Name: isolation method for long-term and short-term hematopoietic stem cells
Uploaded: 2023-05-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation Method for Long-Term and Short-Term Hematopoietic Stem Cells at JoVE.com

Мы благодарим Хироши Киёнари за уход за животными и предоставление мышей-реципиентов в RIKEN BDR, а также Хитоми Ога, Каёко Нагасаку и Масаки Мияхаси за управление лабораторией в Университете Кобе. Авторы также высоко ценят постоянную поддержку этой работы. Масанори Мияниши был поддержан Японским обществом содействия науке (JSPS) KAKENHI с номерами грантов JP17K07407 и JP20H03268, Мемориальным фондом медицинских и фармацевтических исследований Мочида, Японским фондом наук о жизни, Научным фондом Такеда, Фондом исследований метаболических нарушений Астелласа и AMED-PRIME, AMED под номером гранта JP18gm6110020. Таро Сакамаки поддерживается JSPS KAKENHI с номерами грантов JP21K20669 и JP22K16334 и поддерживается Программа JSPS Core-to-Core и Программа младших научных сотрудников RIKEN. Кацуюки Ниши был поддержан грантом JSPS No KAKENHI JP18J13408.

Все описанные эксперименты на животных были одобрены Центром исследований динамики биосистем RIKEN.
1. Предварительное кондиционирование мышей-реципиентов
<ol><li>Подготовьте самцов конгенных мышей C57BL / 6 в возрасте 8-10 недель в качестве мышей-реципиентов. Количест?...

