spektrum hızında şarjla 50 ila 500 kütle tarama aralığına sahip tam tarama izleme modunu kullanarak kütle spektrumları elde edin. Kontrol örneğinin kromatografında 778 tepe noktası tespit edildi.Bunlardan 314 metaboliti kütle spektrumlarına göre tanımlanmıştır. Asitler ayrıca yağ asitleri, amino asitler, organik asitler ve fenolik asitlere bölündü. Ek olarak, genellikle kök eksüdalarında bulunan bazı yaygın maddeler, pirimidinler, hidroksi pirimidinler, flavonoidler, fenoller, ketonlar, pirimidinler ve diterpenler dahil olmak üzere yonca kökü eksüdalarında da tespit edilmiştir.Farklı DEHP tedavileri arasındaki diferansiyel metabolitlerdeki varyasyonu görselleştirmek için VIP skoruna dayalı bir ısı haritası çizildi. Kontrol örnekleriyle karşılaştırıldığında, DEHP maruziyeti 50 metabolit ve yonca kökü eksüdasının içeriğini önemli ölçüde değiştirdi. Esas olarak bazı karbonhidratlar ve düşük moleküler ağırlıklı organik asitler içerir.Metabolik yollar analizi, DEHP'nin fotosentezin ürünü olan karbonhidratların metabolizmasını önemli ölçüde inhibe ettiğini gösterdi ve DEHP'nin yoncanın fotosentezini bir dereceye kadar baskılayabildiğini gösterdi DEHP'nin, DEHP'den gelen strese direnmeye yardımcı olan yağ asitlerinin metabolizmasını teşvik ettiği görüldü. Doğru metabolomik veri analizini sağlamak için her işlem için en azından tohum kökü eksüdaları yapılmalıdır. Diferansiyel metabolizasyonu belirleyebilir ve kirleticilerin çevresel davranışlarındaki önemli kuralları daha fazla araştırabiliriz.Bitkiler ve daha geniş alan biyolojik topluluğu arasındaki etkileşimler çoğunlukla bu yöntem kullanılarak deşifre edilebilir.

Research

JoVE Journal

Environment

Collection of Alfalfa Root Exudates to Study the Impact of Di(2-ethylhexyl) Phthalate on Metabolite Production

Transcript and Metabolite Profiling for the Evaluation of Tobacco Tree and Poplar as Feedstock for the Bio-based Industry

Bio-tabanlı Sanayi Feedstock olarak Tütün Ağacı ve Kavak Değerlendirme transkript ve metabolit profil

The global demand for food, feed, energy, and water poses extraordinary challenges for future generations. It is evident that robust platforms for the ...

A Gusseted Thermogradient Table to Control Soil Temperatures for Evaluating Plant Growth and Monitoring Soil Processes

Bir Körüklü Thermogradient Tablo Toprak Süreçleri Bitki Büyüme değerlendirilmesi ve İzleme Toprak Sıcaklıklar Denetim

Thermogradient tables were first developed in the 1950s primarily to test seed germination over a range of temperatures simultaneously without using a ...

Production and Measurement of Organic Particulate Matter in the Harvard Environmental Chamber

Üretim ve Harvard çevre odası organik partikül madde ölçümü

The production and the evolution of atmospheric organic particulate matter (PM) are insufficiently understood for accurate simulations of atmospheric ...

Self-standing Electrochemical Set-up to Enrich Anode-respiring Bacteria On-site

Anot respiring bakteri yerinde zenginleştirmek için kendini ayakta elektrokimyasal Set-up

Anaerobic respiration coupled with electron transport to insoluble minerals (referred to as extracellular electron transport [EET]) is thought to be ...

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

Bitki enfeksiyon Test: Sprey ve bitki patojeni Magnaporthe Grisea ile aşı yara-aracılı

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current ...

An Optimized Rhizobox Protocol to Visualize Root Growth and Responsiveness to Localized Nutrients

Kök büyüme ve yerelleştirilmiş besin kavramaları görselleştirmek için en iyi duruma getirilmiş bir Rhizobox Protokolü

Roots are notoriously difficult to study. Soil is both a visual and mechanical barrier, making it difficult to track roots in situ without destructive ...

Composition and Distribution Analysis of Bioaerosols Under Different Environmental Conditions

Kompozisyon ve Bioaerosols farklı çevresel koşullar altında dağıtım Analizi

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, ...

Data Collection on Marine Litter Ingestion in Sea Turtles and Thresholds for Good Environmental Status

Deniz kaplumbağaları ve Iyi çevresel durum için eşikler deniz çöp yutulması veri toplama

The following protocol is intended to respond to the requirements set by the European Union&#39;s Marine Strategy Framework Directives (MSFD) for the ...

Evaluating the Impact of Hydraulic Fracturing on Streams using Microbial Molecular Signatures

Hidrolik Çatlatmanın Akışlar Üzerindeki Etkisini Mikrobiyal Moleküler İmzalar Kullanarak Değerlendirmek

Hydraulic fracturing (HF), commonly called &#34;fracking&#34;, uses a mixture of high-pressure water, sand, and chemicals to fracture rocks, releasing oil ...