Name: determination of s-phase duration using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation in saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2022-10-21T13:30:00
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Die Autoren danken der Agence Nationale de la Recherche (ANR) und der Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC) für die PhD-Stipendien an J.d.D.B.T. und der Agence Nationale pour la Recherche (ANR) für die finanzielle Unterstützung (Stipendium ANR-18-CE12-0018-01). Zytometrie und Mikroskopie wurden in der Montpellier MRI BioCampus Bildgebungsanlage durchgeführt.

1. Zellkultur von S. cerevisiae
HINWEIS: Die verwendeten Hefestämme sind in Tabelle 1 aufgeführt.
HINWEIS: Die S-Phasendauer kann auf verschiedene Arten überwacht werden. Je nach Fragestellung können die Zellen nach demG1-Arrest asynchron oder synchron gezüchtet werden.
<ol><li>Aus asynchron wachsenden S. cerevisiae-Zellen HINWEIS: Diese Methode ermöglicht die Bestimmung des Prozentsatzes der ...

<ol>
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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORC-dependent+and+origin-specific+initiation+of+DNA+replication+at+defined+foci+in+isolated+yeast+nuclei.">ORC-dependent and origin-specific initiation of DNA replication at defined foci in isolated yeast nuclei.</a> Genes &amp; Development. 11 (12), 1504-1518 (1997).</li><li>Lengronne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+S+phase+progression+globally+and+locally+using+BrdU+incorporation+in+TK++yeast+strains.">Monitoring S phase progression globally and locally using BrdU incorporation in TK+ yeast strains.</a> Nucleic Acids Research. 29 (7), 1433-1442 (2001).</li><li>Magiera, M. 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Hefe ist ein erstklassiger Modellorganismus für Zellzyklusstudien, aber die Charakterisierung seiner S-Phase wurde lange Zeit durch seine Unfähigkeit behindert, exogene Nukleoside wie BrdU aufzunehmen, die als Tracer der DNA-Replikation verwendet werden. Die Ausstattung der Hefe mit einer hohen Expression von Herpes-simplex-Thymidinkinase (TK) und die Zugabe eines humanen Nukleosidtransporters (hENT) hat dieses Problem weitgehend gelöst15,16. EdU ist vielseiti...