<ol>
	<li>Weissman, I. L., Shizuru, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origins+of+the+identification+and+isolation+of+hematopoietic+stem+cells,+and+their+capability+to+induce+donor-specific+transplantation+tolerance+and+treat+autoimmune+diseases.">The origins of the identification and isolation of hematopoietic stem cells, and their capability to induce donor-specific transplantation tolerance and treat autoimmune diseases.</a> Blood. 112 (9), 3543-3553 (2008).</li><li>Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+hierarchy+of+multipotent+hematopoietic+progenitors+in+human+cord+blood.">Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood.</a> Cell Stem Cell. 1 (6), 635-645 (2007).</li><li>Spangrude, G. J., Heimfeld, S., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+mouse+hematopoietic+stem+cells.">Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells.</a> Science. 241 (4861), 58-62 (1988).</li><li>Ogawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+function+of+c-kit+in+hemopoietic+progenitor+cells.">Expression and function of c-kit in hemopoietic progenitor cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 174 (1), 63-71 (1991).</li><li>Ikuta, K., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+hematopoietic+stem+cells+express+mouse+c-kit+but+do+not+depend+on+steel+factor+for+their+generation.">Evidence that hematopoietic stem cells express mouse c-kit but do not depend on steel factor for their generation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (4), 1502-1506 (1992).</li><li>Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+lymphohematopoietic+reconstitution+by+a+single+CD34-low/negative+hematopoietic+stem+cell.">Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell.</a> Science. 273 (5272), 242-245 (1996).</li><li>Christensen, J. L., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flk-2+is+a+marker+in+hematopoietic+stem+cell+differentiation:+A+simple+method+to+isolate+long-term+stem+cells.">Flk-2 is a marker in hematopoietic stem cell differentiation: A simple method to isolate long-term stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (25), 14541-14546 (2001).</li><li>Kiel, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells.">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).</li><li>Morrison, S. J., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long-term+repopulating+subset+of+hematopoietic+stem+cells+is+deterministic+and+isolatable+by+phenotype.">The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype.</a> Immunity. 1 (8), 661-673 (1994).</li><li>Spangrude, G. J., Brooks, D. M., Tumas, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+repopulation+of+irradiated+mice+with+limiting+numbers+of+purified+hematopoietic+stem+cells:+In+vivo+expansion+of+stem+cell+phenotype+but+not+function.">Long-term repopulation of irradiated mice with limiting numbers of purified hematopoietic stem cells: In vivo expansion of stem cell phenotype but not function.</a> Blood. 85 (4), 1006-1016 (1995).</li><li>Dykstra, B., Olthof, S., Schreuder, J., Ritsema, M., de Haan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+analysis+reveals+multiple+functional+defects+of+aged+murine+hematopoietic+stem+cells.">Clonal analysis reveals multiple functional defects of aged murine hematopoietic stem cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 208 (13), 2691-2703 (2011).</li><li>Grover, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+reveals+molecular+and+functional+platelet+bias+of+aged+haematopoietic+stem+cells.">Single-cell RNA sequencing reveals molecular and functional platelet bias of aged haematopoietic stem cells.</a> Nature Communications. 7, 11075 (2016).</li><li>Kataoka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evi1+is+essential+for+hematopoietic+stem+cell+self-renewal,+and+its+expression+marks+hematopoietic+cells+with+long-term+multilineage+repopulating+activity.">Evi1 is essential for hematopoietic stem cell self-renewal, and its expression marks hematopoietic cells with long-term multilineage repopulating activity.</a> Journal of Experimental Medicine. 208 (12), 2403-2416 (2011).</li><li>Gazit, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgd5+identifies+hematopoietic+stem+cells+in+the+murine+bone+marrow.">Fgd5 identifies hematopoietic stem cells in the murine bone marrow.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (7), 1315-1331 (2014).</li><li>Acar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+imaging+of+bone+marrow+shows+non-dividing+stem+cells+are+mainly+perisinusoidal.">Deep imaging of bone marrow shows non-dividing stem cells are mainly perisinusoidal.</a> Nature. 526 (7571), 126-130 (2015).</li><li>Chen, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hoxb5+marks+long-term+haematopoietic+stem+cells+and+reveals+a+homogenous+perivascular+niche.">Hoxb5 marks long-term haematopoietic stem cells and reveals a homogenous perivascular niche.</a> Nature. 530 (7589), 223-227 (2016).</li><li>Ema, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+self-renewal+capacity+in+single+hematopoietic+stem+cells+from+normal+and+Lnk-deficient+mice.">Quantification of self-renewal capacity in single hematopoietic stem cells from normal and Lnk-deficient mice.</a> Developmental Cell. 8 (6), 907-914 (2005).</li><li>Morita, Y., Ema, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+and+hierarchy+within+the+most+primitive+hematopoietic+stem+cell+compartment.">Heterogeneity and hierarchy within the most primitive hematopoietic stem cell compartment.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1173-1182 (2010).</li><li>Yamamoto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+analysis+unveils+self-renewing+lineage-restricted+progenitors+generated+directly+from+hematopoietic+stem+cells.">Clonal analysis unveils self-renewing lineage-restricted progenitors generated directly from hematopoietic stem cells.</a> Cell. 154 (5), 1112-1126 (2013).</li><li>Fathman, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+CD11A+on+hematopoietic+stem+cells+denotes+the+loss+of+long-term+reconstitution+potential.">Upregulation of CD11A on hematopoietic stem cells denotes the loss of long-term reconstitution potential.</a> Stem Cell Reports. 3 (5), 707-715 (2014).</li><li>Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+markers+resolve+functionally+distinct+subpopulations+of+hematopoietic+stem+cells+and+multipotent+progenitors.">SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).</li><li>Haas, S., Trumpp, A., Milsom, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+and+consequences+of+hematopoietic+stem+cell+heterogeneity.">Causes and consequences of hematopoietic stem cell heterogeneity.</a> Cell Stem Cell. 22 (5), 627-638 (2018).</li><li>Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+heterogeneity:+Subtypes,+not+unpredictable+behavior.">Hematopoietic stem cell heterogeneity: Subtypes, not unpredictable behavior.</a> Cell Stem Cell. 6 (3), 203-207 (2010).</li><li>Muller-Sieburg, C. E., Sieburg, H. B., Bernitz, J. M., Cattarossi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+heterogeneity:+Implications+for+aging+and+regenerative+medicine.">Stem cell heterogeneity: Implications for aging and regenerative medicine.</a> Blood. 119 (17), 3900-3907 (2012).</li><li>Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+bone+marrow+transplantation+(BMT):+Providing+optimal+veterinary+and+husbandry+care+to+irradiated+mice+in+BMT+studies.">Principles of bone marrow transplantation (BMT): Providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48 (1), 11-22 (2009).</li><li>Nishi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+minimum+requirements+for+successful+haematopoietic+stem+cell+transplantation.">Identification of the minimum requirements for successful haematopoietic stem cell transplantation.</a> British Journal of Haematology. 196 (3), 711-723 (2022).</li><li>Sakamaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hoxb5+defines+the+heterogeneity+of+self-renewal+capacity+in+the+hematopoietic+stem+cell+compartment.">Hoxb5 defines the heterogeneity of self-renewal capacity in the hematopoietic stem cell compartment.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 539, 34-41 (2021).</li></ol>