Die Genomstabilität durch mitotische Teilung wird durch die Übertragung eines vollständigen und gleichen Chromosomensatzes auf die beiden produzierten Zellnachkommen gewährleistet. Dies beruht auf der genauen Fertigstellung einer Reihe von Ereignissen, die in einer bestimmten Zeit in jeder Phase des Zellzyklus auftreten. In G 1 werden die Replikationsursprünge nach der Rekrutierung mehrerer Lizenzfaktoren, einschließlich Cdc61, lizenziert. In der S-Phase wird die Duplikation des gesamten Genoms von mehreren aktiven Replikationsursprüngen initiiert und von Replikationsmaschinen durchgeführt, die sich in mikroskopisch sichtbaren Herden sammeln, die als Replikationsfabrikenbezeichnet werden 2. In der M-Phase werden duplizierte Schwesterchromatiden an der mitotischen Spindel befestigt und biorientiert, um ihre Segregation zu den entgegengesetzten Polen der mitotischen Zelle3 zu ermöglichen. Die Regulierung, der ordnungsgemäße Abschluss und die Dauer jeder Phase sind der Schlüssel zur Gewährleistung der Genomstabilität. Tatsächlich führt ein vorzeitiger Ausstieg aus einer dieser Phasen zu einer Instabilität des Genoms. Zum Beispiel wird ein kürzeres G1, das durch Deletion des knospenden Hefe-CDK-Inhibitors Sic1 oder durch die Überexpression vonG1-Cyclinen induziert wird, die nachfolgende S-Phase 4,5,6 verändern. Folglich führen diese Deregulierungen, die mit Replikationsstress verbunden sind oder nicht, zu Chromosomenbrüchen, Umlagerungen und Fehltrennungen 4,5,6. Daher kann die Überwachung der Dauer der S-Phase und allgemeiner der Dauer der anderen Phasen des Zellzyklus entscheidend sein, um die Defekte zu identifizieren, die in verschiedenen Mutanten und unter verschiedenen Stressbedingungen auftreten.
Eine traditionelle Methode zur Messung der Zellzyklusphasendauer umfasst die einfache DNA-Inhaltsdurchflusszytometrie (Abbildung 1A) und basiert auf einem geeigneten Algorithmus (verfügbar in den meisten Zytometrie-Software), der verwendet wird, um die Population in G1, S und G2 + M-Phasenfraktionen von den 1C- und 2C-Peaks zu trennen. Die Brüche werden dann mit der Populationsverdopplungszeit7 multipliziert. Diese Methode liefert jedoch nur geschätzte Werte, erfordert eine homogene Zellgrößenverteilung innerhalb eines gegebenen Bruchteils und ist nicht auf synchronisierte Kulturen anwendbar. Um die S-Phasendauer in Säugetierzellen zu untersuchen, wurden mehrere Thymidinanaloga entwickelt und weit verbreitet, einschließlich EdU. Ihre Aufnahme aus dem extrazellulären Medium und die Phosphorylierung durch Thymidinkinase (im Folgenden als TK bezeichnet) machen sie für DNA-Polymerasen verfügbar, um sie an Orten der DNA-Synthese (Replikation, Rekombination, Reparatur) einzubauen. Um das Fehlen des TK-Gens in Saccharomyces cerevisiae-Zellen zu umgehen, wurden Hefestämme so entwickelt, dass sie eine stabile und konstitutive Expression des Herpes-simplex-Virus TK8 und des humanen equilibrativen Nukleosidtransporters (hENT1)9 ermöglichen. Einmal in die DNA eingebaut, wird EdU durch die selektive Click-Reaktion nachgewiesen, die seinen Alkinanteil chemisch an azidmodifizierte Fluorochrome10 koppelt.
Dieser Artikel bietet zwei optimierte umfassende Protokolle zur Pulsmarkierung asynchroner und synchroner TK-hENT1-Zellen mit EdU, um die Dauer und Dynamik der DNA-Replikation sowie die Dauer der anderen Phasen des Zellzyklus mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung sowohl auf Einzelzell- als auch auf Populationsebene durch Mikroskopie und Durchflusszytometrie präzise zu visualisieren und zu messen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#945;-factor&#160;</td>
			<td>Genescript</td>
			<td>RP01002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>04-100--812-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-sulfo-Cyanine5 azide (Cy5 azide)</td>
			<td>Interchim</td>
			<td>FP-JV6320</td>
			<td>Alternative to Alexa647-Azide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dy-530 azide</td>
			<td>Dyomics</td>
			<td>&#160;530-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdU (5-ethynyl-2&#8217;-deoxyuridine)</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>NE08701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Carlo Erba reagents</td>
			<td>P013A10D16</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L- ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>R5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sytox Green</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S-7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>OLS</td>
			<td>CASY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>NovoSampler Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Infors</td>
			<td>444-4230</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking water bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>SW22</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Sonics</td>
			<td>Vibra cell</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-field microscopy</td>
			<td>Leica</td>
			<td>THUNDER Imager</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of s-phase duration using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation in saccharomyces cerevisiae

Die eukaryotische DNA-Replikation ist ein stark regulierter Prozess, der sicherstellt, dass der genetische Bauplan einer Zelle vor der Chromosomentrennung korrekt dupliziert wird. Da DNA-Synthesedefekte Chromosomenumlagerungen zugrunde liegen, ist die Überwachung der DNA-Replikation unerlässlich geworden, um die Grundlagen der Genominstabilität zu verstehen. Saccharomyces cerevisiae ist ein klassisches Modell zur Untersuchung der Zellzyklusregulation, aber wichtige DNA-Replikationsparameter, wie der Anteil der Zellen in der S-Phase oder die S-Phasendauer, sind immer noch schwer zu bestimmen. Dieses Protokoll verwendet kurze und ungiftige Impulse von 5-Ethynyl-2'-Desoxyuridin (EdU), einem Thymidinanalogon, in technisch hergestellten TK-hENT1-Hefezellen, gefolgt von seiner Detektion durch Click-Reaktion, um die Visualisierung und Quantifizierung der DNA-Replikation mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung sowohl auf Einzelzell- als auch auf Populationsebene durch Mikroskopie und Durchflusszytometrie zu ermöglichen. Diese Methode kann zuvor übersehene Defekte in der S-Phase und im Zellzyklusverlauf von Hefemutanten identifizieren und so die Charakterisierung neuer Akteure ermöglichen, die für die Gewährleistung der Genomstabilität unerlässlich sind.

Zur Bestimmung der S-Phasendauer und allgemeiner der Dauer vonG1 undG2+M (Protokollschritt 1.1) wurden S. cerevisiae W303 Wildtypzellen (WT, Tabelle 1) asynchron in SC-Medium für 7 h gezüchtet. Stündlich wurde die Zellkonzentration überwacht, um die Verdopplungszeit zu bestimmen (Abbildung 2B). Unter diesen Wachstumsbedingungen betrug die berechnete Verdopplungszeit 120 min ± 13 min bei 25 °C (Tabelle 2). Wenn sich die Ze...

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Determination of S-Phase Duration Using 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Incorporation in Saccharomyces cerevisiae

Wir beschreiben zwei komplementäre Protokolle zur genauen Bestimmung der S-Phasendauer in S. cerevisiae unter Verwendung von EdU, einem Thymidinanalogon, das in vivo eingebaut und mittels Click-Chemie durch Mikroskopie und Durchflusszytometrie nachgewiesen wird. Es ermöglicht die einfache Charakterisierung der Dauer der DNA-Replikation und übersehener Replikationsdefekte in Mutanten.

Bestimmung der S-Phasendauer mittels 5-Ethynyl-2'-Desoxyuridin-Einbau in Saccharomyces cerevisiae

Eukaryotic DNA replication is a highly regulated process that ensures that the genetic blueprint of a cell is correctly duplicated prior to chromosome ...