Традиционно для изучения функций ГСК, таких как способность к самообновлению и мультипотенция 19,20,21, были подготовлены ГСК, определяемые маркерами клеточной поверхности. Однако иммунофенотипически определенная (Lineage−c-Kit+S...

Гемопоэтические стволовые клетки (ГСК), обладающие способностью к самообновлению и мультипотентности, находятся на вершине гемопоэтической иерархии 1,2. В 1988 году Вайсман и его коллеги впервые продемонстрировали, что выделение ГСК мыши может быть достигнуто с помощью проточной цитометрии3. Впоследствии сообщалось, что фракция, определяемая комбинацией маркеров клеточной поверхности, Lineage-c-Kit + Sca-1 + CD150 + CD34-/loFlk2-, содержит все ГСК у мышей 4,5,6,7,8.
Иммунофенотипически определенные (Lineage−c-Kit + Sca-1 + CD150 + CD34 - / loFlk2-) ГСК (далее - pHSCs) ранее считались функционально однородными. Однако недавние одноклеточные анализы показали, что рГСК по-прежнему проявляют гетерогенность в отношении их способности к самообновлению9,10 и мультипотентности11,12. В частности, в фракции pHSC, по-видимому, существуют две популяции в отношении их способности к самообновлению: долгосрочные гемопоэтические стволовые клетки (LT-HSCs), которые обладают способностью к непрерывному самообновлению, и краткосрочные гемопоэтические стволовые клетки (ST-HSCs), которые обладают преходящей способностью к самообновлению 9,10.
На сегодняшний день молекулярные механизмы способности к самообновлению, которые отличают LT-ГСК и ST-ГСК, остаются малоизученными. Крайне важно изолировать обе клеточные популяции на основе их способности к самообновлению и обнаружить основные молекулярные механизмы. Также было внедрено несколько репортерных систем для очистки LT-HSC13,14,15; однако чистота LT-HSC, определяемая каждой репортерной системой, варьируется, и до настоящего времени не была достигнута исключительная очистка LT-HSC.
Таким образом, разработка системы изоляции для LT-HSC и ST-HSC ускорит исследования способности к самообновлению фракции pHSC. При выделении LT-ГСК и ST-ГСК исследование с использованием многоступенчатого несмещенного скрининга идентифицировало один ген Hoxb5, который гетерогенно экспрессируется в фракцииpHSC 16. Кроме того, анализ костного мозга мышей-репортеров Hoxb5 показал, что примерно 20-25% фракции pHSC состоит изpos-клеток Hoxb5. Конкурентный анализ трансплантации с использованием Hoxb5 pos pHSC и Hoxb5 neg pHSCs показал, что только Hoxb5pos pHSC обладают способностью к длительному самообновлению, в то время как Hoxb5neg pHSC теряют свою способность к самообновлению в течение короткого периода времени, что указывает на то, что Hoxb5 идентифицирует LT-HSC во фракцииpHSC 16. 
Здесь мы демонстрируем пошаговый протокол для выделения LT-HSC и ST-HSC с использованием репортерной системы Hoxb5 . Кроме того, мы представляем конкурентный анализ трансплантации для оценки способности к самообновлению рГСК Hoxb5pos/neg (рис. 1). Эта репортерная система Hoxb5 позволяет нам проспективно изолировать LT-HSC и ST-HSC и способствует пониманию специфических для LT-HSC характеристик.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL Strip of 8 Tubes, Dome Cap</td>
			<td>SSIbio</td>
			<td>3230-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Iinvtrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30G insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>326668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-AAD Viability Staining Solution</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>420404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well U-Bottom</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>351177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-APC-MicroBeads</td>
			<td>Milteny biotec</td>
			<td>130-090-855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator with trap flask</td>
			<td>Biosan</td>
			<td>FTA-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B220-Alexa Fluor 700 (RA3-6B2)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B220-Biotin (RA3-6B2)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B220-BV786 (RA3-6B2)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.CD45.1 congenic mice&#160;</td>
			<td>Sankyo Labo Service</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baytril 10%</td>
			<td>BAYER</td>
			<td>341106546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS Aria II special order system&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant stain buffer</td>
			<td>BD</td>
			<td>566349</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b-Alexa Fluor 700 (M1/70)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b-Biotin (M1/70)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b-BUV395 (M1/70)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b-BV711 (M1/70)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD127-Alexa Fluor 700 (A7R34)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56-1271-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD150-BV421 (TC15-12F12.2)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>115943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16/CD32-Alexa Fluor 700 (93)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56-0161-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34-Alexa Fluor 647 (RAM34)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34-FITC (RAM34)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11034185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3-Alexa Fluor 700 (17A2)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3&#949; -Biotin (145-2C11)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3&#949; -BV421 (145-2C11)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.1/CD45.2 congenic mice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Bred in our Laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.1-FITC (A20)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.2-PE (104)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560695</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4-Alexa Fluor 700 (GK1.5)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4-Biotin (GK1.5)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8a-Alexa Fluor 700 (53-6.7)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8a-Biotin (53-6.7)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube 15ml</td>
			<td>NICHIRYO</td>
			<td>00-ETS-CT-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube 50ml</td>
			<td>NICHIRYO</td>
			<td>00-ETS-CT-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c-Kit-APC-eFluor780 (2B8)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>47117182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS (-) without Ca and Mg, liquid&#160;</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>14249-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flk2-PerCP-eFluor710 (A2F10)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>46135182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo version 10</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gmmacell 40 Exactor</td>
			<td>Best theratronics</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gr-1-Alexa Fluor 700 (RB6-8C5)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>108422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gr-1-Biotin (RB6-8C5)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>108404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoxb5-tri-mCherry mice (C57BL/6J background)&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Bred in our Laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG from rat serum, technical grade, &#62;=80% (SDS-PAGE), buffered aqueous solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8015-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>4987-114-13340-3&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes S200</td>
			<td>NIPPON PAPER CRECIA&#160;</td>
			<td>6-6689-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Milteny biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis buffer&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>555899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS&#160; MultiStand</td>
			<td>Milteny biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate for Tissue Culture (For Adhesion Cell) 6Well</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>3810-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS Separator</td>
			<td>Milteny biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Pie Cages</td>
			<td>Natsume Seisakusho</td>
			<td>KN-331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipurpose refrigerated Centrifuge</td>
			<td>TOMY</td>
			<td>EX-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NARCOBIT-E (II)</td>
			<td>Natsume Seisakusho</td>
			<td>KN-1071-I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK-1.1-PerCP-Cy5.5 (PK136)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>108728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Mixed Solution</td>
			<td>nacalai</td>
			<td>26253-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcelain Mortar &#966;120mm with Pestle</td>
			<td>Asone</td>
			<td>6-549-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind Tube 1.5 mL&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sca-I-BUV395 (D7)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563990</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel scalpel blade</td>
			<td>FastGene</td>
			<td>FG-B2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-BUV737</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>612775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX-red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S34859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tailveiner Restrainer for Mice standard</td>
			<td>Braintree</td>
			<td>TV-150 STD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCRb-BV421 (H57-597)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>109230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ter-119-Alexa Fluor 700 (TER-119)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>116220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ter-119-Biotin (TER-119)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>116204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terumo 5ml Concentric Luer-Slip Syringe</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SS-05LZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terumo Hypodermic Needle 23G x 1</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>NN-2325-R</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation method for long-term and short-term hematopoietic stem cells

Способность к самообновлению и потенциал многолинейной дифференцировки обычно рассматриваются как определяющие характеристики гемопоэтических стволовых клеток (ГСК). Однако многочисленные исследования показали, что функциональная гетерогенность существует в компартменте ГСК. Недавние одноклеточные анализы сообщили о клонах ГСК с различными судьбами клеток в компартменте ГСК, которые называются смещенными клонами ГСК. Механизмы, лежащие в основе гетерогенных или плохо воспроизводимых результатов, мало изучены, особенно в отношении продолжительности самообновления при трансплантации очищенных фракций ГСК обычным иммуноокрашиванием. Таким образом, создание воспроизводимого метода изоляции для долгосрочных ГСК (ЛТ-ГСК) и краткосрочных ГСК (СТ-ГСК), определяемых продолжительностью их самообновления, имеет решающее значение для преодоления этой проблемы. Используя непредвзятый многоступенчатый скрининг, мы идентифицировали фактор транскрипции Hoxb5, который может быть эксклюзивным маркером LT-HSC в кроветворной системе мыши. Основываясь на этом выводе, мы создали линию репортерных мышей Hoxb5 и успешно изолировали LT-HSC и ST-HSC. Здесь мы описываем подробный протокол выделения LT-HSC и ST-HSC с использованием репортерной системы Hoxb5 . Этот метод выделения поможет исследователям лучше понять механизмы самообновления и биологическую основу такой гетерогенности в компартменте ГСК.

Ранее способность к самообновлению измерялась с использованием конкурентных анализов трансплантации, в которых считается, что донорские ГСК сохраняют свою способность к самообновлению только в том случае, если наблюдаются многолинейные донорские клетки в периферической крови рецип...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation Method for Long-Term and Short-Term Hematopoietic Stem Cells at JoVE.com

Isolation Method for Long-Term and Short-Term Hematopoietic Stem Cells

Представлен пошаговый протокол выделения долгосрочных гемопоэтических стволовых клеток (ЛТ-ГСК) и кратковременных ГСК (СТ-ГСК) с использованием репортерной системы Hoxb5.

Метод выделения долговременных и краткосрочных гемопоэтических стволовых клеток

Self-renewal capacity and multi-lineage differentiation potential are generally regarded as the defining characteristics of hematopoietic stem cells ...