Dieses Protokoll ermöglicht eine präzise Bestimmung der S-Phasendauer in synchronisierten Knospungshefezellen. Es ist eine schnelle, einfache und reproduzierbare Methode. Darüber hinaus ist es empfindlich genug, um leichte Synthesedefekte zu erkennen, die von klassischen Protokollen nicht erkannt werden.Diese Methode wird für viele Forscher nützlich sein, die an der Regulation des Zellzyklus in knospenden Hefen arbeiten. Dieses Protokoll wird von Nicolas Talarek, einem leitenden Forscher, und Juan De Dios Barba Tena, einem Doktoranden im Labor, demonstriert. Impfen Sie Saccharomyces cerevisiae-Zellen in 10 Milliliter SC-Medium bei niedriger Zellkonzentration für eine Nachtkultur bei 30 Grad Celsius mit orbitaler Bewegung bei 130 Umdrehungen pro Minute.Am nächsten Tag verdünnen Sie die Zellen in 20 Milliliter frischem SC-Medium in einer Endkonzentration von zwei- bis dreimal 10 auf die sechs Zellen pro Milliliter. Bei 40 Mikrolitern von einem Milligramm pro Milliliter Alpha-Faktor in Wasser verdünnt. Dann kultivieren Sie die Zellen bei 30 Grad Celsius, mit orbitaler Bewegung bei 130 Umdrehungen pro Minute für eine Stunde.Wiederholen Sie diesen Schritt einmal. Visualisieren Sie die Zellen unter einem Lichtmikroskop, um den G1-Arrest zu überwachen. Fahren Sie fort, wenn mehr als 90 % der Zellen einen Shmoo aufweisen und die anderen gerundeten, nicht abgerundeten Zellen sind.Zentrifugieren Sie die Proben drei Minuten lang bei 1.500 G.Dann verwerfen Sie den Überstand mit der Vakuumpipette und resuspendieren Sie die Zellen in 20 Milliliter SC-Medium. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal. Sammeln Sie zweimal alle fünf Minuten einen Milliliter Zellen und fahren Sie mit der EDU-Markierung fort.Fügen Sie 30 Minuten nach der Freisetzung 400 Mikroliter des Alpha-Faktors hinzu. Einen Milliliter der Zellkultur wird in ein Zwei-Milliliter-Mikrofugenröhrchen überführt, das einen Mikroliter 10 Millimolar EDU enthält, gut gemischt durch Inversion. Um die EDU-positiven Zellen von den EDU-negativen Zellen anhand einer bivarianten Pi-EDU-Tatsache zu unterscheiden, wird ein weiterer Milliliter Zellkultur in ein Zwei-Milliliter-Mikrofugenröhrchen übertragen, das einen Mikroliter DMSO enthält.Drei bis fünf Minuten bei 30 Grad Celsius unter Rühren in einem schüttelnden Wasserbad inkubieren. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 100 Mikroliter 100% Ethanol hinzufügen. Pelletieren Sie die Zellen für zwei Minuten bei 10.000 G in einer Mikrofuge.Entfernen Sie den Überstand mit einer Vakuumpipette. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 500 Mikroliter 70% Ethanol und mischen Sie es gut durch Wirbeln. Lassen Sie die Proben mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur bei 20 Neigungen pro Minute auf einer Wippe mit variabler Geschwindigkeit, um die Zellen zu permeablizieren.Pelletieren Sie die Zellen für zwei Minuten bei 10.000 G in einer Mikrozentrifuge und entsorgen Sie den Überstand mit einer Vakuumpipette. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 500 Mikrolitern 10% Ethanol und PBS. Pelletieren Sie die Zellen für zwei Minuten bei 10.000 G in einer Mikrofuge und entsorgen Sie den Überstand mit einer Vakuumpipette.Resuspendieren Sie das Pellet in 200 Mikrolitern PBS, das RNase A und Proteinase K enthält.Inkubieren Sie ein bis zwei Stunden bei 50 Grad Celsius mit gelegentlichem Schütteln oder über Nacht bei 37 Grad Celsius. Pelletieren Sie die Zellen für zwei Minuten bei 10.000 G in einer Mikrozentrifuge und verwerfen Sie den Überstand mit einer Vakuumpipette. Waschen Sie die Zellen mit 500 Mikrolitern PBS.Dann pelletieren Sie die Zellen und verwerfen Sie den Überstand, wie zuvor gezeigt. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 200 Mikroliter PBS mit 1% BSA. 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.Dann pelletieren Sie die Zellen, verwerfen Sie den Überstand, wie zuvor gezeigt, und resuspendieren Sie das Pellet in 300 Mikroliter PBS mit 1% BSA. Verteilen Sie die Zellen auf zwei 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Die erste sollte aus 200 Mikrolitern Zellkultur für die Click-Reaktion bestehen, und die zweite Röhre sollte 100 Mikroliter Zellkultur für die sytoxgrüne Färbung enthalten.Dann pelletieren Sie die Zellen und verwerfen Sie den Überstand, wie zuvor gezeigt. Für die sytoxgrüne Färbung resuspendieren Sie das Zellpellet in 100 Mikroliter PBS. Dann werden je nach Zellkonzentration 10 bis 30 Mikroliter in ein Durchflusszytometerröhrchen mit 300 Mikrolitern Sytox-Grünmischung überführt.Die Proben zweimal für zwei Sekunden bei einer Amplitude von 40 bis 50% beschallenLassen Sie sie im Dunkeln, bis die Proben auf einem Durchflusszytometer verarbeitet werden. Für die Click-Reaktion resuspendieren Sie das Zellpellet mit 40 Mikrolitern frisch zubereitetem Azid-Farbstoffpuffer. Bei Raumtemperatur im Dunkeln 60 Minuten inkubieren.Pelletieren Sie die Zellen und verwerfen Sie den Überstand, wie zuvor gezeigt. Dann waschen Sie die Zellen dreimal mit 300 Mikrolitern 10% Ethanol in PBS. Als nächstes resuspendieren Sie die Zellen in 100 Mikrolitern von 50 Mikrogramm pro Milliliter Propidiumiodid in PBS und lassen Sie sie für 10 Minuten im Dunkeln.Je nach Zellkonzentration werden 10 bis 30 Mikroliter der Zellsuspension in ein Durchflusszytometerröhrchen überführt, das 300 Mikroliter 50 Millimolar Tris HCl, pH 7,5 enthält. Schneiden Sie zweimal für zwei Sekunden bei einer Amplitude von 40 bis 50. Lassen Sie die Proben im Dunkeln, bis sie auf einem Zytometer verarbeitet werden.Lesen Sie die sytoxgrünen Proben mit einem blauen Anregungslaser bei 488 Nanometern und einem 530 x 30 Bandpassfilter. Lesen Sie die Bavaria Pi EDU-Beispiele in einem Punktdiagramm mit einem blauen Anregungslaser bei 488 Nanometern und einem 615 x 20-Bandpassfilter für die Pi-X-Achse und einem roten Anregungslaser bei 640 Nanometern, einem 660 x 20-Bandpassfilter für die Y-Achse. Drei Zellpopulationen wurden in der bivarianten EDU-Pi-Zytometer-Analyse beobachtet.Bei 25 Grad Celsius befanden sich etwa 27% der Zellpopulation in der G1-Phase, 29% in der S-Phase und etwa 44% in der G2 plus M-Phase. In synchronisierten Zellen kann die Dauer der S-Phase etwa 25 Minuten betragen, basierend auf der Zeit, in der sich der DNA-Gehalt auf dem Sytox-Green-Flow-Zytometer-Profil von einem C auf zwei C geändert hat. Die EDU-Pulsmarkierung bestimmte genau die S-Phasendauer.15 Minuten nach der Freisetzung wurde ein Bruchteil der EDU-positiven Zellen nachgewiesen, was auf den Beginn der S-Phase hinweist. Der Verlauf durch die S-Phase wurde durch die Zellwolke gesehen, die sich im Bavaria Pi EDU-Diagramm nach oben und rechts bewegte. Schließlich, 35 Minuten nach der Freisetzung, war ein Bruchteil der Zellen EDU-negativ, aber mit der doppelten Menge an DNA, was darauf hindeutet, dass die S-Phase endete und die Zellen in der G2 plus M-Phase waren.Trotz der beobachteten hohen Synchronität beendeten einige Zellen die S-Phase 60 Minuten nach der Freisetzung und die S-Phase war für die gesamte Population etwa 65 Minuten nach der Freisetzung abgeschlossen. Es ist entscheidend, eine perfekte Synchronisation zu haben und zu verhindern, dass Zellen in die zweite S-Phase eintreten. Zellen können mit einem Mikroskop abgebildet werden, wo die Vorausschau der Kern-DNA-Replikation überwacht und quantifiziert werden kann.Diese Technik wird helfen, Übersehene Mutanten zu identifizieren, die leichte S-Phasendefekte sowie Zellzyklusdauerdefekte aufweisen.

Research

JoVE Journal

Biology

Determination of S-Phase Duration Using 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Incorporation in Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

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Präparation Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Forschung

Biologie

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Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Schnelle Identifikation von chemischen Genetische Interaktionen in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Growth-basierte Bestimmung und biochemische Bestätigung der genetischen Voraussetzungen für Proteinabbau in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...