Долгосрочный и краткосрочный метод выделения гемопоэтических стволовых клеток или ГСК поможет исследователям лучше понять механизмы обновления клеток и биологические основы гетерогенности в компартменте ГСК. Был идентифицирован транскрипционный фактор Hoxb5, который может быть эксклюзивным маркером долгосрочных ГСК. На основании этого была создана линия мышей-репортеров Hoxb5, и были успешно выделены долгосрочные и краткосрочные ГСК.Чтобы начать сбор донорских клеток костного мозга, простерилизуйте ступку и пестик 70% этанолом и дайте им полностью высохнуть. Уравновесьте те, у кого есть буфер для окрашивания клеток, состоящий из добавок, содержащих PBS, не содержащих кальция и магния. Поместите кости, выделенные от донора самца мыши Hoxb5-tri-mCherry, в ступку и добавьте три миллилитра буфера для окрашивания клеток.Расчистите кости пестиком, затем разблокируйте клеточные комки с помощью осторожного пипетирования и перенесите клеточную суспензию через 100-микронное клеточное ситечко в 50-миллилитровую пробирку. Повторите процесс со свежим буфером для окрашивания клеток, пока раствор не станет прозрачным. Обычно достаточно повторить три раза, чтобы получить четкое решение.После выделения бедренных и большеберцовых костей у конгенной мыши CD45.1.2 отрежьте оба конца костей острыми стерильными ножницами. Используя иглу 23-го калибра, оснащенную пятимиллилитровым шприцем, заполненным ледяным буфером клеточной суспензии, промойте костный мозг в стерильную чашку для культивирования клеток, содержащую буфер клеточной суспензии. Дезагрегируйте клеточные скопления путем осторожного пипетирования, затем отфильтруйте клеточную суспензию через 40-микронное клеточное ситечко с помощью пипетки P1000.Для установки стробирования подготовьте образец, следуя инструкциям, приведенным в тексте, и перелейте 400 микролитров из него в пробирку из полистирола с круглым дном и защелкивающейся крышкой сетчатого фильтра с ячейками 35 микрон. Перед анализом подготовьте и добавьте в образец реагент, процеживающий мертвые клетки, следуя инструкциям производителя. Затем включите проточный цитометр и запустите программное обеспечение для анализа, следуя инструкциям производителя.Затем нажмите «Загрузить», чтобы начать получение данных. После исключения дублетов, мертвых клеток и клеток, положительных по происхождению, затворите отрицательную по происхождению, c-kit-положительную, Sca-1-положительную фракцию. Затем выйдем из Flk2-положительной дроби.Затем затворите Hoxb5-положительные или Hoxb5-отрицательные рГСК в CD150-положительную, CD34-отрицательную или низкую фракцию. Затем подготовьте 1,5-миллиметровую пробирку с низким содержанием белка с 600 микролитрами PBS без кальция и магния, дополненную 10% инактивированным теплом FBS. Чтобы выполнить Hoxb5-положительную или Hoxb5-отрицательную сортировку pHSC, установите подготовленную 1,5-миллилитровую пробирку с низким содержанием белка на сортировочное устройство для сбора и отсортируйте Hoxb5-положительный или Hoxb5-отрицательный pHSC в пробирку, используя ранее упомянутую стратегию стробирования.При первой сортировке используйте выход из режима точности сортировки. Установите 96-луночную пластину с заранее подготовленными опорными ячейками на ступень автоматизированного блока осаждения ячеек. Затем установите 1,5-миллилитровую пробирку с низким содержанием белка на загрузочное отверстие проточного цитометра.Отсортируйте Hoxb5-положительный или Hoxb5-отрицательный pHSC в 96-луночную пластину с поддерживающими ячейками, используя ранее упомянутую стратегию стробирования. Отсортируйте 10 Hoxb5-положительных или Hoxb5-отрицательных pHSC, чтобы проверить их способность к самообновлению. Графики проточной цитометрии анализа костного мозга мышей-доноров Hoxb5-tri-mCherry выявили примерно от 20 до 25% клеток во фракции pHSC, определяемой как line-negative, c-kit-положительный, Sca-1-положительный, CD150-положительный, CD34-отрицательный или низкий, Flk2-отрицательный, был Hoxb5-положительным pHSC.Здесь показаны репрезентативные графики проточной цитометрии анализа периферической крови мышей-реципиентов. Кроме того, анализ периферической крови мышей-реципиентов после первичной трансплантации показал, что, хотя Hoxb5-положительные и Hoxb5-отрицательные рГСК проявляли сходный донорский химеризм через четыре недели после трансплантации, непрерывное кроветворение наблюдалось только у Hoxb5-положительных реципиентов рГСК. Hoxb5-отрицательные ГСК начали терять способность продуцировать гемопоэтические клетки через восемь недель после трансплантации.В анализе вторичной трансплантации только Hoxb5-положительные реципиенты pHSC имели устойчивое кроветворение. Напротив, донорские клетки почти не наблюдались у мышей-реципиентов Hoxb5-отрицательного pHSC, что позволяет предположить, что Hoxb5-отрицательные pHSC потеряли способность к самообновлению в течение 16 недель после первичной трансплантации. Этот протокол обычно занимает от девяти до 12 часов, поэтому важно максимально поддерживать температуру образца при четырех градусах Цельсия на протяжении всех процедур, чтобы поддерживать жизнеспособность клеток.

Research

JoVE Journal

Biology

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Долгосрочные изображений клетках млекопитающих использованием широкого поля микроскопии

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

Выделение и трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ГСК)

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Вывод гемопоэтических стволовых клеток мышей эмбриональных стволовых клеток

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Выделение и анализ гемопоэтических стволовых клеток из плаценты

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Isolation of Early Hematopoietic Stem Cells from Murine Yolk Sac and AGM

Изоляция раннего гемопоэтических стволовых клеток мышей желточного мешка и AGM

In the mouse embryo, early hematopoiesis occurs simultaneously in multiple organs, which includes the yolk sac and aorta-gonad-mesonephros region. These ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Лентивирусов-опосредованной Нокдаун В Ex Vivo Эритропоэз прав гемопоэтических стволовых клеток

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Фенотипический анализ и выделение мышей гемопоэтических стволовых клеток и Lineage, совершенных прародителей

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Долгосрочные Смертельное испытания токсичности с ракообразных Артемия franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells (SSCs) in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells SSCs in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Серийный обогащению сперматогониальные стволовых и клеток-предшественников (SSC) в культуре Вывод Долгосрочные взрослых мышей линии Юг-Юг

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly ...